專利名稱：疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及核酸構建體、含有這種構建體的宿主細胞以及它們在 核酸疫苗中的應用。本發明進一步涉及含有這種構建體的疫苗制劑以 及這種制劑在藥物中的應用。本發明特別涉及用于HIV感染的預防和 治療的DNA疫苗，更特別的是以顆粒介導的釋放方式施用疫苗。
背景技術：
HIV-1是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的主要原因，這種疾病 被認為是全球主要的健康問題之一。盡管全世界為了生產相關疫苗進 行了廣泛的研究，但是迄今為止這些努力尚未獲得成功。已經描述了 HIV-1的非包膜蛋白，包括例如內部結構蛋白，如gag 和pol基因的產物，及其它非結構蛋白如Rev、 Nef、 Vif和Tat ( Green 等，New England J. Med, 324, 5， 308以及下列等等(1991 )和Bryant 等，(Pizzo編輯),Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 3卯以及下列等 等(1992 )。Gag基因的全長RNA翻譯產生多蛋白前體，隨后該前體被酶切成 為3-5個衣殼蛋白；基質蛋白、衣殼蛋白和核酸結合蛋白以及蛋白酶 (1. Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM和Howley M 1996; 2. Fields Virology, vol 2 1996)。所述gag基因產生55-千道爾頓(kD)的Gag前體蛋白，也稱為 p55,它是從未剪接的病毒mRNA表達產生的。在翻譯過程中，p55 的N末端被十四酰化，使其與細胞膜的胞質相締合。膜締合的Gag多 蛋白使兩個拷貝的病毒基因組RNA連同其它病毒和細胞蛋白聚集而 引起病毒顆粒在感染細胞的表面產生芽接。芽接后，在病毒成熟過程 中p55被病毒編碼的蛋白酶(pol基因的產物)酶切成為被稱做MA(基質[pl7]) 、 CA (衣殼[p24]) 、 NC (核殼[p9])和p6. (4)的四個較 小蛋白質。除了 3個主要的Gag蛋白之外，所有的Gag前體含有一些其它的 區域，它們被酶切成各種大小的肽，保留于病毒粒子中。這些蛋白質 具有不同的作用，例如p2蛋白被認為在調節蛋白酶的活性方面具有作 用，并有助于校正蛋白水解過程的時間。MA多蛋白衍生自p55的十四酰化N末端。大多數MA分子保持 與病毒粒子的脂雙分子層的內表面連接，以穩定病毒顆粒。在病毒粒 子較深層的內部聚集其它的MA,而成為攜帶病毒DNA進入細胞核的 復合體的一部分。(5)這些MA分子促進病毒基因組的核轉移，因 為MA上的親核信號可被細胞核輸入系統所識別。這種情況使HIV可 以感染未分裂的細胞，這是反轉錄病毒的一個不尋常的特性。p24(CA)蛋白形成病毒顆粒的錐形核。已證實親環蛋白A與p55 的p24區域相互作用，而摻合到HIV顆粒中。因為環孢菌素可以阻止 這種相互作用而抑制病毒的復制，所以Gag和親環蛋白A之間的相互 作用是必需的。Gag的NC區域負責特異性識別所謂的HIV包裝信號。所述包裝 信號由位于病毒RNA的5，末端附近的4個莖環結構組成，足以介導 異源RNA整合到HIV-1病毒粒子中。NC通過由兩個鋅指基序介導的 相互作用而與包裝信號相結合。NC還促進逆轉錄進行。p6多肽區域介導了 p55Gag和輔助蛋白Vpr之間的相互作用，使 Vpr整合到組裝好的病毒粒子中。p6區域還含有一個所謂的晚期結構 域，這是芽接病毒粒子從感染細胞有效釋放所需要的。Pol基因編碼包含病毒早期感染時所需要的具有各別活性的兩種 蛋白質，即將病毒DNA整合進入細胞DNA所需的RT和整合酶蛋白。 Pol的最初產物被病毒粒子蛋白酶切割，產生含有DNA合成所必需的 活性(RNA和DNA定向的DNA聚合酶，核酶H )的氨基端RT肽以 及羧基端整合酶蛋白。HIV RT是全長RT ( p66 )和缺乏羧基末端的RNA酶整合酶結構 域的酶切產物(p51)的異源二聚體。RT是反轉錄酶病毒基因組所編碼的保守性最高的蛋白質之一。RT的兩個主要活性是DNA Pol和核酶H。 RT的DNA Pol活性可交替使 用RNA和DNA為模板，并且如所有已知的DNA聚合酶一樣，不能 起始DNA的從頭合成，而需要一個預先存在的分子作為引物(RNA)。當DNA合成發生時，在所有的RT蛋白中所固有的RNA酶H的 活性在除去RNA基因組復制早期中起著重要作用。它選擇性地從所 有RNA-DNA雜合分子中降解RNA。聚合酶和核酶H在結構上是分 離的、具有非重疊結構域，其中Pol覆蓋了 Pol的三分之二的氨基。p66催化亞基折疊成5個不同的亞結構域。這些亞結構域的氨基 末端23包含具有RT活性的部分，羧基末端是RNA酶H結構域。感染宿主細胞后，逆轉錄病毒RNA基因組通過感染顆粒中的反轉 錄酶而被復制成線性雙鏈DNA。整合酶(參見Skalka AM ，99 Adv in Virus Res 52 271-273 )識別和修飾病毒DNA的末端，并伴隨病毒DNA 進入宿主染色體位點以進行催化整合。宿主DNA中有許多位點可成 為整合的耙標位點。盡管整合酶在體外足以催化整合，但在體內它不 是唯一與病毒DNA結合的蛋白質，從感染的細胞中分離的大蛋白-病 毒DNA復合體被稱為預整合復合體。這促進子代病毒基因組獲得宿 主細胞的基因。整合酶由3個不同的結構域組成，即N末端結構域、催化核心和 C末端結構域。催化核心結構域中包含了多核苷酸轉移化學反應的所 有要素。已知Nef蛋白可引起CD4、 HIV受體從細胞表面的去除，但對于 這種功能的生物學重要性還存在爭議。此外，Nef與T細胞的信號途 徑相互作用并誘導成激活狀態，這反過來可促進更有效的基因表達。 一些HIV分離物在該區域存在突變，導致不編碼有功能的蛋白而嚴重 影響它們在體內的復制和致病過程。DNA疫苗通常包括插入了強啟動子的細菌質粒載體和感興趣的 基因所組成，所述基因編碼抗原肽和聚腺苷酸化/轉錄終止序列。感興 趣的基因可編碼全蛋白或僅編碼與想要預防的病原體、肺瘤或其它病 因有關的抗原肽序列。在施用給宿主之前，質粒可在細菌例如大腸桿 菌中生長，然后分離并在適當介質中制備質粒，所用介質取決于施用 途徑。施用后，質粒為宿主細胞所攝取，并在其中產生編碼的肽。為6了防止質粒在哺乳動物宿主中復制和在有關動物中對染色體DNA的 整合，優選地，質粒載體被制備成不具有在真核細胞中發揮功能的復 制起點。相對于傳統的疫苗接種技術，DNA疫苗接種具有許多優越性。首 先，由于DNA序列編碼的蛋白質在宿主中合成，可預測蛋白質的結 構和構象將與疾病有關的天然蛋白質相似。通過產生可以識別保守蛋 白質的抗原決定簇的細胞毒素T淋巴細胞反應，DNA疫苗接種還可能 抵抗不同病毒抹系。而且，由于質粒為宿主細胞所攝取并在其中生產 抗原蛋白，可激發長期的免疫反應。DNA疫苗接種還可結合各種不同 的免疫原而可能制成單一制劑，因而促進對許多種疾病的同時免疫。有關DNA疫苗接種的有用的背景資料描述于Donnelly等"DNA vaccines" Ann. Rev Immunol. 1997 15: 617-648，本文引用該文公開的 全部內容作為參考。發明內容本發明提供用于預防和治療HIV感染和AIDS的核酸疫苗的新構 建體。相應地，作為第一個方面，本發明提供了一種核酸分子，其含有 編碼HIV gag蛋白或其片段的核苷酸序列和與其連接的編碼了其它 HIV抗原或其片段的核苦酸序列，這些核苷酸序列與異源啟動子可操 作地連接。所述核苷酸序列的片段編碼HIV表位，并典型地編碼至少 8個氨基酸的肽。核苷酸序列優選地是DNA序列，并優選地包含于沒 有復制起始的質粒中。這種核酸分子與藥用的賦形劑、載體、稀釋劑 或佐劑 一起配制，生產適合于治療和/或預防HIV感染和AIDS的藥物 組合物。在一個優選的實施方案中，DNA序列:故配制在適合于以顆粒作為 介質傳遞藥物的惰性顆粒(particle)或小珠(bead)的表面。優選地，小珠 是金的。在本發明一個優選的實施方案中，提供含有gag蛋白高度表達的 密碼的DNA序列，所述序列已被優化成與哺乳動物細胞中基因所使 用的密碼子相似。具體地說，所述gag蛋白凈皮優化成類似于高度表達7的人類基因。DNA密碼分別由4個字母(A、 T、 C和G)表示，并使用它們拼 寫成代表生物體基因編碼蛋白質的氨基酸的三個字母所表示的"密碼 子"。沿著DNA分子的順序排列的密碼子被翻譯成由那些基因編碼 的蛋白質中氨基酸的序列。密碼子具有高度簡并性，其中61個密碼子 編碼20個常見氨基酸(即蛋白質氨基酸)和3個密碼子代表"終止"信 號。因此，大多數氨基酸由不止一個密碼子所編碼一事實上，有些氨 基酸是由四個或更多不同的密碼子所編碼。不止一個密碼子編碼了同一個特定的氨基酸，人們已觀察到生物 體中密碼子的使用模式是高度不隨機的。不同物種，在密碼子選擇上 顯示了不同的偏好性，而且在同一物種中，在以高水平和低水平表達 的基因之間的密碼子使用模式可以非常不同。這種偏好性在病毒、植 物、細菌和哺乳動物細胞中是不同的，并且某些物種比其他物種顯示 出更高的非隨機密碼子選擇的偏好性。例如，人和其他哺乳動物比某 些細菌或病毒的偏好性要弱。由于這些原因，在大腸桿菌中表達哺乳 動物基因或在哺乳動物細胞中表達外源或重組基因時，對于有效表達 而言密碼子分布是非常有可能不適當。在異源DNA序列中存在的密 碼子簇或者豐富的密碼子在將要用于表達的宿主中很少觀察到，則往 往預示著在該宿主中對該異源基因的表達水平將很低。在本發明的一個實施方案中，提供了一個編碼氨基酸序列的gag 多核普酸序列，其中多核苷酸序列的密碼子使用模式與高度表達的哺 乳動物基因的密碼子使用模式相似。優選地，多核苷酸序列是DNA 序列。理想地，多核苷酸序列的密碼子使用模式是典型的高度表達的 人類基因。在本發明的多核苷酸中，密碼子使用模式從人免疫缺陷病毒的密 碼子典型模式改變為更接近粑標生物體的密碼偏好性的使用模式，例 如哺乳動物，特別是人。"密碼子使用系數(codon usage coefficient)" 衡量給定的多核苷酸序列的密碼子模式與靶標物種的密碼子模式相似 的程度。許多物種的高度表達基因的密碼子出現頻率可從已有文獻資 料中獲得(參見，例如，Nakamura等，Nucleic Acids Rearch 1996, 24: 214-215)。將61個密碼子中每一個密碼子的出現頻率(用所選擇基因類別中每1000個密碼子中出現的數量來表示)對20個常見氨基酸 中每一個進行標準化，將每一個氨基酸最頻繁使用的密碼子的值設定 為1,使用較少的密碼子的頻率范圍將在0和1之間。這樣，對于靶 標物種的高度表達基因，61個中的每一個密碼子被確定為值1或更低。 為了計算某一特定多核苷酸的密碼子相對于該物種的高度表達基因的 使用系數，記錄該特定多核苷酸的各個密碼子的測量值，并且計算出 所有這些值的幾何平均值(這些值的自然對數之和除以密碼子的總數， 并取反對數)。該系數的值在0和1之間，并且密碼子的系數越高， 多核普酸中對該密碼子的使用更為頻繁。如果多核苷酸序列的某一密 碼子使用系數為1,對于靶標物種的高度表達基因而言，所有密碼子 均為"最頻繁出現"的密碼子。依據本發明，多核苷酸的密碼子利用模式優先地排除在靶標生物 體的高度表達基因中RSCU值小于0.2的密碼子。可選地，該密碼子 利用模式排除編碼特定氨基酸少于10%的密碼子。如果所述氨基酸的 所有密碼子利用頻率相同，那么相對同義密碼子利用率(RSCU)值 是密碼子的觀測數量除以預測數量。