疫苗的制作方法

疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明提供用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是免疫學活性皂苷。
【專利說明】疫苗【技術領域】
[0001] 本發明提供了用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，其包含抗原和佐劑，其中佐劑是免疫學活性皂苷和/或TLR-4激動劑。
_2] 發明背景
無論是接觸抗原免疫還是加強免疫，一般均存在增加患者對疫苗接種的依從性，以及提高疫苗生產和運輸的易用性的需要。皮膚免疫可解決這些需求的一些，并且可以用于與佐劑組合施用抗原，以誘導抗原特異性免疫應答。
[0003]發明概沭
本發明的目標是在對象中刺激針對疫苗的免疫應答。所述疫苗包含免疫原性組合物并且皮膚施用，所述免疫原性組合物包含抗原和佐劑。
[0004]免疫原性組合物中的佐劑是免疫學活性皂苷和/或TLR-4激動劑。
[0005]附圖簡沭
圖1:小鼠抗原特異性IgG
圖2A =IFN- Y、TNF- a、IL-2三者陽性的CD4 T細胞(小鼠數據)
圖2 B =IFN- Y、TNF- a、IL-2三者陽性的CD8 T細胞(小鼠數據)
圖3:小鼠抗原特異性IgG
圖4 A =IFN- Y、TNF- a、IL-2三者陽性的CD4 T細胞(小鼠數據)
圖4 B =IFN- Y、TNF- a、IL-2三者陽性的CD8 T細胞(小鼠數據)
圖5:尤卡坦微型豬的免疫原性數據 圖6:家豬(在接觸抗原和加強方案中的免疫原性)。
[0006]發明詳沭
本發明提供了用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是免疫學活性皂苷和/或TLR-4激動劑。
[0007]在另一個實施方案中提供了包含一種或多種抗原和佐劑的免疫原性組合物在制備用于皮膚免疫的藥物中的用途，其中所述佐劑是免疫學活性皂苷和/或TLR-4激動劑。
[0008]在另一個實施方案中提供了皮膚免疫的方法，其包括給對象皮膚應用包含一種或多種抗原和佐劑的免疫原性組合物的步驟，其中所述佐劑是免疫活性皂苷和/或TLR-4激動劑。
[0009]本文所用的術語皮膚地意指應用抗原進入到人類皮膚的真皮和/或表皮。本發明尤其利用用于皮膚免疫的遞送系統，其誘導動物或人中的免疫應答，盡管也涵蓋了常規的施用方法。
[0010]包含至少一種抗原和佐劑(其中所述佐劑是免疫學活性皂苷和/或TLR-4激動劑)的免疫原性組合物的皮膚應用可以通過使用本領域技術人員已知的任何皮膚方法進行，其包括但不限于使用短針裝置(包括約I至約2_長度的針的裝置)遞送或使用皮膚貼劑遞送。
[0011]用于與本文所描述的皮膚疫苗使用的合適的裝置包括短針裝置，例如在US4，886，499、US5, 190，521、US 5，328，483、US 5，527，288、US 4，270，537、US 5，015，235、US5，141, 496,US 5，417，662和EP1092444中描述的那些。皮膚疫苗也可通過限制針進入皮膚的有效穿透長度的設備施用，所述裝置諸如在W099/34850 (其通過引用并入本文)中描述的那些，以及它們的功能等同物。還合適的是，通過液體噴射注射器或通過刺穿角質層并產生到達真皮的噴射的針遞送液體疫苗到真皮的噴射注射裝置。噴射注射裝置描述于，例如US5, 480, 38UUS 5, 599, 302,US 5,334，144,US 5, 993, 412,US 5, 649, 912,US 5,569，189,US5, 704, 91UUS 5, 383, 85UUS 5, 893, 397,US 5, 466, 220,US 5,339，163,US 5, 312, 335,US
5,503, 627,US 5, 064, 413,US 5, 520, 639,US 4, 596, 556,US 4, 790, 824,US 4, 941, 880,US4，940, 460、WO 97/37705和WO 97/13537。同樣合適的是使用壓縮氣體以加速粉末形式的疫苗通過皮膚的外層到真皮的彈道粉末/顆粒遞送裝置。此外，常規注射器可以在皮膚施用的經典曼托法(mantoux method)中使用。然而,使用常規注射器需要高度熟練的操作人員，并且因此能夠在沒有高度熟練的使用者的情況下準確地遞送的裝置是優選的。因此，在一個實施方案中，提供了本發明的用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物不通過使用常規的注射器的曼托法施用。
[0012]在本發明的具體實施方案中，提供了包含如本文所描述的本發明的免疫原性組合物的貼劑。該貼劑將一般包括背板，其包括固體基質(如閉塞性或非閉塞外科敷料)。本發明的貼劑遞送本發明的抗原和佐劑到真皮或表皮。因此，本發明的貼劑包含一個或多個適合于遞送本發明的免疫原性組合物到表皮或真皮的微突出(microprojection)。在本發明的一個實施方案中，所述一個或多個微突出在IOMm和2mm之間，例如20Mm至500Mm、30Mm至 lmm、100 至 200,200 至 300,300 至 400,400 至 500,500 至 600,600 至 700、700、800、800至900、100|^至400|^，尤其在約200Mm和300Mm之間或在約150Mm和250Mm之間。
