一種新的脂質體制備方法

專利名稱：一種新的脂質體制備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，確切地說它是一種新的脂質體制備方法。
背景技術：
脂質體是由磷脂雙分子層形成的閉合囊泡狀結構。脂質體根據其結構 的不同可以分為單層脂質體(unilamellar vesicles )、多層脂質體 (muU i lamel lar ves icles )禾口多囊月旨質體(mul t ives icular 1 iposomes )。 脂質體由英國人Alec D. Bangham在1965年首先發現。此后，人們發現脂 質體作為物質載體，尤其是藥物載體，有著巨大的應用價值，于是便對脂 質體進行了系統的研究。
經過了二十多年的探索，科研人員已經提出了許多很有價值的脂質體 制備方法。目前脂質體主要通過分散技術(dispersion technique)制備， 其方法可分為三大類1)以機械分散技術為基礎。如薄膜分散法(film dispersion),即將用于形成脂質體的磷脂溶于有機溶媒中一一通常是氯仿 或氯仿和甲醇的混合物，之后在減壓的條件下除去溶媒形成干燥的磷脂膜。 將磷脂膜水化即可形成多層脂質體(multilamellar vesicles )。該方法雖 是最經典、應用最廣的方法，但是卻存在一些缺點。例如使用毒性很大 的有機溶媒；無法實現工業化生產；當用含藥水溶液水化時，形成的多層 脂質體(multilamellar vesicles)層與層之間藥物分布不均一，必須通 過反復凍融處理等。2)以表面活性劑分散技術為基礎。如去左污劑透析法， 但難以工業化生產，且不適合包封水溶性藥物。3)以溶劑或共溶劑 (cosolvent )分散技術為基礎。例如，逆相蒸發法(reverse evaporation vesicles, REV),此種制備方法對水溶性藥物的包封率及載藥量相對較高； 而復乳法制備多囊脂質體(multivesicular liposome)目前可以實現大規 模生產(請參見skyepharma的depofoam技術平臺),但是僅限于制備微米 級具有緩釋功能的多囊脂質體；乙醇注入法(ethanol injection),已經 實現大規模生產(請參見alza公司的技術和polymun的erossf low技術)， 可釆用被動載藥法制備脂質體，但包封率較低，且需要在較高溫度下制備 (60。C左右)，通常會引起易氧化、易水解和易變性的藥物失去活性，而釆 用主動載藥法制備脂質體，包封率雖有所提高，但不適用于對酸堿敏感的 藥物，同時也容易引起磷脂分解變性。
而概括起來，目前脂質體制備方法主要存在如下缺陷 1.制劑的穩定性問題。通過已有方法得到的脂質體制劑通常為液體制劑， 往往不夠穩定，主要表現在如下三個方面
(1) 脂質體屬于熱力學不穩定分散系。脂質體混懸于水相時，常常會出 現聚集、融合等現象，導致粒徑變大，嚴重的還有可能出現分層。
(2) 磷脂存在于水相時，通常容易出現水解、氧化等現象。由于磷脂水 解后會形成溶血磷脂， 一方面增加制劑的毒性，另一方面也容易使脂質體 解體，造成被包封藥物的滲漏。(3)脂質體混懸在水相中，在儲存過程中，藥物可能會滲漏，導致藥物 包封率改變，從而影響制劑療效。如果藥物本身容易水解，制劑的穩定性 問題更顯突出。
2. 包封率問題。通過已有方法得到的脂質體制劑，水溶性藥物包封率往往 較低。包封率低不但會造成原料浪費，還可能達不到有效劑量，不能夠體
現脂質體制劑的優勢。目前常用主動載藥法(remote loading)來提高水 溶性藥物包封率。但無論是pH梯度還是硫酸銨梯度主動載藥法，均需要在 脂質體膜內外提供較大差別的PH環境，不僅不適用于對酸堿敏感的藥物， 也容易引起磷脂分解變性。此外，主動載藥法僅適用于可解離的藥物，應 用范圍相對有限。
3. 脂質體制劑滅菌問題。由于磷脂本身的性質， 一般不能夠對最終的制劑 加熱滅菌，這樣就要求整個生產過程必須采用無菌操作。這對某些脂質體 制備工藝來說可能無法實現。