對于高度表達的人類基因，本發 明的多核苷酸一般具有大于0.3,優選大于0.4,最優選大于0.5的密 碼子使用系數(或RSCU)。人的密碼子利用率表還可在Genebank中 查到。經比較，高度表達的(3肌動蛋白基因的RSCU值為0.747。人(homo sapiens)的密碼子利用率表如下 密碼子利用率表1:人(homo sapiens) [gbpri]: 27143 CDS，s ( 12816923個密碼子) 范圍(fields):[三聯體][頻率每1000個]([數量])UUU 17,0(217684) UCU 14.8(189419)UUC 20.5(262753) UCC 17.5(224470)UUA7,3( 93S24) UCA 11.3(152074)UUG 12.5(ISSSll) UCG 4.5( 57572)CUU 12,8(163707) CCU 17.3(222146)CUC 19.3(247391) CCC 20.0(256235)CUA7.0( 83078) CCA 16.7(214583)CUG 39.7(509036) CCG 7.0( 83613)AUU 15.8(202844) ACU 12,9(165392)AUC 21.6(277066) ACC 19.3(247805)AUA7.2( 32133) ACA 14-S (1315:18〉AUG 22.3(285776) ACG 6,3( B0353)UAU 12,1(155645)UAC 15 .8 (202481)UAA 0,7 ( S1S5)UAG 0,5( 6789)CAU 10.5(134186)CAC 14.9 (190928)CAA 12.0(153590)CAG 34-5 ("1727)AAU 17.0 (218508)AAC 13,8 (2.53475)AAA 24,0(308123)AAG 32 ,6 (4:18141)UGU 10,0(127719)UGC 12.3 (157257)UGA 1-3< 16025)U 3 12.3(165330)CGU 4.6( 59454) CGC 10.8(137865) CGA 6.3( 80709) CGG 11.6 (148666)AGU 12,0(154442) AGC 19-3 (247583) AGA 11,5(147264) AGO 11.3(145276)Thr ACG 405,00 8.40 0,1510GUU 10.9(139611) GCU IB.5 (236639) GAU 22.4(2BS742) GGU 10.8 (13BS0S)GUC 14.6(187333) GCC 28,3(362086) GAC 26.1(334158) GGC 22.7(230304)GUA 7.0( 896") GCA 15.9 (203310) GAA 29.1 (373151) GGA 16.4(210643)C3UQ 28.8 (363006) GCC37.5( 96455) GAG 40 .2 (515485) QGG 16.4 (20S907)編碼GC 52.51%第一個字母GC 56.04%第二個字母GC 42.35% 第三個字母GC 59.13%。密碼子利用率表2 (優選的)人(高度表達的)基因1/24/91的密碼子利用率(human-high.cod) 氨基酸密碼子 數量 /1000 分數(fraction)Glu Glu Asp AspVal Val Val ValGAG GAA GAT GACGTG OTA GTT GTC905.00 525.00 441.00 1867.002420.00 792.00 532.001821.001866， 00 134 .00 1S8.00 728.0018,76 10.88 9.14 38.7050,16 16.42 12,27 37,7538*58 2，78 4.1015,090 ,24 0.14 0,12 0,500.75 0*25 0,25 0.750,64 0*05 0.07 0,25652，00 488,00 654.00 2057,0013*51 10，12 13，56 42 ，640.17 0.13 0,17 0.53512.00 298,00 354.00 1171.006.18 7.34 24 .270.18 0.10 0,10 0>342117,00 471.00 314,001120.0043 ,88 3.76 6.5123,220.82 0*18 0,22 0,781077-00 88,00 315.00 1369,0022 .32 1.82 6.5328 .381,00 0,05 0.18 0*77AAG AAA AAT AACAsnG A T cG G G GG G G G1111G G G GG A T cc c c cG G G G1111A A A AG A T cG G G GA A A A3 <a r rr r e eG A T cT T T TA A A At e e eo> 1 1 1M I I Is s nL L ASer TCG 325.00 6,74 0.09Ser TCA 165,00 3,42 0.05Ser TCT 450.00 9.33 0.13Ser TCC 958.00 19.86 0.28Arg CGG 611.00 12.67 0.21Ai:g CGA 183.00 3.79 0.06Arg CGT 210.00 4.35 0.07Arg CGC 1086.00 22.51 0.37LeuCTG288U059*780.5BLeuCTA166,003 .440,03LieuCTT238-004.930,05UeuCTC127S*002S，450.2SProCCG482.009.990，17ProCCA456.009.450，16ProCCT568，0011.770，19ProC CC1410.0029,230，48本發明的另一個方面提供了一種表達載體，含有并能夠調控本發明第一個方面所述多核苷酸序列的表達，特別是gag多核苷酸序列的 密碼子使用模式是典型的高度表達的哺乳動物基因，優選地是高度表 達的人類基因。所述載體可適合于在細菌、昆蟲或哺乳動物細胞、特 別是人細胞中的表達異源DNA。在一個實施方案中，所述表達載體是 p7313 (見圖1 )。373.00 7.73 0.14358.00 7.42 0.141502，00 31-13 0.57Trp TGG 652.00 13.51 1.00End TGA 109.00 2.26 0.55Cys TGT 325.00 6,74 0.32Cys TGC 705,00 14.53 0，68End TAG 42.00 0.87 0.21End TAA 46.00 0.95 0.23Tyr TAT 360.00 7,46 0.2STyr TAC 1042.00 21,60 0.74TTG 313,00 6.49 0,06TTA 76.00 1.58 0.02TTT 336,00 6.9S 0.20TTC 1377.00 28.54 0.80CAG 2020.00 41.87 0.88CAA 283,00 5』7 0*12CAT 234.00 4,85 0.21CAC 870.00 18.03 0*79A T cCCCAAAh h hTTTu u s se e h hL T=I p pn n s s11 i iG G H H在第三個實施方案中，提供了與編碼NEF及其片段、或HIV反轉 錄酶(RT)或其片段的DNA序列融合的異源啟動子控制下的gag基 因。所述基因的gag部分可以在融合體的N或C端部分。在一個優選的實施方案中，gag基因不編碼gag p6肽。優選地， NEF基因是截短的即除去了編碼N末端區域的序列，也即除去30-85, 優選地60-85,典型的約81,優選地N末端的65個氨基酸。在另 一個實施例中，RT基因也被優化成與高度表達的人類基因相 似。所述RT優選地編碼一個突變以基本上失活了任何反轉錄酶的活 性。 一個優選的失活突變包括用W色氨酸229代替K (賴氨酸)。根據本發明的另 一 個方面，宿主細胞含有本發明所述的多核苷酸 序列，或者本發明所提供的表達載體。所述宿主細胞可以是細菌，例 如大腸桿菌；哺乳動物，例如人；或者是昆蟲細胞。含有本發明提供 的載體的哺乳動物細胞可以是培養細胞，可體外轉染，或者可通過給 予哺乳動物載體而發生體內轉染。本發明進一 步提供了含有本發明的多核苷酸序列的藥物組合物。 優選地，所述組合物含有DNA載體。在優選的實施方案中，所述組 合物含有大量顆粒，優選地是金顆粒，為含有編碼本發明的多核苷酸 序列的載體的DNA所包被。優選地，編碼HIV gag氨基酸序列的多 核香酸序列的密碼使用模式是典型的高度表達的哺乳動物基因，特別 是人的基因。在可選的實施方案中，所述組合物含有藥用的賦形劑以 及根據本發明第二個方面的DNA載體。所述組合物還可包括佐劑。因而，本發明的一個實施方案是本發明的載體與免疫刺激劑一起 利用。優選地，免疫刺激劑與本發明的核酸載體同時給藥，并且在優 選的實施方案中它們一起配制。這種免疫刺激劑包括，但這里決非全 面列舉，也不排除其他的免疫刺激劑合成咪唑并喹啉 (imidazoquinoline )例如咪咬莫特(imiquimod) ( p14 ) [S-26308 , R-837], ( Harrison等，"單獨使用咪喹莫特或與糖苷配基蛋白質疫 苗結合使用減少HSV疾病的復發，，，Vaccine 19: 1820-1826, ( 2001 )); 和resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos等,"免疫反應修飾基因 R-848的佐劑活性與CpG ODN，的比較，，，細胞免疫學(Cellular immunology) 204: 64-74 ( 2000)),在抗原遞呈細胞和T-細胞表12面組成型表達的羰基和胺的Schiff堿基，例如tucaresol (Rhodes, J. 等，"通過共刺激Schiff-堿基-形成藥物免疫系統的治療效果增強"， Nature 377: 7175 ( 1995 )),細胞因子、趨化因子和共-刺激分子的 蛋白質或肽，包括促炎細胞因子例如GM-CSE、 IL-la、 IL-1(3、 TGF-a 和TGF-P， Thl誘導劑例如干擾素丫、 IL-2、 IL-12、 IL-15和IL-18， Th2 誘導劑例如IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10和IL-13和其它趨化因子以及共-刺激基因例如MCP-1、 MIP-la、 MIP-ip、 RANTES、 TCA誦3、 CD80、 CD86和CD40L,以及其它免疫刺激耙向配基例如CTLA-4和L-選擇 蛋白、細胞程序死亡刺激蛋白和肽例如Fas， (49)、合成脂基佐劑， 例如vaxfectin， ( Reyes等，"Vaxfectin增強抗原特異性抗體的效價 并保持對質粒DNA免疫的Thl型的免疫反應"，Vaccine 19: 3778-3786 )角鯊烯、a-生育酴、聚山梨醇酯80、 DOPC和膽固醇、內 毒素、[LPS] (Beutler, B,"內毒素，Toll-樣受體4和先天免疫性的 傳入支"，現代微生物學觀點(Current Opinion in Microbiology), 3: 23-30 ( 2000 ) ) ; CpG寡-和二-核苦酸(Sato, Y.等，"有效皮內基 因免疫所必需的免疫刺激DNA序列",Science 273 ( 5273 ) : 352-354 (1996 ) 。 