[0013]在具體實施方案中，本發明的貼劑包含多個微突出。在具體實施方案中，本發明的貼劑包含在2和5000個之間的微針，例如在1000和2000個之間的微突出。
[0014]在具體實施方案中，所述微突出分開約50Mm和1000Mm之間的距離。
[0015]所述微突出可以是適合于刺穿角質層、表皮和/或真皮，和遞送抗原和佐劑到表皮或真皮的任何形狀。微突出可以做成如在例如W02000/074765和W02000/074766中所公開的形狀。所述微突出可以具有至少3:1 (高度對基底處的直徑)，至少約2:1或至少約1:1的高寬比。對于微突出的具體優選的形狀是具有多邊形的底部，例如六邊形或菱形的椎體。其它可能的微突出形狀顯示于，例如美國公開的專利申請2004/0087992。在具體實施方案中，本發明的微突出具有朝向基底變厚的形狀。
[0016]陣列中微突出的數目優選至少約100、至少約500、至少約1000、至少約1400、至少約1600或至少約2000。鑒于它們小的尺寸，微突出的面積密度不可以特別高，但是例如每平方厘米的微突出的數目可以是至少約50、至少約250、至少約500、至少約750、至少約1000或至少約1500。
[0017]在本發明的一個實施方案中，本發明的抗原和佐劑在將貼劑置于宿主的皮膚上的5小時內，例如4小時、3小時、2小時、2小時或30分鐘內遞送到宿主。在本發明的具體實施方案中，本發明的抗原和佐劑在放置皮膚貼劑20分鐘內，例如30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或 19 分鐘內遞送。
[0018]所述微突出可以由本領域技術人員已知的任何合適的材料制成。在具體實施方案中，至少部分微突出是生物可降解的，尤其是在微突出的最外層的微突出的頂端。在具體實施方案中，基本上所有的微突出是生物可降解的。如本文所用術語“生物可降解的”指在體內使用(例如插入皮膚)的預期條件下可降解，而無論生物降解機制如何。生物降解的示例性的機制包括崩解、分散、溶解、腐蝕、水解和酶促降解。通過基本上所有，其指至少70%的微突出是生物可降解的，例如至少75%、80%、85%、90%或至少95%是生物可降解的。
[0019]在具體實施方案中，生物可降解的微突出包含生物可降解的聚合物。例如，合適的生物相容的，生物可降解的或生物可腐蝕的聚合物包括聚(乳酸)(PLA)，聚(乙醇酸)(PGA)，聚(乳酸-共-乙醇酸)類(PLGAs)，聚酐類，聚原酸酯類，聚醚酯類，聚己內酯(PCL)類，聚酯酰胺類，聚(丁酸)，聚(戊酸)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA )，聚乙二醇(PEG), PEG-PLA、PEG-PLA-PEG、PLA-PEG-PLA、PEG-PLGA, PEG-PLGA-PEG、PLGA-PEG-PLGA、PEG-PCL、PEG-PCL-PEG、PCL-PEG-PCL的嵌段共聚物，乙二醇-丙二醇-乙二醇的共聚物(PEG-PPG-PEG,商品名Pluronic?或泊洛沙姆?),葡聚糖，輕乙基淀粉(hetastarch),四聚淀粉(tetrastarch),五聚淀粉(pentastarch),輕乙基淀粉類(hydroxyethyl starches),纖維素，羥丙基纖維素(HPC)，羧甲基纖維素鈉(Na CMC)，熱敏HPMC (羥丙基甲基纖維素)，聚磷腈，羥乙基纖維素(HEC)，其它多糖類，多元醇類，明膠，藻酸鹽，脫乙酰殼多糖，透明質酸及其衍生物，膠原蛋白及其衍生物，聚氨酯類，和這些聚合物的共聚物和共混物。優選的羥乙基淀粉可以具有0-0.9范圍中的替換度。
[0020]在具體實施方案中，微突出的生物可降解部分包含抗原和/或佐劑。所述抗原和/或佐劑可以見于不同的微突出，例如分別約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%的微突出可以包含抗原和10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%的微突出可以包含佐劑。在具體實施方案中，提供了包含一個或多個，尤其是多個生物可降解的包含如本文所述免疫原性組合物的微突出的貼劑。包含活性物諸如抗原的微突出的實例公開于W02008/130587和W02009/048607。可代謝的微針的制造方法公開于W02008/130587和W02010/124255。
[0021]在進一步的實施方案中，所述佐劑和抗原包被在一個或多個微突出上。包被可以通過任何本領域技術人員已知的方法進行，例如通過公開于W006/055844，W006/055799的方法。
[0022]所述抗原和/或佐劑可以包被在不同的微突出上，分別約90%、80%、70%、60%、50%、40%,30%的微突出可以包被有抗原并且10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%的微突出可以包被有佐劑。
