疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明涉及疫苗，其包含蛋白原轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的至少兩個片段，其中所述至少兩個片段包含PCSK9(SEQ?ID?No.9)的氨基酸殘基150至170和/或205至225的至少8個連續氨基酸殘基。
【專利說明】疫苗
[0001]本發明與針對PCSK9的新穎組合免疫原性肽疫苗的開發有關，所述組合免疫原性肽疫苗源自與免疫原性載體聯系的兩種不同PCSK9表位的組合。所述疫苗建立用于預防和/或治療由高脂血(hyperlipidemia),高膽固醇血(hypercholesterolemia)和動脈粥樣硬化(atherosclerosis)引起的健康病癥。
[0002]高脂血、高膽固醇血、高血壓和動脈粥樣硬化是視為全世界致死率的主要因素的心血管病癥。與諸如肥胖、糖尿病、吸煙和缺乏物理活動等因素一起，形成心血管變化的主要因素是遺傳病癥，諸如常染色體顯性高膽固醇血(ADH)。認為ADH是形成心血管病癥的一項重要因素，并且表現為受損的膽固醇代謝和升高的低密度脂蛋白膽固醇水平，其隨后導致形成早發冠狀動脈疾病(CAD)。
[0003]已知三種主要的遺傳變化可以引起ADH的形成。經典的ADH形式由低密度脂蛋白受體(下文稱作LDLR)中的突變引起。另外，載脂蛋白B-lOO(apoB-lOO)中及更具體地在其配體結合域中的突變破壞ApoB-1OO對LDLR的結合，這隨后導致受損的膽固醇代謝。最終，通過遺傳變化可以牽涉ADH形成的第三種且新近發現的要素是蛋白原轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin型9 (下文稱作PCSK9)。
[0004]PCSK9，又稱為神經凋亡調節轉化酶I (NARC-1)，是一種鑒定為分泌性枯草桿菌酶(subtilase)家族的第9個成員的蛋白酶K樣枯草桿菌酶。PCSK9蛋白以約72kDa蛋白原(proprotein)合成,該蛋白原經歷前域(prodomain)和催化域之間的自身催化切割，因此導致成熟蛋白質形式的生成。前域(約14kDa)與成熟蛋白質63kDa保持結合，并且在此形式中，成熟的蛋白質向分泌途徑行進。
[0005]PCSK9在脂質穩態(homeostasis)中的作用已經公知。PCSK9的表達不僅以與牽涉脂質穩態的其它SREBP響應性基因相似的方式受到固醇調節元件結合蛋白(下文稱作SREBP)調節。而且，PCSK9`還牽涉通過促進LDLR內在化和降解實現的低密度脂蛋白膽固醇(下文稱作LDLc)清除。
[0006]體外和體內研究突出顯示PCSK9在從血液攝取低密度脂蛋白膽固醇中的本質作用。在一方面，PCSK9腺病毒過表達顯著提高循環LDLc的水平，而另一方面，與野生型動物相比，PCSK9-/-小鼠顯示LDLR水平的2.8倍升高和LDLc降低。
[0007]基因位于人染色體1ρ33_ρ34.3，并且在組織，諸如肝、腎、小腦和小腸中表達。許多研究確認“功能獲得突變(gain of function mutation) ”引起LDLR水平降低及隨之發生的高膽固醇血和對動脈粥樣硬化的素因。“功能失去突變(Loss of function mutation)”提高LDLR的水平，隨之發生低密度脂蛋白膽固醇(LDLc)的減少。
[0008]總之，PCSK9在轉錄后調節LDLR水平，因此是治療動脈粥樣硬化的一種有吸引力的靶物。
[0009]同時，已經建立了許多不同策略和辦法來抑制PCSK9的功能。
[0010]在猴(稱猴(Macaca fascicularis))中應用針對PCSK9的siRNA導致總體膽固醇的顯著減少。在小鼠和非人靈長類中用針對PCSK9的單克隆和多克隆抗體的其它調查繼續上調LDLR，伴隨總體膽固醇和LDLc水平的降低。[0011]通過單克隆或多克隆抗體療法降低PCSK9水平或小分子抑制劑和敲除技術后PCSK9的失活在不同動物模型中沒有顯示任何副作用。因此，總而言之，PCSK9是用于治療動脈粥樣硬化的一種非常有吸引力的靶物。
[0012]W02011/027257涉及源自PCSK9的免疫原性片段，其可以在用于治療、預防和減輕PCSK9介導的病癥的疫苗中使用。
[0013]在W02009/100297中，公開了人PCSK9的拮抗劑。
[0014]W02010/057242涉及包含源自人PCSK9的片段的肽的疫苗。
[0015]本發明的目的是提供針對PCSK9的基于肽的疫苗，其能夠抑制PCSK9，并且消除/降低PCSK9和LDLR的相互作用。這導致肝的肝細胞中升高的LDLR水平及隨后總體膽固醇和LDLc的減少。
[0016]此目的通過疫苗實現，所述疫苗包含蛋白原轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的多種(超過一種，至少兩種)片段，其中所述至少兩個片段的第一片段包含PCSK9 (SEQ ID N0.9)的氨基酸殘基150至170的至少8個連續氨基酸殘基，且所述至少兩個片段的第二片段包含氨基酸殘基205至225的至少8個連續氨基酸殘基。