Hemmi， H等，"一種Toll-樣受體識別細菌DNA" , Nature 408: 740-745, (2000))、以及其它引發Toll受體產生Thl-誘導細 胞因子的潛在的配基，例如合成的分枝桿菌脂蛋白、分枝桿菌蛋白 p19、肽聚糖磷壁質和類脂A。激發主要的Thl-型反應的某些優選的佐劑包括，例如，類脂A的 衍生物，例如單磷酰類脂A，或優選地3-去-0-酰化單磷酰類脂A。 MAL⑧佐劑可從Corixa Corporation購得(Seattle, WA;見例如，美國 專利4，436,727、 4,877,611、 4,866,034和4,912,094 )。包含CpG的寡 核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也誘導主要的Thl反應。這種 寡核苷酸是眾所周知的，并描述于例如，WO 96/02555、 WO 99/33488 和美國專利6,008,200和5,856，462。免疫刺激DNA序列也在例如Sato 等，Science 273: 352， 1996中有描述。另 一種優選的佐劑包括皂苷， 例如Quil A,或其書t生物，包括QS21和QS7( Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)、七葉鬼普、毛地黃急苦、或Gypsophila或 奎藜籽皂苷(Chenopodium quinoa saponins )。還提供了根據本發明的多核苷酸或根據本發明的載體在治療或預防HIV感染的應用。本發明還提供了治療HIV或預防HIV感染、及任何與之有關的癥 狀或疾病的方法，包括給予有效量的本發明多核香酸、載體或藥物組 合物。藥物組合物可采取一或多個單獨劑量方式給予，例如用相同 DNA質粒的重復劑量，或以一種"初次免疫-加強免疫"(prime-boost) 的治療接種方式。在某些情況下，"初次"接種可通過顆粒介導DNA 釋放本發明的多核苷酸，優選地整合到質粒衍生載體中，而"加強免 疫"通過給予含有同樣的多核苷酸序列的重組病毒載體進行，或者用 佐劑中的蛋白質加強。相反地，初次免疫可使用病毒載體或典型地在 佐劑中配制蛋白質的蛋白質制劑，而加強免疫使用本發明的DNA疫 苗。可采用多次劑量的初次免疫和/或加強免疫。涉及gag、 nef或RT蛋白的片段的實施方案也得到了考慮。例如， 本發明的多核苷酸可編碼HIVgag、 nef或RT蛋白的片^:。 一種多核 苦酸編碼至少8個氨基酸的片段，例如長度為8-10個氨基酸或高達 20、 50、 60、 70、 80、 100、 150或200個氨基酸，只要所編碼的寡肽 或多肽顯示了 HIV抗原性，均認為屬于本發明的范圍。特別地，但并 不是唯一的，本發明的這一方面包含多核苷酸編碼完全HIV蛋白序列 的片段，其代表著HIV蛋白質的一個或多個分離(discrete)表位時的情 況。這種片段可以含優化密碼子，以使該片段就具有與高度表達的哺 乳動物基因相似的密碼子使用模式。根據本發明的優選構建體包括1. p17、 p24，與截短的NEF融合(缺乏編碼末端氨基酸1-65的核 苷酸)2. p17、 p24、 RT截短的NEF (缺乏編碼末端氨基酸1-65的核苷酸)3. p17、 p24 (優化的gag )截短的NEF (缺乏編碼末端氨基酸1-65 的核苷酸)4. p17、 p24 (優化的gag) RT (優化的)截短的NEF (缺乏編碼 末端氨基酸1-85的核苷酸)5. p17、 p24、 RT(優化的)截短的NEF(缺乏編碼末端氨基酸1-65的核苷酸)6. 截短的NEF-(缺乏核苷酸1-65 )與優化的p17、 p24 gag融合。7. 本發明特別優選的構建體包括三重融合RT-NEF-Gag,尤其是 RT-Gag-Nef;8. 優化的RT、截短的NEF和優化的p17、 p24 ( gag ) ( RNG )和9. 優化的RT、優化的pl7、 24 (gag) 、 Nef截短物(缺乏氨基酸 1-65) RGN優選地，HIV構建體衍生自HIV分化體(Clade)B或分化體C,尤 其是分化體B。如上所述，本發明包括含有本發明核苷酸序列的表達載體。這種 表達載體可用分子生物學領域的常規技術進行構建，并可能例如涉及 利用質粒DNA和適當的起始子、啟動子、增強子、和其它元件例如 多聚腺普酸化信號，它可能是必需的并位于正確的位置和方向，以能 夠使蛋白質表達。其它適合的載體是本領域熟練的技術人員已知的。 關于這一點的其它的實施例我們參考Sambrook等，分子克隆實驗 室手冊(Molecular Cloning: a Laboratory Manual),第二版，CSH Laboratory Press. ( 1989 )。優選地，本發明多核普酸，或在本發明中用于載體的多核苷酸， 與能夠在宿主細胞中表達編碼序列的控制序列可操作地連接，即該載 體是一種表達載體。術語"可操作地連接，，是指所描述的成分毗鄰并 以允許它們以其預定的方式發揮功能的關系存在。調控序列如啟動子 與編碼序列"可操作地連接"，意指以這樣的方式連接，即在與調控 序列相容的條件下使編碼序列的成功表達。載體可以是，例如，有復制起點的質粒、人工染色體(例如BAC、 PAC、 YAC)、病毒或噬菌體載體，任選地含有用于多核苷酸表達的 啟動子和任選地含有該啟動子的調節子。該載體可包括一種或多種可 選擇的標記基因，例如在細菌質粒中可包含氨千青霉素或卡那霉素抗 性基因，或用于真菌載體的抗性基因。載體可在體外使用，例如用于 DNA或RNA的生產或用于轉染或轉化宿主細胞，例如哺乳動物宿主 細胞，如用于生產由載體編碼的蛋白質。該載體也可適應于體內4吏用，例如用于DNA疫苗接種或基因治療中。選擇的啟動子和其它表達調節信號與用于表達的宿主細胞相兼 容。例如，哺乳動物啟動子包括可誘導對重金屬例如鎘的反應的金屬 硫蛋白啟動子，以及(3-肌動蛋白啟動子。病毒啟動子例如SV40大T 抗原啟動子，人細胞肥大病毒(CMV)立即早期(IE)啟動子、勞氏 肉瘤病毒LTR啟動子、腺病毒啟動子或HPV啟動子，特別是還可使 用HPV上游調節區(URR)。所有這些啟動子在本領域中已凈皮詳細描 述，并可容易地獲得。一種優選的啟動子元件是CMV立即早期啟動子，它缺乏內含子A 但包括外顯子1。啟動子元件可以是最小的啟動子元件或增強的啟動 子，增強的啟動子是優選的。因此，這里提供包含了在HCMV IE早 期啟動子控制下的含本發明多核苷酸的載體。適合的病毒載體例如包括單純皰滲病毒載體、牛痘或a-病毒載體 和逆轉錄病毒，包括慢病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。利用這些病毒的 基因轉移技術是本領域技術人員所熟知的。例如逆轉錄病毒載體可用 于將本發明多核苷酸穩定地整合到宿主基因組，盡管這種重組不是優 選的。相反，復制-缺陷型腺病毒載體保持游離狀態，并因此允許瞬時 表達。可使用能在昆蟲細胞(例如桿狀病毒載體)、人細胞、酵母或 細菌中表達的載體，以產生大量的由本發明多核苷酸編碼的HIV蛋白， 例如可用做亞單位疫苗或用于免疫測定。根據本發明多核苷酸可用于表達生產編碼的蛋白質，其表達可在 體外、體內進行或來自體內。因此，核苷酸可涉及重組蛋白質合成， 例如增加產量，或實際上可憑其自身的特性用做治療劑，用于DNA 疫苗接種技術。本發明的多核苷酸用于體外或來自體內、細胞中生產 編碼的蛋白質，例如在細胞培養物中進行，則這些細胞被修飾以包含 被表達的多核普酸。這種細胞包括瞬時的、或優選穩定的哺乳動物細 胞系。關于插入編碼本發明多肽的載體而修飾的細胞例如包括哺乳動 物HEK293T、 CHO、 HeLa、 293和COS細胞。優選地，所選擇的細 胞系不僅僅是穩定的，而且能對多肽進行成熟糖基化和在細胞表面表 達。表達可通過轉化卯母細胞來達到。可在轉基因非-人動物，優選地 是小鼠細胞中表達本發明多核苷酸以獲得多肽。將本發明多核苷酸表達成多肽的轉基因非-人動物包含于本發明的范圍中。本發明進一 步提供接種哺乳動物受檢者的方法，包括給予有效量的這種疫苗或疫苗組合物。最優選地，用于DNA疫苗、疫苗組合物 和免疫療法的表達載體為質粒載體。DNA疫苗可以"棵DNA"的形式給藥，例如配制成液體用注射 器或高壓噴射器進行給藥，或將DNA與脂質體或刺激性轉染增強子 一起配制，或通過顆粒介導DNA釋放(PMDD )給藥。所有這些釋放 系統為本領域所熟知的。例如通過病毒載體釋放系統可將載體導入哺 乳動物。本發明的組合物可通過許多途徑來給藥釋放，例如通過肌肉內、 皮下、腹膜內、靜脈內或粘膜。在一個優選的實施方案中，組合物通過皮內給藥釋放。具體地， 組合物通過基因槍給予，尤其是粒子轟擊進行給藥，它包括在粒子(例 如金顆粒)上包被載體，然后該粒子在高壓下進入表皮；例如，其方 法如Haynes等，J Biotechnology 44: 37-42 ( 1996 )中所描述。在 一 個說明性的實施例中，氣體-推動顆粒加速可利用例如由 Powderject Pharmaceuticals PLC ( Oxford, UK )和Powderject Vaccines Inc. ( Madison, WI)生產的設備來達到，其中某些例子描述于美國專 利5,846,796、 6，010,478、 5,865，796、 5,584,807和歐洲專利0500799 中。這種方法提供了無針給藥方法，其中顯微顆粒的干粉制劑，例如 多核苷酸，在由手動儀器產生的氦氣噴射器中被加速到高速，將顆粒 推進感興趣的靶組織，典型的是皮膚。優選的顆粒是0.4-4.0|tim的金顆粒，更優選地直徑為0.6-2.0|um, 并且DNA合成物包被在這些顆粒上，然后裝入藥筒或彈夾而放入"基 因槍"中。在一個相關的實施方案中，可用于本發明組合物的氣體-推動無針 注射的其它設備和方法包括由Bioject， Inc. (Portland, OR)提供的設 備，其中的具體例子描述于美國專利4,790,824、 5,064,413、 5,312,335、 5,383,851、 5,399,163、 5,520,639和5,993,412中。含有編碼抗原肽的核苷酸序列的載體將以預防或治療有效量進行 給藥。對于顆粒介導釋藥，給予的量通常為每劑核苷酸為1微微克17(picogram)到1毫克，優選地為1微微克到IO微克，而對于其它途徑， 劑量為100納克到1亳克，優選地為IO微克到1毫克。精確劑量很大 程度上取決于被免疫的受檢者的體重和給藥途徑。對于含有編碼抗原肽的核苷酸序列的免疫原成分可以 一次給予或 重復多次給予，例如l-7次，優選地l-4次，間隔為1天到18個月。 然而這種治療方式將很大程度上根據有關受檢者的大小(size)、給予核 苷酸序列的數量、給予的途徑以及其它為熟練獸醫或醫師所熟知的因 素而進行調整。受檢者可接受一種或多種其它抗HIV逆轉錄病毒藥物 作為它們整個治療方式中的一部分。此外，核酸免疫原可與佐劑一起 給予。通過口、鼻、肺、肌內、皮下、皮內或體表給予。優選地，佐劑成分 通過皮內或體表途徑給予。最優選通過體表給予。佐劑的給予可在核 苦酸序列給予前約14天到給予后約14天之間進行，優選地在核苷酸 序列給予前約1天到給予后約3天之間。在一個實施方案中，佐劑成 分與核苷酸序列的給予基本上同時進行。"基本上同時"是指佐劑成 分優選地在核苷酸序列給予的同一時間給予，否則，至少在核苷酸序 列給予的前后幾個小時內進行給予。在最優選的治療方案中，佐劑成 分與核苷酸序列的給予基本上同時進行。顯而易見，根據上述變量的 類型，該方案可隨需要而改變。