[0023]本發明的貼劑可以通過任何手段應用于佩帶者的皮膚，例如通過用手將貼劑置于皮膚上。在具體實施方案中，本發明的貼劑使用敷料器應用于皮膚，例如W02008/091602中所述輔料器。具體而言，所述應用包括用于保證所述貼劑已經以足夠的壓力施加到皮膚以保證一個或多個微突出刺穿角質層、表皮和/或真皮的手段，例如當已施加了足夠的壓力時發出可聽到的聲音的裝置。
[0024]本發明的貼劑還可以包含膠粘劑以幫助貼劑在釋放/遞送抗原和佐劑進入真皮和/或表皮期間保留在皮膚 上。
[0025]本發明的免疫原性組合物包含抗原和佐劑兩者。佐劑是免疫原性組合物的組分，其幫助誘導對抗原的免疫應答。在本發明中，所述用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，包含佐劑，其是免疫學活性皂苷和/或TLR-4激動劑。[0026]用于在本發明中使用的免疫學地特別合適的皂苷是Quil A及其衍生物。QuilA是從南美樹木石堿木(Qui llaja Saponaria Molina )分離的阜苷制備物，并且首先由 Dalsgaard 等人在 1974 年(“Saponin adjuvants，，，Archiv.fiir die gesamteVirusforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, p243_254)描述為具有佐劑活性。Quil A的純化的片段已通過HPLC分離，其保留佐劑活性而無Quil A相關的毒性(EP O 362278)，例如QS7和QS21(也稱為QA7和QA21)。QS-21是衍生自石堿木的樹皮的天然皂苷，其誘導⑶8+細胞毒性T細胞(CTLs)、Thl細胞和主要的IgG2a抗體應答并且在本發明的背景下是優選的皂苷。在本發明的具體實施方案中，免疫學活性的皂苷是QS21。具體而言，基本上純的形式的QS21，也就是說，QS21是至少90%純，優選至少95%純和最優選至少98%純。在本發明的具體實施方案中，QS21用留醇配制。優選的留醇包括β_谷留醇、豆留醇、麥角甾醇、麥角鈣化留醇與膽固醇。這些留醇是本領域熟知的，例如膽固醇公開于默克索引，第11版，第341頁，作為在動物脂肪中發現的天然存在的留醇。在本發明的具體實施方案中，所述留醇是膽固醇。在本發明的具體實施方案中，QS21與膽固醇的比例是在1:100和1:1之間，具體在1:2和1:10之間，例如1:5。
[0027]TLR-4激動劑是Toll樣受體4的激動劑，后者是Toll樣受體家族的成員。這是熟知的受體家族，其所有均在某種程度上參與免疫應答。在一個實施方案中，所述TLR-4激動劑是脂多糖，合適地脂質A的非毒性衍生物，具體是單磷酰脂質A或更具體是3-脫酰基單磷酰脂質A (3D-MPL)。
[0028]3D-MPL 以名稱 MPL 由 GlaxoSmithKline Biologicals N.A.銷售，并且在整個文獻中稱為MPL或3D-MPL。參見，例如美國專利號4，436，727、4，877，611,4, 866，034和4，912，094。3D-MPL主要促進具有IFN-g (Thl)表型的CD4+ T細胞應答。3D-MPL可以根據GB 2 220 211 A中公開的方法生產。化學上，其是具有3、4、5或6條酰化鏈的3-脫酰基單磷酰脂質A的混合物。
[0029]可用于本發明中的其它TLR-4激動劑是氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)，其是可從GlaxoSmithKline Biologicals S.A.獲得的合成的TLR-4激動劑。合適的實例是在W098/50399或美國專利號6303347中公開的那些(用于制備AGP的方法也被公開)，合適地如在美國專利號6764840中公開的RC527或RC529或AGPs的藥學可接受的鹽。
[0030]在一個實施方案中，所述免疫原性組合物包含如本文所定義的免疫學活性皂苷和/或TLR-4激動劑并且無其它佐劑。在另一個實施方案中，所述免疫原性組合物包含TLR-5激動劑和一種或多種其它佐劑。在此實施方案的一個方面，所述一種或多種其它佐劑選自如本文所述的TLR-4激動劑，TLR-5激動劑、TLR7/8激動劑和如本文所述的免疫學活性的皂苷級分。
[0031]所述TLR-5激動劑可以是鞭毛蛋白或保留TLR-5激動劑活性的鞭毛蛋白的片段。所述鞭毛蛋白可以包括選自下列的多肽:幽門螺旋桿菌0? pylori),鼠傷寒沙門菌(5:iTpAi皿ria?)、霍亂弧菌(V.)、粘質沙雷氏菌(51 marcesens)、福氏痢疾桿菌(51flexneri)、梅毒螺旋體(T.palIidum)、肺炎軍團菌pneumophilia)、伯氏疏螺旋體(B.burgdorferei)、艱難梭狀芽孢桿菌iC.difficile)、苜猜根瘤菌iR.meIiloti)、羽扇豆根瘤菌0?.、卡氏巴爾通體(漢c7arr1、奇異變形桿菌0°.、枯草芽胞桿菌(B.、 單核細胞增生李斯特菌(L.、銅綠假單胞菌(P.aerwgifliosa)和大腸桿菌 C￡ coif)。