4. 脂質體的粒徑控制問題。獲得小粒徑脂質體(小于200nm)通常有利于 靜脈給藥。這是因為
(1) 大粒徑的脂質體很容易被體內的單核巨噬系統所吞噬，從而被迅速 清除。
(2) 小粒徑的脂質體可以被動靶向腫瘤組織和缺血心肌。為了獲得小粒 徑脂質體，通常需要對已得到的脂質體進行超聲、研磨或擠出。這往往又 會導致藥物進一步滲漏，影響制劑質量。
為了能夠解決上述問題，我們發明了新的脂質體制備方法。

發明內容
為了克服上述脂質體制備技術的不足，我們發明了一種新的脂質體制 備方法。通過此方法，可以解決目前脂質體制劑所面臨的一些難題。我們 將該方法稱為單乳凍干法(lyophilization of 0/W emulsions )。
本發明是通過如下方案實現的
本發明的制備方法包括以下步驟
a、 將用于形成脂質體的脂類物質和待包封的親脂性物質溶于有機溶 劑形成油相(0),將待包封的親水性物質溶于水形成水相(W),將油相
(0)、水相(W)按合適的比例混合并乳化得到0/W型乳劑，油相(0)與水 相(W)體積比小于1;
b、 將得到的0/W型乳劑冷凍干燥除去溶媒； c 、 將得到的凍干產物水化得到脂質體。
下面我們將就該技術的具體操作和優勢進行詳細描述。 具體操作
步驟a優選的有機溶媒為環己垸，用于形成脂質體的脂類物質主要包 括磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)和調節磷脂膜性質的膽固醇 (cholesterol);具有類似磷脂性質的兩性物質以及不同脂類任意配比的 混合物可用于形成類脂體。此外，為了提高待包封物質的包封率，或為了 控制脂質體粒徑，可加入適量的荷電脂類物質在包封荷負電物質時，可加入荷正電的脂類物質，如l, 2-二酰基-SN-甘油-3-乙基磷脂酰膽堿等。
在包封荷正電的水溶性藥物時，可加入荷負電的脂類物質，如磷脂酰甘油 和磷脂酰絲氨酸等。為了提高包封率或磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性
抗氧化劑如vitamin E等。
本發明的成功實施，要求步驟a中必須得到穩定的0/W型乳劑。0/W 型乳劑指的是澄明或乳白色均一穩定乳劑，如果環己烷溶液和水溶液的比 例不合適，則乳劑不穩定，分層沉淀，可能會出現相反W/0型乳劑，凍干 品無法形成良好的脂質體。
步驟b優選的去除溶媒的方法為冷凍干燥法，0/W復乳可以先置于液 氮或低溫度裝置中迅速凍結，然后在凍干機中凍干。
步驟c為水化凍干產物以形成脂質體，可釆用蒸餾水或合適的緩沖液 在適宜的溫度下完成，為加速水化，也可在機械力的作用下完成，如可以 進行攪拌或振蕩等。
為了得到無菌制劑，可將步驟a中得到的0/W型乳劑濾過滅菌，其它
步驟在無菌條件下完成。
實施本發明的時候，通過步驟a得到的0/W型乳劑，水相中可加入凍 干保護劑，如海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇等物質。加入這些物質，有如 下幾個作用1、可以作為凍干保護劑，確保形成的脂質體具有合適的粒徑 及較高的包封率。2、使得到的凍干產物不易吸潮，可以長期儲存，臨用前 再進行水化形成脂質體。3、顯著加快凍干產物的水化速度，使凍干產物可 以立即水化形成脂質體。4、使凍干產物具有良好的形態。
本發明中提到的待包封物質，可以是藥物也可以是其它物質。若為水 溶性藥物，則將藥物、凍干保護劑溶于水相(Wl),脂類物質溶于有機相， 通過乳化法得到0/W型乳劑后凍干。得到的凍干產物可長期貯存，臨用前 水化形成脂質體制劑。
待包封物質若為脂溶性藥物，則與脂類物質溶于有機相，凍干保護劑 溶于水相，通過乳化法得到0/W型乳劑后凍干。得到的凍干產物可長期貯
存，臨用前水化形成脂質體制劑。