優選地佐劑是1H-咪唑并[4,5c]喹啉 -4-胺衍生物例如咪喹莫特。典型地，咪喹莫特為體表的膏狀制劑， 并根據上述方案進行給予。同樣，衍生物給予的劑量也依據這些變量進行調整，但是可在例 如，從約0.1mg/kg到約100mg/kg之間，這里"每千克(/kg)，，指相 關哺乳動物的體重。1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺書1"生物的給予優選地 隨每次核苷酸序列給予后或加強給予而重復。最優選地，給予劑量為 約lmg/kg到50mg/kg。在如本文所描述的"初次-力n強"方案的情況 下，咪會莫特或其它1H-咪哇并[4,5-c]喹啉-4-胺書t生物可隨初次免 疫、或加強免疫給予、或在初次和加強免疫中都進行給予。雖然，佐劑成分可能含有以原始化學狀態給予唯一的1H-咪唑并 [4,5-c]會啉-4-胺衍生物，以藥物制劑的形式給予是優選的。即佐劑成18分優選地含有與一種或多種藥用載體結合的1H-咪唑并[4,5-c]喹啉 -4-胺衍生物，以及任選的其它治療成分。載體必須是"可接受的，，， 是指與制劑中其它成分相兼容，并對其接受者無害。制劑特性將根據 給予途徑自然地進行調整，并可通過制藥領域熟知的方法來制備。所 有方法都包括將1H-咪唑并[4,5-c]會啉-4-胺衍生物與適當的栽體結 合的步驟。通常，通過均勻和緊密地將衍生物與液體載體或良好分離 的固體載體或二者結合制備制劑，然后如果需要，將產品制成預期的 劑型。適合于口服的本發明制劑可制成分離的單位，例如制成每一個 均含有預定量活性成分的膠嚢、扁嚢劑或片劑；粉劑或顆粒；溶液或 存在于水成液或非水成液中的懸浮液；或為水包油性液體乳液或油包 水性乳狀液。活性成分還可制成大丸劑(bolus)、藥糖劑或軟膏。可任選地與 一種或多種助劑壓縮或塑形(moulding)制備成片劑。壓 縮的片劑可通過在一個合適的機器中以自由流動形式如粉劑或顆粒的 活性成分壓縮制備而成，任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤 滑劑、表面活性劑或分散劑混合。塑形片劑可通過在適當的機器中將 惰性液體稀釋劑潤濕的粉狀化合物的混合物塑模制成。片劑可任選地包被或刻劃，并可配制成活性成分緩慢或控制釋放 的片劑。用于通過例如肌內、腹膜內或皮下途徑注射的制劑包括水性和非 水性無菌注射溶液，可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和與預定的接 受者的血液等滲的溶質；而水性和非水性無菌懸浮液可包括懸浮劑和 增稠劑。該制劑可制成單劑量或多劑量的容器中，例如密封的安瓿和 管瓶，并可保存于僅需要添加無菌液體載體的凍干條件下，例如在使 用前立即添加注射用水。可從前面描述的無菌粉劑、顆粒和片劑類型 制備臨時的注射液和懸浮液。適合于通過口或鼻進行肺部給予的制劑 被制成理想地具有0.5到7微米直徑的含有活性成分的顆粒，被釋放 到接受者的樹狀支氣管。這種制劑可以精細研磨的粉劑形式存在，可 方便地制成可穿透(piercable)的膠嚢，合適地如明膠，以用于吸入設備， 或者可選地，作為一種含有活性成分、 一種適當的液體推進劑和任選 地其它成分如表面活性劑和/或一種固體稀釋劑的自我推進制劑。也可 采用活性成分以溶液或懸浮液液滴的形式配制成自我推進制劑。這種自我推進制劑類似于本領域已知的那些制劑，并可通過成熟方法來制 備。手工操作或者用具有所需噴霧特征的自動功能閥來制備，優選地， 該閥是具有能測量傳遞固定體積的類型，例如每次操作的固定體積為50-100|LiL。另一種可能性，佐劑成分可以液體的形式用于噴霧器或霧化器， 其中利用加速氣流或超聲攪拌產生用于吸入的微滴薄霧。適合于經鼻給予的制劑通常包括與上述用于肺部給予的制劑相似 的制劑，對于這種制劑優選地具有約10-200微米的顆粒直徑，使之能 夠保持于鼻腔內。相應地，可通過使用顆粒大小適當的粉劑或選擇適 當的閥來獲得。其它適當的制劑包括具有顆粒直徑為約20-500微米的 粗粉，用于從與鼻靠近的容器中迅速吸入鼻內而經鼻通道給予，以及 在水溶液或油性溶液中含有約0.2-5% w/w的活性成分的鼻滴劑。在本 發明的一個實施方案中，含有編碼抗原肽的核苷酸序列的載體可以與 1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺衍生物采用相同的制劑中給予。因此，在 這個實施方案中，免疫原性成分和佐劑成分并存于相同的制劑中。在一個實施方案中，佐劑成分以適合于基因槍給予的形式制備， 并經該途徑與核普酸序列基本上同時施用。為了配制適合于以這種方 式使用的制劑，對于1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺衍生物可能需要凍干 并附著在例如適合于基因槍給予的金小珠上。在另一可選實施方案中，佐劑成分可作為干粉經高壓氣體推進器 給予。即使沒有配制在一起，對于佐劑成分可能在核苷酸序列給予位點 或者其基本上相同的給予位點進行給予是合適的。藥物制備的其它細節可在Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eastern, Pennysylvania ( 1985 )中找到， 其公開的全部內容被本文11入作為參考。用于將棵多核苷酸或載體引入患者的合適技術也包括以適當的方 式進行局部給予。核酸可經皮膚局部給予，或粘膜表面，例如經鼻內、 口腔、陰道內或直腸內給予。棵多核苷酸或載體可與藥用的賦形劑例 如磷酸緩沖鹽(PBS) —起存在。通過使用易化劑例如丁呱卡而進一 步促進DNA的攝取，該易化劑或者單獨使用或者包含于DNA制劑中。其它將核酸直接給予接受者的方法包括超聲、電刺激、電穿孔和顯微接種，在美國5,697,901中對此有描述。可通過一些已知的轉染技術增強對核酸構建體的吸收，例如包括 使用轉染試劑的技術。這些試劑的例子包括陽離子試劑，例如，磷酸 鉀和DEAE-葡聚糖和脂轉染試劑(lipofectant),例如lipofectam和 transfectam 。給予核酸的劑量可以進行調整。本發明的核酸序列還可通過基因療法中使用的特異性釋放載體給 予。基因治療方法例如由Verme等在Nature 1997， 389: 239-242中 描述。病毒和非病毒載體系統均可使用。基于病毒的系統包括基于逆 專爭錄病毒、l曼病毒、月泉病毒、腙J半隨病毒、皰滲病毒、Canarypox和 痘苗-病毒系統。基于非病毒的系統包括核酸的直接給予、微球包嚢技 術(聚(丙交酯-共-乙交酯)和基于脂質體的系統。病毒和非病毒釋 放系統可結合使用，其中在初始接種后進行強化注射是理想的，例如 使用非病毒載體例如質粒進行最初的"初次"DNA接種，隨后使用病 毒載體或基于非病毒的系統進行一次或多次"加強，，接種。同樣地， 本發明設計了具有本發明多核苷酸的初次免疫導入系統，隨后用存在 于佐劑中的蛋白質進行加強免疫，反之亦然。本發明的核酸序列還可通過轉化細胞給予。這種細胞包括從被試 者收集的細胞。在體外將本發明的棵多核苷酸或載體導入這種細胞， 隨后將該轉化的細胞返回到被試者體內。本發明的多核苷酸可通過同 源重組整合進入細胞中已存在的核酸中。如果需要，轉化細胞可在體 外生長，并且獲得的一個或多個細胞可用于本發明。可通過已知的外 科或顯微外科技術(例如移植、顯微注射等)在患者適當的部位給予 這種細胞。本發明的藥物組合物可包括如上所述的佐劑化合物，或其它可用 于提高由DNA編碼的蛋白質誘導的免疫反應的物質。這些物質可由 DNA編碼，或者單獨存在或與抗原進行了融合，或者作為非DNA元素、溶酶體伴隨膜蛋白(LAMP)、乙肝病毒核心抗原、FLT3-配體(一 種在消化性抗原呈遞細胞發生中重要的細胞因子，具體是樹枝狀細胞) 以及其它細胞因子例如IFN-y和GMCSF。其它優選的佐劑包括咪會莫特、Resimquimod和Tucarasol。咪喹莫特是特別優選的。在本發明一個優選的實施方案中，提供了如本文所描述的核酸分 子在治療或預防HIV感染中的用途。核酸分子優選地與咪喹莫特配合 給予。咪會莫特優選局部給予，而核酸分子優選通過顆粒介導釋放的 方式給予。因此，本發明提供了治療患有HIV或易于遭受HIV感染的被檢者 的方法，包括給予本發明描述的核酸分子和咪喹莫特。
圖1描繪了表達載體p7313。圖2描繪了 pGagOptrpr2中的p55 gag插入序列。圖3描繪了 pl7/24trNEFl中的pl7/24trNEF插入序列。圖4描繪了 pl7/24opt/trNefl中的pl7/24opt/trNef插入序列。圖5描繪了 p7077-RT3的RT插入序列。圖6描繪了 p73i-RT3中的編碼插入序列。圖7描繪了 7077trNef20中的Nef插入序列。圖8描繪了 7077RT8中的RT插入序列。圖9描繪了 pl7/24opt/RT/trNef13中的pl7/24opt/RT/trNef插入序列。圖10描繪了 WRG7077中的pl7/p24opt(cor)/RT/trNef編碼插入序列。圖11描繪了 p73i-GRN2中的pl7/p24(opt)/RT(opt)trNef插入序列。 圖12描繪了 p73i-GRN2中的pl7/p24opt/trNef插入序列。 圖13描繪了 RTw229k序列。圖14描繪了通過將p73i-RT w229k的Nhel和Apal酶切片段插入 到Nhel/Apal酶切的p73i-GRN2#19中而獲得失活的RT。 圖15描繪了 Tnrg的序列。 圖16描繪了 p7313ie中的Tngr插入序列。 圖17描繪了 Trgn # 6插入序列。 圖18描繪了 Trng弁ll插入序列。 圖19描繪了 TgnR (Fl )序列。圖20表示用IFN-y ELIspot在加強免疫后5天測得的對Gag肽的應答。圖21表示用IFN-yELIspot在加強免疫后5天測得的對Nef肽的應答。圖22表示用ifn - y ELIspot在加強免疫后5天測得的對Rt肽的應答。圖23表示用重建構建體免疫之后測得的小鼠模型中CD8免疫應 答的示例。構建體包括Gag、 RT和Nef作為三重融合。G是gag， R 是RT, N是Nef。其中第一個圖片表示用IFN-yELIspot在第35天(加強免疫后7 天)測得的對Gag肽的應答。其中第二個圖片表示用IFN-YELIspot在第35天(加強免疫后7 天)測得的對Nef肽的應答。其中笫二個圖片表示用IFN-y ELIspot在第35天(加強免疫后7 天)測得的對RT肽的應答。圖24表示用ELISA在笫35天(加強免疫后7天)測得的Gag抗體。
具體實施方式