[0032]在具體實施方案中，所述鞭毛蛋白選自鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白B (Genbank登錄號AF045151)、鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白B的片段、大腸桿菌FliC (Genbank登錄號AB028476)、大腸桿菌FliC的片段、鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC (ATCC14028)和鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC的片段。
[0033]在具體實施方案中，所述TLR-5激動劑是如在W02009/156405中所述的截短的鞭毛蛋白，即其中高變結構域已被缺失的鞭毛蛋白。在此實施方案的一個方面，所述TLR-5激動劑選自 FliCA174_4(l(l、FliCM61_4Q5 和 FliC.,。
[0034]在進一步的實施方案中，所述TLR-5激動劑是如W02009/128950中所述的鞭毛蛋白。
[0035]如果TLR-5激動劑是鞭毛蛋白的片段，可以理解所述片段將保留TLR5激動劑活性并且必須因此保留對TLR-5激活負責的其序列部分。本領域技術人員知道鞭毛蛋白的NH2和COOH末端結構域對于TLR-5相互作用和激活是重要的，尤其例如沙門氏菌中氨基酸86-92。
[0036]TLR7和8是toll樣受體家族的進一步的成員。作為TLR7受體或TLR8受體或兩者的激動劑的小分子是已知的。TLR7/8激動劑指可以激動(agonise) (B卩，增加)TLR7受體或TLR8受體或兩者受體的信號傳導的分子。因此在一方面，TLR7/7配體是作為TLR7激動劑而非TLR8激動劑的分子。在另一方面，TLR7/8配體是TLR8激動劑而非TLR7激動劑。在進一步的方面，TLR7/8配體作為TLR7和TLR8受體兩者的激動劑發揮作用。合適的TLR7/8配體可以見于，例如 W020 10/018133、W02010048520、W02010/018134、WO 2008004948、WO2007034882 和 WO 2005092893。
[0037]在本發明進一步的方面，提供了包含一種或多種抗原和佐劑的免疫原性組合物，其用于皮膚免疫，其中所述佐劑是一種或多種TLR激動劑。在具體實施方案中，所述TLR激動劑是TLR-2激動劑或TLR7和/或TLR8激動劑。
[0038]在本發明的具體實施方案中，所述TLR激動劑是TLR2激動劑(Satooe等，JI2003 pl630-5)。合適地，能夠導致通過TLR-2的信號傳導應答的TLR激動劑是來自結核分枝桿菌(M tuberculosis')、似氏疏螺旋體、梅毒螺旋體的脂蛋白、肽聚糖、細菌脂肽；來自包括金黃色葡萄球菌的物種的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏菌孔蛋白、細菌菌毛、耶爾森氏菌毒力因子、CMV病毒顆粒、麻疹血凝素和來自酵母的酵母聚糖中的一種或多種。在本發明的具體實施方案中，所述TLR2激動劑是合成的脂肽Pam3Cys-Lip(參見，例如Fisette 等，Journal of Biological Chemistry 278(47) 46252)。
[0039]在可選的實施方案中，使用能夠導致通過TLR-7的信號傳導應答的TLR激動劑(Sabroe等，JI 2003 pl630_5)。合適地，所述能夠導致通過TLR-7的信號傳導應答的TLR激動劑是單鏈RNA(ssRNA)、洛索立賓、在位置N7和C8的鳥苷類似物或咪唑喹啉化合物，或其衍生物。在一個實施方案中，所述TLR激動劑是咪喹莫特。進一步的TLR7激動劑描述于W002085905。
[0040]在可選的實施方案中，使用能夠導致通過TLR-8的信號傳導應答的TLR激動劑(Sabroe等，JI 2003 pl630_5)。合適地，能夠導致通過TLR-8的信號傳導應答的TLR激動劑是單鏈RNA (ssRNA)，具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如瑞喹莫德(R848);雷西莫特也能夠被TLR-7識別。可以使用的其它TLR-8激動劑包括在W02004071459中描述的那些。
[0041]在一個實施方案中，提供了本發明的免疫原性組合物，其中TLR7/8激動劑，咪唑喹啉分子，尤其是共價連接到磷脂或膦脂(phosphonolipid)基團的咪唑喹啉。在具體實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含CRX642 (參見W02010/048520)。
[0042]如本文進一步討論的，對于本領域技術人員顯而易見的是，在抗原制劑中可以存在一些天然佐劑，如果這些制劑是包含天然病原體相關分子模式的活的減毒病毒或殺死的全病毒。在此背景下，術語“無其它佐劑”不意在排除在一些抗原性制劑中發現的那些天然佐劑，但是意在指無進一步的佐劑特別添加到免疫原性組合物。