[0017]令人驚訝地，證明了與僅包含一種PCSK9片段的疫苗相比，包含如上文定義的至少兩種不同PCSK9肽性片段的疫苗能夠有效得多地增加LDL受體量。例如，施用本發明的疫苗在肝的肝細胞中在體內導致低密度脂蛋白受體水平升高。作為其結果，施用疫苗后血漿中的LDLc和總體膽固醇的均值數值顯著降低。因此，與單一肽的施用相比，施用疫苗本發明的疫苗容許以高得多的效率和準確度治療或預防由高脂血、高膽固醇血和/或動脈粥樣硬化引起的疾病。在 本發明的一個優選的實施方案中，本發明疫苗的所有PCSK9片段源自由SEQ ID N0.9的氨基酸殘基150至170和205至225組成的PCSK9片段。
[0018]用于本發明疫苗的肽性片段包含PCSK9(SEQ ID N0.9)的氨基酸殘基150至170，優選氨基酸殘基153至165，和205至225，優選氨基酸殘基209至222的至少8個，優選至少9個，更優選至少10個連續氨基酸殘基。
[0019]SEQ ID N0.9 (PCSK9 氨基酸序列):
[0020]
【權利要求】
1.疫苗，其包含蛋白原轉化酶(proproteinconvertase)枯草桿菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的至少兩個片段，其中所述至少兩個片段的第一片段包含PCSK9 (SEQ ID N0.9)的氨基酸殘基150至170的至少8個連續氨基酸殘基，且所述至少兩個片段的第二片段包含PCSK9 (SEQ ID N0.9)的氨基酸殘基205至225的至少8個連續氨基酸殘基。
2.依照權利要求1的疫苗，其中所述至少兩個片段選自下組:具有氨基酸序列SIPffNLERITPPR(SEQ ID N0.2), PEEDGTRFHRQASK(SEQ ID N0.3), PEEDGTRFHRQA(SEQ IDN0.4)，EEDGTRFHRQASK(SEQ ID N0.5), EEDGTRFHRQAS(SEQ ID N0.6), SIPffNLERITP(SEQ IDN0.7)和 SIPWNLERIT(SEQ ID N0.8)的肽。
3.依照權利要求1或2的疫苗，其中PCSK9的至少一個片段具有選自下組的氨基酸序列:SIPWNLERITPPR(SEQ ID N0.2), SIPffNLERITP (SEQ ID N0.7)和 SIPWNLERIT (SEQ IDN0.8)，且PCSK9的至少一個片段具有選自下組的氨基酸序列:PEEDGTRFHRQASK (SEQ IDN0.3)，PEEDGTRFHRQA(SEQ ID N0.4)，EEDGTRFHRQASK(SEQ ID N0.5)和 EEDGTRFHRQAS(SEQID N0.6)。
4.依照權利要求1至3中任一項的疫苗，其中所述疫苗包含SIPWNLERITPPR(SEQID N0.2)和 PEEDGTRFHRQASK(SEQ ID N0.3) , SIPffNLERITPPR(SEQ ID N0.2)和PEEDGTRFHRQA(SEQ ID N0.4), SIPffNLERITPPR(SEQ ID N0.2)和 EEDGTRFHRQASK(SEQID N0.5), SIPWNLERITPPR(SEQ ID N0.2)和 EEDGTRFHRQAS (SEQ ID N0.6),PEEDGTRFHRQASK(SEQ ID N0.3)和 SIPWNLERITP(SEQ ID N0.7), PEEDGTRFHRQASK(SEQ IDN0.3)和 SIPWNLERIT(SEQ ID N0.8)，PEEDGTRFHRQA(SEQ ID N0.4)和 SIPWNLERITP(SEQ IDN0.7)，PEEDGTRFHRQA(SEQ ID N0.4)和SIPWNLERIT(SEQ ID N0.8),EEDGTRFHRQASK(SEQ IDN0.5)和 SIPWNLERITP(SEQ ID N0.7)，EEDGTRFHRQASK (SEQ ID N0.5)和 SIPWNLERIT (SEQ IDN0.8), EEDGTRFHRQAS(SEQ ID N0.6)和 SIPWNLERITP(SEQ ID N0.7)或 EEDGTRFHRQAS(SEQID N0.6)和 SIPffNLERIT(SEQ ID N0.8)。`
5.依照權利要求1至4中任一項的疫苗，其特征在于所述PCSK9的至少兩個片段包含C和/或N端末端的半胱氨酸殘基。
6.依照權利要求1至5中任一項的疫苗，其特征在于所述PCSK9的至少兩個片段與藥學可接受載體，優選KLH(匙孔蟲戚血藍蛋白)偶聯。
7.依照權利要求1至6中任一項的疫苗，其特征在于所述PCSK9的至少兩個片段配制用于皮內、皮下或肌肉內施用。
8.依照權利要求1至7中任一項的疫苗，其特征在于所述疫苗包含至少一種佐劑，優選氫氧化招。
9.依照權利要求1至8中任一項的疫苗，其用于治療和/或預防由高脂血(hyperlipidemia)、高膽固醇血(hypercholesterolemia)和 / 或動脈粥樣硬化(atherosclerosis)引起的病癥，優選心血管疾病(cardiovascular disease),中風(stroke)或外周血管疾病(peripheral vascular disease)。
10.依照權利要求9的疫苗，其特征在于對個體以每劑0.1ng至IOmg,優選I μ g至`500 μ g的量施用所述PCSK9的至少兩個片段。
【文檔編號】A61P9/00GK103874504SQ201280044571
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年9月13日 優先權日:2011年9月13日
【發明者】S.布倫納, G.加拉博瓦, B.萬科, M.溫沃德爾, G.溫索爾, C.朱諾, G.斯塔夫勒 申請人:阿費里斯股份公司