現在本發明將參考如下實施例作進一步的描述 實施例實施例1:優化p55gag(p17、 p24、 p13 )以與高度表達的人類基 因的密碼子利用率相似 感興趣的基因用于哺乳動物細胞中表達的編碼HIV-1分化體B菌林HXB2的 p55gag抗原的優化合成基因(GenBank記錄號K03455 ),利用PCR 擴增的重疊寡核苷酸進行裝配。優化涉及改變病毒基因的密碼子使用模式以獲得與在高度表達的 人類基因中發現的密碼子頻率接近的密碼子頻率。利用被稱做 Syngene的統計學Visual Basic程序確定密碼子(由R.S. Hale和G. Thompson編寫的Calcgene的最新版本，蛋白質表達和純化，12巻， 185-188頁，1998 )。克隆1528bp的gag PCR產物通過凝膠純化，用限制性核酸內切酶Not I 和Bam HI酶切，并連接到Notl/BamHI酶切的載體WRG7077中。即 將基因置于CMV啟動子/內含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。對克隆進行測序并檢查存在的錯誤。沒有一個克隆是100%正確 的。因此，通過重疊PCR將兩個克隆中正確序列的區域結合，其重疊 PCR利用優化的寡組合的適當組合以得到密碼子優化的全長gag基 因。隨后發現最終克隆中含有一個核普酸缺失，這導致移碼和翻譯提 前終止。通過切除含有不正確序列的基因區域，并將另一個克隆中含 有正確序列的相應區域克隆進來，而修復了上述缺失。這樣得到密碼 子被優化p55 gag的最終克隆Gag叩trpr2。(見圖2 )。實施例2:制備pl7/p24截短的Nef融合基因 感興趣的基因通過PCR從質粒pHXB Pr( B.Maschera,E Furfine和E.D.Blair 1995 丄Virol 69 5431-5436 )擴增衍生自HIV-1分化體B菌株HXB2的p55gag 基因的pl7和p24部分。從該質粒中擴增來自HXB2 nef基因的3，末 端的pHXB Pr. 426bp。由于HXB2 nef基因含有提前的終止密碼子， 因此用兩個重疊PCR修復密碼子(TGA[終止]到TGG[Trp])。p 17/p24接頭和trNEF接頭的PCR產物通過一 個PCR反應而接合 形成pl7p24trNEF融合基因(圖3 )(反義)。1542bp的產物通過凝膠純化，用限制性核酸內切酶Notl和BamHI 酶切，并克隆進載體WRG7077的Notl BamHI位點。即將基因置于 CMV啟動子/內含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。實施例3:制備Gagpl7/24叩t/trNefl (，Gagopt/Nef )融合基因 感興趣的基因以質粒pGagOPTrpr2為模板進行PCR擴增，獲得密碼子優化的衍 生自HIV-1分化體B菌林HXB2的p55gag基因的p17和p24部分。 通過PCR從質粒7077trNef20擴增具有修復的提前終止密碼子 (TGA[終止]到TGG[Trp])的截短的HXB2 Nef基因。這兩個PCR產 物被設計成具有重疊的末端，因而這兩個基因在第二輪PCR中發生接合。1544bp的產物通過凝膠純化，用限制性核酸內切酶Notl和BamHI 酶切，并克隆(見圖)進載體WRG7077的Notl BamHI位點。即將基 因置于CMV啟動子/內含子和牛生長素多腺苷酸化信號之間。實施例4:質粒p7077-RT3克隆弁A 感興趣的基因編碼HIV-1分化體B菌抹HXB2的pol基因的RT部分，被優化 用于在哺乳動物細胞中表達的合成基因是通過PCR擴增的重疊寡核 苷酸進行裝配。克隆的序列與HXB2參考序列(GeneBank記錄號 K03455 )的位置2550-4222相應。為了確保表達，在克隆序列的5，末 端具有兩個附加的不存在于原來基因中的密碼子一AUG GGC (Met Gly)。優化涉及改變病毒基因的密碼子使用模式，以得到與在高度表達 的人類基因中發現的密碼子頻率相接近的密碼子頻率，但不包括很少 使用的密碼子。使用被稱做Syngene的統計學Visual Basic程序確定 密碼子(由R.S. Hale和G. Thompson編寫的Calcgene的最新版本， 蛋白質表達和純化，12巻，185-188頁，1998 )。通過兩個中間克隆，即#16和#21而構建成最終克隆。克隆1.7kb的PCR產物通過凝膠純化，用Notl和BamHI酶切并PCR 凈化，然后與Notl/BamHI酶切的pWRG7077連接。這將基因置于CMV 啟動子和牛生長素多腺普酸化信號之間。對克隆進行測序。沒有任何克隆是100%正確的，但通過用來自克隆#21的正確的KpnI-BamHI片 段取代克隆#16中含有3個錯誤的403bp的KpnI-BamHI片段，這樣克隆#16被修復。通過測序證實最終克隆。(見圖5)實施例5:優化的RT 感興趣的基因編碼HIV-1分化體B菌抹HXB2的pol基因的RT部分，被優化 用于在哺乳動物細胞中表達的的合成基因是從質粒p7077-RT3切割獲得，即1697bp的Notl/BamHI片段，通過凝膠純化，并克隆進入p7313-ie (衍生自pspC31 )的NotI和BamHI位點，而將基因置于Iowa長HCWV 啟動子+外顯子1的下游，和兔球蛋白多腺苷酸化信號的上游。(R7004 p27 )(圖6 )實施例6質粒7077trNef20感興趣的基因插入片段含有來自HIV-1分化體B菌抹HXB2的Nef基因部分。 從基因的5，末端去除195bp,即除去Nef的最初65個氨基酸的密碼子。 另外，如前面描述的質粒pl7/24trNEFl的構建中，將已公開的HXB2 nef序列中的提前終止密碼子進行了修復(TAG到TGG[Trp])。截短 的nef序列是從質粒pl7/24trNefl擴增獲得。克隆序列與HXB2參考 序列(GenBank記錄號K03455 )的位置8992-9417相應。為了確保表 達，在克隆序列5，末端具有附加的在原來基因中不存在的密碼子一 AUG ( Met)。引物<formula>formula see original document page 26</formula>PCR: 94。C2分鐘，然后按如下參數進行25個循環94°C30秒， 50。C30秒，72。C2分鐘，最后72。C5分鐘。 克隆455bp的RT PCR產物通過凝膠純化，用限制性核酸內切酶Notl 和Bam HI酶切，并連接到Notl/BamHI酶切的載體WRG7077上。即 將基因置于CMV啟動子/內含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。實施例7質粒7077RT 8感興趣的基因pol基因的RT部分衍生自HIV-1分化體B菌抹HXB2。通過PCR 從質粒p7077Po114擴增獲得。克隆序列與HXB2參考序列(GeneBank記錄號K03455 )的位置 2550-4234相應。為了確保表達，克隆序列在5'末端具有兩個附加的 不存在于原來基因中的密碼子一AUGGGC (MetGly)。引物SRT (有義)ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGCCCCATTAGCCCTATTGAGACT [SEQ ID NO: 3〗 ASRT (反義)CGCGGATCCTTAATCTAAAAATAGTACTTTCCTGATT [SEQ ID NO: 4]PCR: 94。C2分鐘，然后按如下參數進行25個循環94°C30秒， 5(TC30秒，72。C4分鐘，最后72。C5分鐘。 克隆1720bp的RTPCR產物通過凝膠純化，用限制性核酸內切酶Notl 和Bam HI酶切，并連接到Notl/BamHI酶切的載體WRG7077上。即 將基因置于CMV啟動子/內含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。實施例8pl7/24opt/RT/trNef13 ( ，Gagopt/RT/Nef ) 該構建體含有引起由R到H氨基酸改變的PCR產物。 感興趣的基因衍生自HIV-1分化體B菌抹HXB2的優化p55gag基因的密碼子 的pl7/p24部分從質粒pGagOPTrpr2經PCR擴增獲得。RT編碼序列 從質粒7077RT 8經PCR擴增獲得。具有修復的提前終止密碼子 (TGA[終止]到TGG[Trp])的截短的HXB2 Nef基因經PCR 乂人質粒 7077trNef20擴增得到。三個PCR產物被設計為具有重疊末端，因此 這三個基因在第二輪PCR中發生連接。 引物 (P17/24)Spl7p24opt (有義)ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT [SEQ ID NO: 5〗 ASpl7p24optRT接頭(反義)TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC [SEQ ID NO: S]PCR: 94。Cl分鐘，然后按如下參數進行20個循環94°C30秒， 50。C30秒，72。C2分鐘，最后72°C4分鐘。 1114bp的pl7/24opt產物通過凝月交純化。 (RT)Spl"7pMoptRT接頭(有義)CAGAGTGTTGATGGGCCCCATTAGCCCTAT [SEQ ID NO: 7] ASRTtrNef接頭(反義)AACCCACCATATCTAAAAATAGTACTTTCC [SEQ ID NO: 8]PCR:如上文171 lbp的RT PCR產物通過凝月交純化。 (5'截短的nef)SRTtrNef接頭(有義)CTATTTTTAGATATGGTGGGTTTTCCAGTCAC [SEQ ID NO: 3] AStrNef (反義)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC [SEQ ID NO: 10〗PCR如上文448bp的產物通過凝膠純化。然后Spl7/24叩t和AstrNef為引物進行第二輪PCR將上述三個 PCR產物接合在一起。PCR: 94。Cl分鐘，然后按如下參數進行30個循環94°C30秒， 5(TC30秒，72。C4分鐘，最后72。C4分鐘。3253bp的產物通過凝膠純化，用限制性核酸內切酶Notl和Bam HI 酶切，并克隆到載體WRG7077的Notl BamHI位點。即將基因置于 CMV啟動子/內含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。實施例9質粒pGRN# 16 ( p 17/p24opt corr/RT/trNef.)28感興趣的基因由于在p24中氨基酸270附近存在不利的密碼子簇，由pl7/24opt /RT/trNef13 ( ，Gagopt/RT/Nef )產生的多蛋白被表達為約30kDa的截 短產物。這些密碼子被PCR接合誘變產生的優選密碼子所取代。以 pl7/24opt/RT/trNef13作模板，Spl7/p24opt和GTR-A為引物擴增Gag 5、端的部分以產生突變體，和以GTR-S和Aspl7/p24叩tRT接頭為引 物擴增Gag 3、端的部分以產生突變體。利用Spl7/p24叩t和 Aspl7/p24叩tRT接頭引物將包含了改變的密碼子的重疊產物和凝膠 純化的產物連接在一起。所得到的產物用Notl和Agel酶切，并插入 用相同酶切割的pl7 / 24opt/ RT/trNef 13中，獲得pGRN。對克隆#16 進行驗證并用于進 一 步的研究。引物5' PCR:Spl7p24opt (有義)ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT [SEQ ID NO: 11] GTR-A (反義)GCGCACGATCTTGTTCAGGCCCAGGATGATCCACCGTTTATAGATTTCTCC [ SEQ ID NO: 12]3 ' PCR有義GTR-S (有義) ATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGCATGTACTCTCCGACATCCATCC [SEQ ID NO: 13]ASpl"7p^optRT接頭(反義)TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC [SEQ IE) NO: 14]用于各個產物和連接，使用PWO DNA聚合酶(Roche)的PCR 條件是95。