[0043]在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物用于皮膚初次免疫。在另一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物用于在對象中皮膚加強免疫，所述對象已經通過非經皮途徑(如舌下、鼻內或肌內)接受初次免疫。在又一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物可以提供皮膚初次免疫和皮膚加強免疫。
[0044]術語初次免疫意在指對象接受針對具體病原體的首次疫苗接種過程。例如，在UK疫苗接種計劃中，嬰兒在13個月齡時針對麻疹、腮腺炎和風疹免疫(初次免疫)。他們在3歲零4個月年齡時針對相同的病原體再次接種疫苗(加強免疫)。在乙型肝炎領域可以見到另一個實例。需要接種疫苗的人(成人或嬰兒)在0、1和6個月給予三次疫苗劑量的初始計劃(primary schedule)(初次免疫)。如果有必要，(例如，按照加速的初始計劃，或抗體滴度已下降)在初始 疫苗接種之后在I歲或5歲可以給予另一次疫苗接種(加強免疫)。進一步的實例可以見于所謂的“DTP”疫苗一白喉、破傷風、百日咳疫苗。通常，初次破傷風和白喉免疫在生命的第一年期間以兩個劑量進行。根據國家，在第二年期間和/或在4歲和10歲年齡之間施用加強劑量。
[0045]本領域充分理解術語抗原是指產生免疫應答的試劑。所述抗原可以是能夠引起人或動物中免疫應答的一種或多種蛋白、多糖、肽、核酸、蛋白-多糖綴合物、分子或半抗原。可選地，所述抗原可以是全病原體，例如減毒的或滅活的病原體。全的滅活的病原體可以進一步拆分，例如拆分的流感病毒。在本發明的一個實施方案中，抗原衍生自甲型肝炎病毒和/或乙型肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒表面抗原)。在本發明的另一個實施方案中，抗原衍生自人乳頭瘤病毒。在本發明的另一個實施方案中，抗原是煙堿，或其衍生自煙堿。在本發明的另一個實施方案中，抗原衍生自登革熱病毒。在本發明的另一個實施方案中，抗原衍生自呼吸道合胞病毒(RSV)。在另一個實施方案中，所述抗原與阿爾茨海默氏病有關。在另一個實施方案中，所述抗原衍生自導致麻疹、腮腺炎、風疹或其組合的病毒。在另一個實施方案中，所述抗原衍生自水痘-帶狀皰疫病毒(VZV)。在另一個實施方案中,所述抗原衍生自腫瘤相關的抗原(例如，MAGE和/或PRAME)。在另一個實施方案中，所述抗原衍生自引起人類痕疾的寄生蟲，尤其是惡性痕原蟲O0Za1SwotZiiffl? falciparum")和/或間日痕原蟲{Plasmodium vivax)?在另一個實施方案中，所述抗原衍生自巨細胞病毒(CMV)。
[0046]如果本發明的免疫原性組合物用作加強免疫，則初次免疫可以是佐劑化的或未佐劑化的。顯而易見的是，一些疫苗天然包含佐劑，例如活的減毒的或殺死的病毒疫苗將保留在原始病原體中發現的一些病原體相關的分子模式(PAMPS)。當初次免疫是“未佐劑化的”時，此術語意在指所述初次免疫在除了可以在抗原制劑中存在的那些之外不包含任何佐劑。
[0047]在本發明的一個具體實施方案中，所述初次免疫是佐劑化的(B卩，已經摻入抗原制劑中可以是天然存在的那些之外的佐劑)。佐劑是本領域理解的術語，指幫助誘導對抗原的免疫應答的組分。可用于初次接種的佐劑是，例如金屬鹽、TLR調節劑、水包油乳液、脂質體免疫原性組合物、皂苷佐劑或這些的任何組合。
[0048]在一個實施方案中，在初次免疫中使用的佐劑包括TLR調節劑，例如TLR-4調節劑，例如脂多糖或它們的衍生物，例如單磷酰脂質A或3-脫酰基單磷酰脂質A (稱為3D-MPL 并可以從 GlaxoSmithKline Biologicals North America 獲得,參見例如美國專利號 4，436，727,4, 877，611,4, 866，034 和 4，912，094)。
[0049]在另一個實施方案中，在初次免疫中使用的佐劑包含皂苷佐劑，例如Quil A和其衍生物。Quil A是從南美樹木石堿木(以Saponaria分離的阜苷制備物，并且首先由 Dalsgaard等人在 1974年(“Saponin adjuvants”，Archiv.fiir die gesamteVirusforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, p243_254)描述為具有佐劑活性。Quil A的純化的片段已通過HPLC分離，其保留佐劑活性而無Quil A相關的毒性(EP O 362278)，例如 QS7 和 QS21 (也稱為 QA7 和 QA21)。
[0050]在一個實施方案中，在初次免疫中使用的佐劑包括皂苷佐劑和TLR-4調節劑兩者，例如稱為ASOlB的佐劑(在脂質體免疫原性組合物中的3D-MPL和QS21，5(^g 3D-MPL和50 μδ QS21)或稱為ASOlE的佐劑(在脂質體免疫原性組合物中的3D-MPL和QS21，25Pg3D-MPL和 25 μδ QS21)。
[0051]在一個實施方案中，在初次免疫中使用的佐劑包括金屬鹽，例如氫氧化鋁或磷酸鋁和3-脫酰基單磷酰脂質Α。在此實施方案的具體實例中，在初次免疫中使用的佐劑是稱作AS04的佐劑(5(^g 3D-MPL吸附到500 μδ鋁鹽上)。
[0052]在進一步的實施方案中，在初次免疫中使用的佐劑包含水包油乳液，其本身包含可代謝的油，例如角鯊烯和表面活性劑例如吐溫80和/或司盤85。在此實施方案的具體實例中，所述水包油乳液是MF59。在此實施方案的一個實例中，水包油乳液可以包含可代謝的油的組合，例如角鯊烯和α-生育酚。在此實施方案的具體實例中，所述水包油乳液佐劑是AS03a、AS03b、AS03。或 AS03D，其所有都是來自 GlaxoSmithKline Biologicals S.A.的基于α -生育酚的水包油乳液。
實施例
[0053]實施例1
為了評價通過皮內途徑注射的多種化合物的佐劑效力，C57BL/6小鼠的組在第O天和第14天皮內注射2 yg或20 μ g單獨的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或與I yg或10 μ g下列化合物組合的HBsAg:MPL、DQ、CRX-642、Pam3Cys Lip或CT。小鼠的基準比較組也分別肌內注射吸附到50 μ g或500 Ug明礬上的2 μ g或20 yg HBsAgo最后一次免疫后14天，處死小鼠并通過心臟穿刺收集血液樣品。在每次免疫之前也收集血液樣品。將血液樣品進行處理并且血清樣品冷凍在_80°C，用于通過ELISA的抗原特異性抗體測定。簡而言之，微孔板的孔用最佳濃度的HBsAg或用于標準曲線的抗小鼠IgG在室溫包被4小時。清洗和封閉微孔后，血清樣品系列稀釋到板中，并且板在4°C孵育過夜。在充分清洗步驟后，使用綴合HRP的第二抗體檢測小鼠IgG(在37°C 30分鐘)，隨后與TMB底物溶液一起孵育。反應在30分鐘后用IM硫酸終止。板在450nm讀數。測試樣品的抗體濃度從標準曲線計算，所述標準曲線在每個板上，由純化的小鼠免疫球蛋白制成，使用SoftMaxPro通過應用4參數公式進行。值表示為每毫升血清特異性抗體的納克數，并且將測試組的抗體濃度的平均值與已皮內接受未佐劑化的HBsAg (圖上的空心圓圈)對照組比較，或與已接受相同劑量的明礬吸附的HBsAg相應的基準組比較，所述比較通過單因素方差分析隨后是Dunnett氏多重比較測試。
[0054]來自在第28天收集的樣品的抗原特異性血清IgG濃度的統計學分析揭示，當MPL和DQ與HBsAg混合用于皮內注射時,與無佐劑給予的等效劑量的HBsAg相比記錄了強的佐齊嗷應(圖1)。對于所有測試的涉及MPL或DQ的免疫方案，顯示引發的抗原特異性抗體應答與由肌內給予的吸附到明礬的基準疫苗引發的那些相匹配。當抗原特異性抗體濃度與由等效的未佐劑化的疫苗引發的應答比較時，所評價的4個基于CRX-642的制劑的3個顯示顯著的但更低(相對MPL和DQ)的佐劑效應。當與HBsAg通過皮內途徑共施用時，Pam3CysLip也展示強的佐劑效應。4個測試的制劑中的3個可以引發與由基準明礬吸附的疫苗引發的等效的抗原特異性抗體應 答。當皮內注射20 yg HBsAg時，CT也顯示與通過明礬吸附的基準疫苗引發的應答相匹配的強的佐劑效應。
[0055]還評價了通過多種疫苗制劑引發的細胞介導的免疫(CMI)應答。作為CMI的替代，通過細胞內細胞因子染色在⑶4和⑶8 T細胞子集中評價了細胞因子產生。簡而言之，從處死后的小鼠收集脾并使用尼龍細胞濾器和注射器栓塞處理成單細胞懸浮液。脾細胞在完全RPMI中培養。在存在抗⑶28、抗⑶49d和多種刺激劑例如HBsAg、涵蓋HBsAg的合成的15聚體肽和來自HIV的對照肽的情況下刺激脾細胞。作為陰性對照，脾細胞僅與完全RPMI培養基孵育。在2小時的刺激后，添加布雷菲德菌素A持續額外的16至18小時。使用Cytofix/Cytoperm試劑盒清洗、固定和透化細胞,并用下列mAb染色:APC_H7-綴合的大鼠抗-小鼠CD4 (L3T4)、PerCP-Cy5.5-綴合的大鼠抗-小鼠CD8a(Ly_2)、FITC_綴合的大鼠抗-小鼠IL-2、PE-綴合的大鼠抗-小鼠IL-5、APC-綴合的大鼠抗-小鼠IFN- Y和PE-Cy7-綴合的大鼠抗-小鼠TNF-α。在BD FACS Canto ? II上獲得細胞并使用BD FACSDiva?軟件分析。結果表示為同時產生細胞因子TNF-a ,IFN-Y和IL-2的⑶4或⑶8細胞頻率(％)。
[0056]如圖2 CA, B)中所示，結果表明對于產生細胞因子的⑶4和⑶8 T細胞的引發最佳的佐劑是DQ并且在較低程度上是MPL，極佳的制劑是10 μ g DQ與20 yg HBsAg—起皮內給予。測試的其它制劑顯示在用HBsAg或合成的15聚體肽(HBsAg)重刺激(從每組5只小鼠的2個合并物中制成的脾細胞懸浮液)后誘導非常低或無可檢測的三細胞因子陽性CD4和CD8 T細胞。
[0057]實施例2MPL和DQ的協同效應或纟目合效應