Cl分鐘，然后按下述參數進行20個循環95。C30秒，55°C30 秒，72。C180秒，最后72。C120秒，在4。C保持。1114bp的產物通過凝月交純化，并用Notl和Agel酶切產生6647bp的片段，經凝膠純化后連接到Notl/Agel酶切的、凝膠純化的 pl7/24opt/RT/trNef13中，獲得pGRN#16。實施例10:質粒p73i-GRN2克隆#19 (pl7/p24 (opt) /RT (opt) trNef)-修復的 感興趣的基因來自于HIV -1分化體B菌抹HXB2的密碼子被優化的gag的 pl7/p24部分、密碼子優化的RT和截短的Nef基因位于Iowa長HCMV 啟動子+外顯子1的下游和兔P-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。包含衍生自質粒pl7/24trNefl的trNef基因的質粒包含一個PCR 錯誤，導致從nef末端的19個氨基酸的R到H的氨基酸改變。這通 過PCR誘變得以校正，校正的nef PCR與p7077-RT3的密碼子優化 RT進行連接，并用Apal和BamHI酶切連接的片段，并克隆到用 Apal/BamHI酶切的p73i-GRN中。引物利用引物進行PCR以從p7077-RT3獲得coRT: (聚合酶=全部為PWO ( Roche ))有義UlGAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT [SEQ ID NO: 15]AScoRT-NefGGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC [SEQ ID NO: IS]循環95°C (30秒)，然后如下參數進行25個循環95°C (30 秒)，55°C (30秒)，72°C U80秒)，然后72°C ( 120秒)，最后 保持在4°C。1.7kp的PCR產物通過凝月交純化。利用下述引物進行PCR以從pl7/24trNefl獲得5'Nef:30有義S-Nef ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC [SEQ ID NO: 17]反義 ASNef-G:GATGAAATGCTAGGgGGCTGTCAAACCTC [SEQ ID NO: 18循環95°C (30秒)，然后按如下參數進行15個循環95°C (30 秒)，55°C (30秒)，72°C (60秒)，然后72°C ( 120秒)，最后保 持在4'C。利用如下引物進行PCR以從pl7/24trNefl獲得3，Nef:有義SNEF-G GAGGTTTGACAGCCgCCTAGCATTTCATC [SEQ ID NO: 19]反義 AStrNef (反義)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC[SEQ ID NO: 2 0]循環95°C (30秒)，然后按如下參數進行15個循環95°C (30 秒)，55°C (30秒)，72°C (60秒)，然后72°C ( 120秒)，最后保 持在4。C。PCR產物通過凝膠純化。使用5， (S-Nef)和3， (AstrNef)引物 將兩個最初Nef產物連接。循環95。C(30秒)，然后按如下參數15個循環95。C(30秒)， 55°C (30秒)，72°C (60秒)，然后72°C (180秒)，最后保持在4°C。PCR產物被PCR凈化，并用Ul和AstrNef引物將其與RT產物連接循環95°C (30秒)，然后按如下參數進行20個循環95°C (30 秒)，55°C (30秒)，72°C U80秒)，然后72°C (180秒)，最后 保持在4。C。2.1kb的產物通過凝月交純化，并用Apal和BamHI酶切。質粒 p73I-GRN也用Apal和BamHI酶切、凝膠純化并與Apal-Bam RT3trNef 連接產生pl7/p24 (opt) /RT (叩t) trNef基因。實施例11p73i-GN2克隆#2 ( pl7/p24opt/trNef)-修復的 感興趣的基因來自于HIV -1分化體B菌抹HXB2的密碼子優化的gag的 pl7/p24部分、截短的Nef基因位于Iowa長HCMV啟動子+外顯子1 的下游和兔P-球蛋白多腺苦酸化信號的上游之間。包含衍生自質粒pl7/24trNefl的trNef基因的質粒含有一個PCR 錯誤，導致從nef末端的19個氨基酸R到H的氨基酸改變。這通過 PCR誘變得以校正，校正的片段用BglII和BamHI酶切，并克隆進 BglII/BamHI酶切的p73I-GN中。(圖12 )重建了 Iowa長HCMV啟 動子+外顯子1的下游以及兔P-球蛋白多腺普酸化信號的上游之間經 校正的pl7/p24opt/trNef所產生的融合基因。利用下述引物以從p 17/24trNef 1獲得5 ， Nef: 聚合酶=全部為PWO (Roche)有義S-Nef ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC [SEQ ID NO: 21]反義 ASNef、G:GATGAAATGCTAGGgGGCTGTCAAACCTC [SEQ ID NO: 22]循環95°C (30秒)，然后按如下述參數進行15個循環95°C (30秒)，55°C ( 30秒)，72°C ( 60秒)，然后72°C ( 120秒)， 最后保持在4。C。利用下述引物以從p 17/24trNef 1獲得3 ， Nef:有義SNEF-GGAGGTTTGACAGCCgCCTAGCATTTCATC'■ [SEQ ID NO: 23]反義 AStrNefCGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC [SEQ ID NO: 24]循環95°C (30秒)，然后按如下參數進行15個循環95°C (30秒)，55°C (30秒)，72°C (60秒)，然后72°C ( 120秒)，最后保 持在4。C。PCR產物通過凝膠純化，并用5， (S-Nef)和3， (AstrNef)引物進行連接。循環95°C (30秒)，然后按如下參數進行15個循環95°C (30 秒)，55°C (30秒)，72°C (60秒)，然后72°C (180秒)，最后保 持在4'C。PCR產物經PCR凈化，用BglII/BamHI酶切，得到的367bp片段 經凝膠純化后，克隆到BglII/BamHI酶切、凝膠純化的p73i-GN中。實施例12質粒p73I-RT w229k (失活的RT ) 感興趣的基因獲得Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游和兔P-球蛋白多腺苷 酸化信號的上游之間的失活RT基因。考慮到在治療性疫苗中使用活性HIV RT的種類，需要將該基因 失活。這可通過PCR誘變而將RT (衍生自P73I-GRN2 )第229位氨 基酸從Trp改變為Lys ( R7271 pl-28 )來達到。引物PCR5'RT十突變用引物 (聚合酶=全部為PWO ( Roche ))有義RT3-u:lGAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTG AAACCCGGGAT [SEQ ID NO: 25]反義AScoRT-Trp229Lys GGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCT' [SEQ ID NO: 26〗循環1 x [94°C (30秒)]15 x [ 94°C ( 30秒)/55°C ( 30秒)/72°C ( 60秒)] 1 x [72 °C ( 180秒)]PCR凝力交純化PCR3'RT+突變用引物反義 RT3- l;l GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTG CTCGTTGCCGC [SEQ ID NO: 27]有義ScoRT-Trp22 9:LysCCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG [SEQ ID NO: 28〗 循環1 x [94°C (30秒)]15 x [ 94°C ( 30秒)/55°C ( 30秒)/72°C ( 60秒)] 1 x [72 °C ( 180秒)] PCR凝膠純化PCR產物經凝膠純化，用5' (RT3-U1)和3， ( RT3-L1 )引物將 RT的5'和3'末端連接。 循環1 x [94。C (30秒)]15 x [ 94°C ( 30秒)/55°C ( 30秒)/72°C ( 120秒)] 1 x [72 °C ( 180秒)]PCR產物經凝膠純化，并利用Notl和BamHI限制性位點克隆進 入p7313ie,產生p73I-RT w229k。(見圖13)實施例13質粒p73i-Tgrn (#3 ) 感興趣的基因來自HIV -1分化體B菌抹HXB2的密碼子^^皮優化的gag的 pl7/p24部分、密碼子優化RT和截短的Nef基因位于Iowa長HCMV 啟動子+外顯子1的下游和兔(3-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。含有活性形式RT的三重融合的構建體對于用于人類的調節目的 可能不被接受，因此通過將p73i-RT w229k的Nhel和Apal酶切片l殳插入到Nhel/Apal酶切的p73i-GRN2#19中而獲得失活的RT(圖14)。 這導致在RT的位置229上發生W改變為K。實施例14 p73I-Tnrg (#16) 感興趣的基因來自HIV -1分化體B菌抹HXB2的截短的Nef、密碼子優化的失 活RT和密碼子優化的gag基因的pl7/p24部分位于Iowa長度HCMV 啟動子+外顯子1的下游以及兔(3-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。由p73i-Tgrn編碼的多蛋白中的基因順序通過PCR和PCR結合重 排以產生p73I-Tnrg (圖15)。在基因的PCR結合以形成單一的多蛋 白之前，每個基因都經PCR擴增并經凝膠純化。該產物經凝膠純化、 用Notl/BamHI消化后連接到Notl/BamHI酶切的p7313ie中。引物S-Nef (Not I)CATTAGAGCGGCCGCGATGGTGGGTTTTCCAC [SEQ ID NO: 2 9] AS-Nef-C。RT接頭GATGGGACTGATGGGGCCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG [SEQ ID NO: 30]RTw22S;c PC及 S-CORTATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAG [SEQ ID NO: 31] AS-coRT-pl7p24接頭CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC [SEQ ID NO: 32]pl7p24opt PC及 S-pl7p24optATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG 〔SEQ ID U0: 33〗 AS-pl7p24opt (BamH工)GATGGGGGATCCTCACAACACTCTGGCTTTGTGTCC [SEQ ID NO: 34]用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產物和連接的PCR條 件如下lx[94。C (30秒)]25 x [ 94°C ( 30秒)/55°C ( 30秒)〃2°C ( 120秒[pl7p24或RT] 或60秒[trNef])]1 x [72 °C ( 240秒)]PCR產物經凝膠純化，并用引物S-trNef ( Notl)和AS- pl7p24opt (BamHI)進行PCR結合。 1 x [94°C (30秒)]25 x [ 94°C ( 30秒)/55°C ( 30秒)/72°C ( 210秒)] 1 x [72°C ( 240秒)]3000bp的產物經凝膠純化，并用Notl和BamHI酶切后經PCR凈 化，連接到Notl/BamHI消化的、凝月交純化的p7313ie中以產生 p73i畫Tnrg。實施例15:l.質粒P73i-Tngr (#3) 感興趣的基因來自HIV -1分化體B菌抹HXB2的截短的Nef、密碼子優化的 gag的pl7/p24部分、密碼子優化的失活RT基因位于Iowa長HCMV 啟動子+外顯子1的下游的兔P-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間獲 得的。p73i-Tgrn編碼的多蛋白中的基因順序通過PCR重排以產生36p73I-Tngr (圖16 )。密碼子優化的pl7/p24和RT產生單一產物，并 經PCR接合到擴增的trNef上。該產物經凝膠純化、Notl/BamHI消化 并連接到Notl/BamHI酶切的p7313ie中。 引物P17/p24-RT 3，PCRSpl7p24opt (有義)ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG [SEQ ID NO: 35] RT3 1:1 (反義)GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTG CTCGTTGCCGC [SEQ ID NO; 3S]TrNef 5'PCRS-Nef (Notl)CATTAGAGCGGCCGCGATGGTGGGTTTTCCAC [SEQ ID NO: 37] AS-Nef-pl7p24CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGC3 [SEQ ID NO: 38〗用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產物和連接的PCR條 件如下lx[94。C (30秒)]25 x [ 94°C ( 30秒)/55°C ( 30秒)/72°C ( 180秒[pl7p24+RT]或 60秒[trNef]或210秒[連接])] 1 x [72匸(240秒)]3000bp的產物經凝膠純化，并用NotI和BamHI酶切，經PCR凈 化后，連接到Notl/BamHI消化的、凝膠純化的p7313ie中以產生 p73i-Tngr。實施例16:質粒p73I-Trgn (#6)感興趣的基因來自HIV-1分化體B菌株HXB2密碼子優化的失活RT、密碼子 優化的gagpl7/p24部分和截短的Nef基因位于Iowa長HCMV啟動子 +外顯子1的下游和兔P-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。構建體內基因的順序通過PCR分別擴增來自質粒p73I-GN2和 p73I-RTw229k的pl7p24-trNef和RTw229k達到。進行PCT連接反應， 其產物經凝膠純化并用Notl/BamHI酶切，然后與Notl/BamHI消化的 p7313ie進行連接。序列測定揭示pl7p24沒有被完全優化，故用 Agel/Munl從編碼區切去700bp的片段， 一皮而用來自含有正確編碼序 列的p73i-Tgrn#3的Muni/Age片段進行取代。(見圖17 )引物pl7p24-trNef PCRS-pl7p24optATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO: 3 9]AstrNef ( BamHI)RTw229k RT3-U:lGAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTG AAACCCGGGAT [SEQ ID NO.. 40]AS-coRT-pl7p24opt接頭CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC [SEQ ID NO: 41〗用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產物和連接的PCR條 件如下1 x[94。C (30秒)]25 x [ 94°C ( 30秒)/55°C ( 30秒)〃2°C ( 120秒(PCR)或180 秒(連接)]1 x [72 °C ( 240秒)]PCR接合產生的3000bp產物經凝膠純化，并用Notl和BamHI酶 切，經PCR凈化后，連接到Notl/BamHI消化的、凝膠純化的p7313ie 中以產生p73i-Tngr。序列分析顯示從p73I-GN2獲得的pl7p24序列密 碼子沒有完全—皮優化，這^皮攜帶到新的質粒中。從MunI和AgeI酶切 的p73i-Tngr中切掉700bp的片段，用來自p73i-Tgrn的700bp的 Munl/Agel消化產物進行連接而取代它，產生構建體p73I-Tngr#6。實施例17:質粒p73i-Trng (#11 ) 感興趣的基因Iowa長度HCMV啟動子+外顯子1下游，以及兔P-球蛋白多腺苷 酸化信號上游的、從HIV-1分化體B菌抹HXB2獲得的密碼子優化 的失活RT、截短的Nef和密碼子優化的gag基因的pl7/p24部分。構建體內基因的順序通過PCR擴增來自p73i-Tgrn的RT-trNef和 pl7p24基因而獲得。進行兩個DNA片段的PCT連接反應，其3kb的 產物經凝膠純化，并用Notl/BamHI酶切，然后與Notl/BamHI消化的 p7313ie進行連接，產生p73ITrng (#11 )引物RTw229k-trNef RT3-u:lGAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTG AAACCCGGGAT [SEQ ID NO: 42]AS曙Nef-pl7p24opt接頭CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG [SEQ ID NO: 43]pl7p24 S-pl7p24optATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG [SEQ ID NO: 44]AS-pl7p24opt (BamHI)GATGGGGGATCCTCACAACACTCTGGCTTTGTGTCC [SEQ ID NO: 45]用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產物和連接的PCR條 件如下1 x[94。C (30秒)]25x[94。C (30秒)/55°C ( 30秒)/72°C ( 120秒(基因的PCR) 或180秒(連接)]1 x [72 °C ( 240秒)]PCR接合產生的3000bp產物經凝膠純化，用Notl和BamHI酶切， 經PCR凈化后，連接到Notl/BamHI消化的、凝膠純化的p7313ie中， 以產生p73i-Tngr。實施例18: p73i-Tgnr ( #fl )感興趣的基因Iowa長度HCMV啟動子+外顯子1下游以及兔P-球蛋白多腺苷酸 化信號上游的、從HIV-1分化體B菌林HXB2獲得的密碼子優化的 gag的pl7/p24部分、截短的Nef和密碼子優化的失活RT基因。構建體內基因的順序通過PCR分別擴增來自質粒p73I-GN2和 p73I-RTw229k的pl7p24-trNef和RTw229k來獲得。其對PCR產物進 行PCT連接反應，經凝膠純化，并用Notl/BamHI酶切后，與 Notl/BamHI消化的p7313ie進行連接。在序列(pl7p24和RT )中發 現兩個序列錯誤，隨后這種錯誤通過利用多蛋白中的限制性位點用正 確的基因部分進行取代而得到修復。(見圖19)引物Dl7p24-trNef PCR S國pl7p24optATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG [SEQ ID NO: 46〗
AS-Nef-coRT接頭
GATGGGACTGATGGGGCCCATGCAGTTCTTGAACTAC1，CCGG
SEQ ID NO: 47〗
RTw229k S-coRT
ATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAG [SEQ ID NO.* 48]
RT3-1:1
GAMTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTG CTCGTTGCCGC [SEQ ID NO: 49
用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產物和連接的PCR條 件如下
lx[94。C (30秒)]
25 x [ 94°C ( 30秒)/55°C ( 30秒)/72°C ( 120秒(PCR)或180 秒(連接)]
1 x[72。C ( 240秒)]
3000bp的產物經凝膠純化，用Notl和BamHI酶切，經PCR凈化 后，連接到Notl/BamHI消化的、凝月交純化的p7313ie中，以產生 p73i-Tngr。序列測定揭示pl7p24的密碼子不是完全優化的，進而用 Agel/Munl將編碼區中的一個700bp的片革殳切掉，并用來自含有正確 編碼序列的p73i-Tgrn#3的Muni/Age片段取代。該多蛋白還含有一個 點突變(G2609A),導致多蛋白的RT部分中產生Thr改變成Ala的 氨基酸取代。該突變通過Apal/BamHI消化構建體并經PCR凈化而除 去突變的序列，并用來自p73i-Tgnr的RT的Apal/BamHI消化部分連 接而取代該序列而得到校正。
實施例19:
制備用于"基因槍"DNA藥筒(cartridges)的質粒包被"金漿液"質粒DNA (大約liug/pl),例如100iug,和2ium的金顆粒，例如 50mg( PowderJect),懸浮于例如100|ul的0.05M的亞精胺中(Sigma )。 通過力口入例如100|ul 1M的CaCl2 ( American Pharmaceutical Partners, Inc., USA)使DNA沉淀到金顆粒上。該DNA/金顆粒復合物在室溫 下保持10分鐘，用無水乙醇洗滌3次，例如3 x1ml,(事先在分子 篩3A (BDH)上干燥)。樣品重懸浮于含有0.05mg/ml的聚乙烯吡咯 烷酮(PVP, Sigma)的無水乙醇中，并將其分成三等份于1.5ml的顯 微離心管中(Eppendorf)。該等分試樣分別用于(a)"金漿液"的 分析，(b )洗出液_從(a )洗提出的質粒的分析和(c )制備用于"基 因槍，，的包被乙烯-四氟乙烯共聚物(Tefzel)藥筒的金顆粒/質粒(見 下文的實施例3)。為了制備樣品(a)和(b),含有質粒DNA/乙醇 中的"金漿液"/PVP的離心管在Eppendorf 5418顯微離心機中高速旋 轉2分鐘，除去上清液，"金漿液"在室溫下干燥10分鐘。樣品(a) 在TE pH 8.0中重懸浮到質粒DNA為0.5-1.0jug/|al，假定大約50%被 包被。對于洗出液，樣品(b)在TE pH 8.0中重懸浮到質粒DNA為 0.5-1.0|ug/|Lil，并在37。C溫育30分鐘，激烈搖動，然后在Eppendorf 5418 顯微離心機中高速旋轉2分鐘，其上清液、洗出液被除去后，儲藏在 -20°C。洗提的精確DNA濃度用Genequantll (Pharmacia Biotech)通 過分光光度法定量測定。