進行小鼠免疫原性研究以評估MPL和DQ協同作用以引發針對HBsAg的抗原特異性抗體應答和T細胞應答的潛能。C57BL/6小鼠組在第O天和第14天皮內注射2 μ g HBsAg,所述HBsAg與或不與I μ g DQ，或I μ g MPL或I μ g MPL與I μ g DQ的組合一起配制。吸附到明礬的相同劑量的HBsAg也肌內給予作為基準對照。小鼠在第28天處死。收集脾并進行心臟穿刺放血。在每次免疫之前也收集血液樣品。將血液樣品進行處理并且血清樣品冷凍在_80°C，用于通過ELISA的抗原特異性抗體測定。如先前所述測定抗原特異性抗體水平。還如先前所述重刺激脾細胞。
[0058]抗原特異性血清IgG水平的比較表明，MPL和DQ (基于重量調整)當與HBsAg皮內共施用時，引發非常類似水平的抗原特異性IgG水平，分別具有29 489 ng/mL和31 924ng/mL的幾何平均濃度。在兩種情況下，抗原特異性IgG水平顯著高于單獨接受HBsAg的小鼠所產生的那些。有意思的是，當一起配制時，MPL和DQ的佐劑效應對于抗原特異性IgG的引發不僅僅是加和性的，具有205 130 ng/mL的幾何平均濃度，其構成協同效應的優良實例(圖3)。當MPL與DQ—起配制時，引發產生細胞因子的細胞的效力也顯示最高。用HBsAg肽或抗原重刺激之后，三陽性(TNF- α +、IFN- Y +和IL-2+)⑶4和⑶8 T細胞的頻率優于任何其它組(圖4)。
[0059]實施例3:尤卡坦微型豬中的免疫原性/反應原性
設計第一個尤卡坦豬反應原性和免疫原性研究以:1)再現透皮貼劑應用后由大腸桿菌不耐熱毒素(LT)產生的過度色素沉著反應，2)確保DQ-佐劑化疫苗皮內施用后不生成過度色素沉著反應，以及3)驗證經過2次免疫后在尤卡坦豬品系中生成針對皮內HBsAg的特異性免疫反應的可能性。簡而言之，總共9只尤卡坦豬(雌性，3-4個月)分成3組，每組3只動物。第一組將在第O天在側面區域以100微升的體積皮內接受5個不同劑量(50 μδ>25Pg、12.5 μδ,5 Pg和I Pg)的LT。第二組將在第O和28天在后肢肌內(lml/劑量)接受Engerix。第三組將在第O和28天在側面區域以100μΙ的體積皮內接受混合有5(^g的DQ的2(^g乙型肝炎表面抗原。將通過Draize評分觀察和評估用于皮內注射的注射部位，在每次免疫前和在第56天處死時將收集血清(組2和3)并通過ELISA測定抗原特異性IgG水平。注射后，動物每天監測作為反應原性指標的紅斑、水腫、硬結、壞死和過度色素沉著進行至多21天。
[0060]如下進行抗原特異性血清抗體測定。簡而言之，微孔NUNC板的孔用最佳濃度的HBsAg或用山羊抗豬IgG在室溫包被I小時。用DPBS-T 0.05%-BSA 1%在室溫清洗和封閉微孔板30分鐘后，血清樣品系列稀釋到板中并且板在室溫孵育I小時。充分清洗步驟后，使用HRP綴合的山羊抗豬第二抗體(在室溫I小時)，隨后與TMB底物溶液在室溫孵育30分鐘而檢測豬IgG。反應在30分鐘后用IM硫酸終止。板在450nm讀數。測試樣品中的抗體濃度從標準曲線計算，所述標準曲線使用豬參照血清在每個板上運行。通過使用4參數公式通過SoftMaxPiO從標準品計算特異性血清IgG濃度。值表示為每毫升血清特異性抗體的納克數。
[0061]抗原特異性血清IgG測定表明與由IM給予的人劑量的Engerix構成的基準疫苗相比，皮內接受2個劑量的HBsAg (2(^g)與DQ (5(^g)的動物能夠生成至少等效于在相同數目的劑量后由基準疫苗引發的那些的抗體水平。當LT皮內注射到尤卡坦微型豬的側面皮膚中時，在注射部位觀察到嚴重的持續時間長的炎癥反應。對于注射的LT的所有劑量和對于組中的所有3只豬都注意到過度色素沉著。這些強反應在用20 μg HBs+50 μg DQ免疫的動物中不存在。在用20 μg HBs+50 μg DQ ID注射的動物中可以觀察到在注射部位存在干皮膚(非常溫和)。此外，特異性染色顯示，與正常皮膚相比，在DQ免疫的皮膚部分黑色素含量略微增加(幾乎不能被察覺)。然而，當與已通過相同途徑接受50 μg LT的組相比時，在用20 μg HBs+50 μg DQ ID注射后，黑色素色素沉著非常弱，幾乎是不可檢測的。[0062]實施例3:家豬中的免疫原性/反應原性
在家豬(Yorkshire/Landrace X Duroc)中進行免疫原性研究以評價用HBsAg w/wo佐劑皮內注射加強先前通過Engerix經由肌內注射引發的應答的能力。簡而言之，總共25只豬(雄性和雌性，3-4月齡)分入6組，并按照2次免疫的計劃進行免疫，在每次免疫之間具有28天的間隔。在第二次免疫后28天處死動物。前4組每組由5只動物組成，第5組(探索組)由3只動物組成,并且第6組由2只豬組成。組I (基準)肌內接受Engerix (EngerixHD)的人劑量。組2和3對于第一次免疫肌內接受Engerix HD并且對于第二次免疫使用100微升的體積皮內接受單獨HBsAg (2(^g)或與DQ (5(^g)—起的HBsAg (2(^g)。組4接受混合5(^g DQ的2(^g HBsAg的兩次皮內注射，并且組5是探索組，用混合有5Pg DQ的20μδ HBsAg皮內免疫兩次。在每次免疫前和在第56天的處死時收集血液樣品，并且血清將用于通過ELISA的抗原特異性IgG測定。來自組6的2只動物將用于使用伊文思藍染色鑒定相關引流淋巴結。已接受伊文思藍的動物在注射后30分鐘處死用于觀察引流淋巴結。
[0063]與肌內給予的基準(Engerix HD)相比，接受用Engerix HD頂初次免疫隨后是用混合50 μg DQ的20 μg HBsAg加強的組生成與由基準頂疫苗誘導的等效的抗體應答(圖6)。對于按照相同的計劃已接受混合50 Pg DQ的2(^gHBsAg的2次免疫的動物，相同的觀察是有效的。但是，在沒有佐劑的情況下，接觸抗原和加強方案之后，ID接受單獨的HBsAg(20μ8)作為加強劑的組不能匹配由基準組生成的抗體應答。
[0064]對于皮內給藥的組在免疫后使用Draize評分表進行注射部位的評分。如表1所總結，在所有已接受HBsAg (20 μδ) + DQ (50 μδ)的動物上第一次免疫后I天觀察到輕微的皮膚紅色(明確界定的)，具有20毫米的平均直徑。在免疫后2天，僅對于免疫的相同組在5只動物的2只上觀察到幾乎難以察覺的皮膚紅色。在第3天，檢測不到皮膚反應。對于已接受混合有DQ (5μδ)的HBsAg (20μδ)的組，在免疫后I天對于3只動物中的2只觀察到幾乎難以察覺的皮膚紅色，并且對于此組在第2天觀察到無皮膚反應。在第2次免疫后，在用Engerix肌內初次接觸抗原并用混合有DQ (50 μ g)的HBsAg (20 μ g)皮內加強的組中和在皮內接受兩個劑量的混合有DQ (50 μ g)的HBsAg (20 μ g)的組中觀察到幾乎難以察覺的紅斑反應，持續2天。對于皮內接受兩個劑量的混合有DQ (5 μ g)的HBsAg(20 μ g)的組，僅在免疫后I天觀察到幾乎難以察覺的紅斑反應。
[0065] 表1反應原件表(家豬)
【權利要求】
1.用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是免疫學活性皂苷。
2.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其中所述免疫學活性皂苷衍生自QuilA0
3.根據權利要求2的免疫原性組合物，其中所述QuilA衍生物是QS21。
4.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其中所述免疫學活性皂苷用留醇，尤其是膽固醇配制。
5.根據權利要求4的免疫原性組合物，其中免疫學活性皂苷對留醇的比例是在1:1和1:100之間，尤其在1:2和1:10之間，尤其約1:5。
6.用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是TLR-4激動劑。
7.根據權利要求6的免疫原性組合物，其中所述TLR-4激動劑是脫毒的脂質A，尤其是3D-MPL。
8.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物進一步包含一種或多種選自下組的額外佐劑:TLR-4激動劑、TLR7/8激動劑或鞭毛蛋白或其片段，或免疫學活性皂苷。
9.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其包含免疫學活性的皂苷，尤其是QS21(尤其用留醇，例如膽固醇配制)和TLR-4激動劑，尤其是3D-MPL。
10.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其以貼劑的形式施用。
11.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其使用短針裝置施用。
12.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其中所述TLR-5激動劑是鞭毛蛋白或其具有TLR-5活性的片段。
13.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其中所述TLR-5激動劑是其中高變結構域已經缺失的TLR-5激動劑。
14.根據權利要求5的免疫原性組合物，其中所述TLR-5激動劑選自:FliCM74_4(l(l、Fl ICa 161-405 和 Fl ?0Δ 138-405°
15.根據任意前述權利要求的免疫原性組合物，其中所述抗原衍生自乙型肝炎病毒，尤其其中所述抗原是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。
16.用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是免疫學活性皂苷。
17.用于在皮膚免疫中使用的免疫原性組合物，其包含一種或多種抗原和佐劑，其中所述佐劑是一種或多種TLR激動劑，尤其其中所述TLR激動劑是TLR-2 (例如Pam3Cys-lip)激動劑或TLR7和/或8激動劑(例如CRX642)。
【文檔編號】A61K39/29GK103957933SQ201280056977
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年11月19日 優先權日:2011年11月20日
【發明者】N.M-J.加爾松-約翰遜, M.P.范梅切倫, M.普蘭特 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司