實施例20
用于DNA免疫的藥筒的制備
如以前所描述的制備用于Accell基因轉移裝置的藥筒(Eisenbraun 等，DNA和細胞生物學(DNA and Cell Biology) , 1993 vol 12 No 9, 791-797頁；Pertner等)。簡而言之，質粒DNA被包被到2 ju m的金 顆粒上(DeGussaCorp., South Plainfield, N丄，USA)并裝載到Tefzel 管中，該管隨后被切成1.27cm長以用做藥筒，并在4。C下干燥儲存直 至使用。在典型的疫苗接種中，各個藥筒含有0.5mg被包被的金顆粒， 總量為0.5lugDNA/藥筒。
實施例21:
42用位于兩個載體中的核酸所編碼的抗原接種小鼠(11=3/組)。P7077 利用包含內含子A和外顯子I的HCMVIE啟動子(fcmv啟動子)。 P73I產生相同的抗原，但包含的是缺乏內含子A而包括外顯子1的 HCMVIE啟動子(icmv啟動子)。
質粒被給予到Fl (C3HxBalb/c)小鼠的腹部皮膚切開的耙位點。 在第O天，對小鼠以2x0.5 jug DNA進行最初免疫，在第35天用2 x0.5jugDNA進行力口強免疫，在第40天時用IFN畫yElispot檢測細胞 反應。
:載體 :載體
GRN - (fCMV啟動子)Gag， RT, Nef
GRN - (iCMV啟動子)Gag， RT, Nef
GR3N - ( CMV啟動子)優化的Gag,優化的RT,
P73I
P7077
P7077
P73I
P73I
工
工'
Nef
P7077 P73I
GN GN
(fCMV啟動子)Gag, Nef (iCMV啟動子)Gag, Nef
細胞毒素T細胞反應
細胞毒素T細胞反應通過對5天后收集的脾細胞用CD8+ T細胞-限制性IFN-yELISPOT進行分析來評估。經頸部離位殺死小鼠，將脾 收集到水冷的PBS中。將梳理出脾細胞放入磷酸緩沖鹽溶液中(PBS), 隨后溶解紅血細胞(在含有155mM NH4C1、 10mM KHC03、 O.lmM EDTA的緩沖液中1分鐘)。用PBS洗滌兩次除去顆粒物質后，單個 細胞懸浮液按等分放入事先用俘獲的IFN-y抗體包被的ELISPOT平 板中，并用CD8-限制性同源肽(Gag、 Nef或RT)刺激。過夜培養后， 加入抗-小鼠IFN-y-生物素標記抗體(Pharmingen)繼而加入鏈霉抗 生物素-偶聯的堿性磷酸酶即可觀察到產生ifn-y的細胞，用圖象分析 進行定量測定。
該實驗結果顯示于圖20、 21和22中。實施例22:
疫苗構建體的免疫原性
1. 細胞實驗
細胞免疫反應包括細胞毒素CD8細胞和輔助CD4細胞。4企測特 異性CD8和CD4細胞的靈敏方法是ELIspot分析，它可用于定量測定 能夠分泌干擾素-y或IL-2的細胞。ELIspot分析基于俘獲的從各個細 胞分泌的細胞因子。簡而言之，特化的微量滴定板用抗-細胞因子抗體 包被。從免疫動物分離的脾細胞與含有已知表位(CD8)或蛋白(CD4) 的特異性肽一起培養過夜。如果細胞經刺激釋放細胞因子，它們將在 滴定板表面上各個產生細胞的位置周圍與抗體結合。在細胞被溶解和 洗滌平板后，細胞因子仍然保持與包被抗體結合。該分析利用生物素/ 抗生物素蛋白擴增系統、以與ELISA分析相似的方式進行。斑點的數 量與細胞因子產生細胞的數量相等。
對6個構建體均記錄了可對如下K2d-限制性小鼠表位Gag (AMQMLKETI) 、 Nef ( MTYKAAVDL )和RT ( YYDPSKDLI)發 生反應的CD8細胞數量，以及可對Gag和RT蛋白發生反應的CD4 細胞數量。這些實驗的結果經統計學分析，且根據構建體的免疫原性 進行分級。結果顯示于圖23中。
2. 體液實馬全
從兩個實馬全中進行加強免疫后7和14天，收集血液樣品用于抗體 分析。分離血清并水凍儲存直到可以用特異性ELISA分析測定抗體的 滴定度。檢測了所有樣品對Gag、 Nef和RT的抗體。簡而言之，ELISA 平板用相關蛋白包被。洗去多余的蛋白質后，將稀釋的血清樣品加入 到加樣孔中進行培育。洗去血清樣品，加入與適當的tag偶聯的抗小 鼠抗血清。培養平板并在平板讀出器上讀取數據。結果顯示于圖24 中。
3. 抗體數據
在四個實驗中測定了所有六個構建體的抗體滴定度。構建體 p73i-GNR始終對Gag不產生抗體反應，對Nef產生有限的抗體反應。
44其原因不清楚，由于分離自同一小鼠的脾細胞中觀察到T-細胞反應，
表明Gag蛋白是體內表達的。
產生Gag特異性抗體的等級如下 RNG〉GRN>NRG>RGN>NGR>GNR
分析細胞免疫數據
該目的是在3個免疫學實驗中根據點記數資料對6個構建體進行 分級。按下述三類反應進行評估
在第7天(初次免疫始后7天)CD8對Gag、 Nef和RT發生反應， 第35天(加強免疫后7天)CD4對Gag和RT發生反應， 第35天(加強免疫后7天)CD8對Gag、 Nef和RT發生反應。 每個反應(例如CD8對Gag的反應)使用SAS第8版中的線性 混合效果模型進行模擬。不管具體的抗原(Gag、 Nef或RT)存在與 否，管IL-2存在與否，該模型包括構建體的固定效果。另外，對 于CD8的反應，其數據可從各個小鼠獲得，受檢者作為隨機效果被包 含于模型中。所述模型包括相互作用以考慮到構建體在抗原(存在/
缺乏)和IL-2 (存在/缺乏)之間的各個組合中的不同效果。
通過模型，在抗原(存在/缺乏)和IL-2 (存在/缺乏)的各個 組合中，分別評估了各個構建體和p7313 (對照組)之間的校正平均 反應的差異，及p值以顯示差異是否具有統計顯著性。基于抗原存在 而IL-2缺乏時的差異和p值，對構建體進行分極，即具有最大差異的 構建體的值為6，其次為5等，但是對于其差異在5%的水平上差異不 顯著的任何構建體均為0。
模型假定一一殘差隨常數方差正態分布，使用圖解方法和靈敏度 分析進行評估，其中首先對反應取對數，接著取平方根而將反應轉換 模型值。構建體的等級對與模型假定的背離不敏感。
分別計算了各個實驗中的各個反應的等級，對于所有3個實驗中 計算了 3類反應的等級之和。下表顯示了 3個實驗總的等級之和。
結合3個免疫學實驗，3類反應中各個反應的構建體的等級之和。構建體第7天(初次免疫后7天)第35天(加強后7天)
CD8CD4CD8
GRN5183
GNR172428
RGN282333
RNG252737
NRG25190
NGR41410
在第35天時，對于兩類反應而言RNG具有最高的等級。而第二 高的等級是第7天的RGN。在第35天，對于兩組反應而言RGN也都 顯示了比較高的等級。
權利要求
1. 一種核苷酸序列，編碼HIV-1gag蛋白或其含有gag表位的片段，以及第二HIV抗原，或編碼所述第二HIV抗原的表位的片段，并與異源啟動子可操作地連接。
2. 如權利要求1所述的核苷酸序列，其中所述第二抗原選自Nef 或其含有nef表位的其片段，或反轉錄酶(RT)或其含有RT表位的 片段。
3. 如權利要求1或2所述的核苷酸序列，其中所述gag蛋白包含pl7。
4. 如權利要求3所述的核苷酸序列，其中所述gag蛋白還包含p24。
5. 如權利要求1-4中任何一項所述的核苷酸序列，其中對所述gag 序列進行密碼子優化以與高度表達的人類基因中的密碼子利用率相 似。
6. 如權利要求1-5中任何一項所述的核苷酸序列，其中所述序列編 碼HIV-1 gag蛋白或含有gag表位的片段、nef蛋白或含有nef表位的 片段、以及RT蛋白或含有RT表位的片段，優選順序為RT、 Gag、 Nef或RT、 Nef、 Gag。
7. 如權利要求2-6中任何一項所述的核苷酸序列，其中對所述RT序列或其片段進行密碼子優化以與高度表達的人類基因相似。
8. 如權利要求1-7中任何一項所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸 序列編碼nef蛋白或其表位。
9. 一種核苷酸序列，選自 Gag (pl7, p24) ， Nef截短物.Gag ( p17, p24 )(密碼子優化的)，Nef (截短物) Gag (pl7, p24) , RT、 Nef (截短物).密碼子優化的Gag ( p17, p24 ) ， RT, Nef (截短物) 密碼子優化的Gag (pl7, p24),密碼子優化的RT, Nef截短物.RT (密碼子優化的)，密碼子優化的Gag ( p17， p24 ) , Nef截短物.RT(密碼子優化的)，Nef截短物，gagpl7，密碼子優化的p24。
10. 如權利要求1-9中任何一項所述的核普酸序列，其中所述異源 啟動子是HCMV IE基因的啟動子。
11. 如權利要求10所述的核普酸序列，其中所述啟動子的5，端含 有外顯子1。
12. —種含有如權利要求1-11中任何一項所述的核苷酸序列的載體。
13. —種如權利要求12所述的載體，其中所述載體是雙鏈DNA質粒。
14. 一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有如權利要 求1-11中所述的核苷酸序列或權利要求12或13中所述的載體以及藥 用的賦形劑、稀釋劑、載體或佐劑。
15. 如權利要求14所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物適合 于肌肉內或皮內給藥。
16. 如權利要求14或15所述的藥物組合物，其中所述載體是金小珠。
17. —種皮內給藥裝置，其中含有權利要求14、 15或16所述的藥 物纟且合物。
18. —種治療患病或易感疾病的患者的方法，包括給予安全和有效 量的如權利要求14-16中任何一項所述的藥物組合物。
19. 如權利要求1-11中任何一項所述的核苷酸序列、如權利要求 12或13所述的載體、或如權利要求14-16中任何一項所述的組合物 在藥物中的用途。
20. 權利要求1-11中任何一項所述的核苷酸序列在生產治療疾病的藥物中的應用。
21. —種生產如權利要求1-11中任何一項所述的核苷酸的方法，包 括將編碼HI V-1 gag蛋白或其片段以及第二 HIV蛋白或其片段的核苷 酸序列與異源啟動子序列可操作地連接。
全文摘要
本發明涉及疫苗。本發明提供的核苷酸序列，編碼了HIV-1gag蛋白或其含有gag表位的片段以及第二HIV抗原，或編碼所述第二HIV抗原表位的片段，并與異源啟動子可操作地連接。優選的核苷酸序列進一步編碼nef或其片段和RT或其片段。
文檔編號A61K39/00GK101255434SQ200810090890
公開日2008年9月3日 申請日期2002年9月18日 優先權日2001年9月20日
發明者A·利爾, A·貝頓, C·A·范維利, G·W·古, J·P·蒂特, P·F·埃爾特爾 申請人:葛蘭素集團有限公司