本發明也可以釆用主動載藥法，待包封物質可以為硫酸銨、醋酸鈉等 物質。例如，釆用硫酸銨梯度法進行主動載藥時，可以將硫酸銨、凍干保 護劑溶于水相，脂類物質溶于有機相，通過乳化法得到0/W型乳劑后凍干。 得到的凍干產物可長期貯存，待到使用時，加水水化形成包封硫酸銨的脂 質體，之后加入兩性藥物(如生物堿類藥物等)，即實現主動載藥過程。
釆用PH梯度法進行主動載藥時，可以將酸類物質(如檸檬酸等)、凍 干保護劑溶于水相，脂類物質溶于有機相，通過乳化法得到0/W型復乳后 凍干。得到的凍干產物可長期貯存，臨用前先加入水水化形成包封檸檬酸 的脂質體，之后加入等兩性物質(如生物堿類藥物等)，孵育得到含藥脂質 體，實現主動載藥過程。
從上述步驟中我們可以看出，我們發明的制備工藝具有如下優點
該制備工藝適用于大規模生產。脂質體工業化生產必須解決幾個問題，例如滅菌、除熱源、生產工藝簡單便于放大，保證脂質體在儲藏期內穩
定等。我們發明的制備工藝可以解決上述問題1)可以將a步驟得到的 0/W型乳劑過濾滅菌，其他步驟采用無菌操作，得到無菌制劑；2)工藝相 對簡單，只需乳化設備，超聲設備及凍干設備，均為常用設備，比較容易 放大；3)為了保證脂質體在儲藏期內穩定，可以將凍干物在使用前水化形 成脂質體，實驗表明得到的凍干物可以長期儲存，使用時水化立即形成脂 質體。
本制備方法的顯著特點是可以明顯提高產品穩定性、對脂溶性藥物包 封率及生產效率。
另外本發明可以有效地控制脂質體粒徑。如前所述，通過調整凍干保 護劑、脂類物質的比例、加入荷電成分及乳化過程等條件，可以有效地控 制脂質體的粒徑。由于可以得到粒度均一的小粒徑脂質體，增加了本發明 的應用價值。
同時，我們的制備工藝可以充分保證某些敏感藥物的活性。由于制備 工藝在低溫下完成，這樣就避免了藥物的水解和氧化。脂溶性藥物在0/W 型復乳中雖存在于油相，但有機溶媒對于脂溶性藥物一般無變性失活作用。
可以徹底除去殘留溶媒也是本發明的 一個優點。由于凍干機的真空度 很低(小于10pa)，所以得到的凍干產物中幾乎無溶媒殘留。
簡而言之，本發明不同于傳統的脂質體制備工藝(如REV),其實質是 通過凍干的手段去除0/W型乳劑中的有機溶媒并得到凍干產物，再水化形 成脂質體，從而、具備了上述顯著優勢 、、 、 、
范圍，不局限i^此。具體實施例方式
實施例1:
凍干保護劑蔗糖與甘露醇合用對凍干特性的影響將以蔗糖(5%) -甘露醇(5%)水溶液為水相，環己烷為油相，通過乳化法得到0/W型乳劑 后凍干，發現蔗糖與甘露醇的加入明顯改善凍干產物的形態，加快水化速 率。并且得到的凍干產物可以長期儲存。
實施例2:
4脂對脂質體粒徑的影響將以蔗糖水溶液為水相，環己烷為油相， 通過乳化法得到0/W型乳劑后凍干,凍干產物中脂質成分為PC, PC/CHOL (4: 1,質量比)，PC/PS(9: 1,質量比)，加入水后形成磷脂濃度均為1 %的脂質體。用LS32 (Beckmarm公司)測定粒徑。脂質體的平均粒徑分別 為 119 nm, 188 nm, 91nm (number mean diameter )。 這說月旨質成分對于 脂質體粒徑有一定的影響。
實施例3:
用透射電子顯微鏡觀察實施例1和2中得到的脂質體。采用負染法進 行觀察。即將脂質體用1% (PH = 7)的磷鎢酸染色。在電子顯微鏡下發現 脂質體為單層或寡層、近球形囊泡，大小與用粒度儀測定的結果相吻合。實施例4:
鈣黃綠素脂質體的制備將1 ml濃度5%的磷脂酰膽堿環己烷溶液與 3ml含5。/。蔗糖的0. lmM鉤黃綠素水溶液混合乳化，得到0/W乳劑，分裝 2 ml/瓶凍干。用2 ml蒸餾水水化，用LS32 (Beckmann公司)測定粒徑， 脂質體的平均粒徑為102 nm (number mean diameter )。用熒光猝滅法測 包封率，為9.6%。
實施例5:
本實施例是將非甾體抗炎藥物Flurbiprofen制成脂質體。將1 ml含 Flurbiprofen (lOmM)的濃度5 %磷脂酰膽堿及磷脂酰絲胺酸(PC)環己烷 溶液與3 ml含5%蔗糖水溶液混合乳化，得到0/W型乳劑，分裝2 ml/瓶 凍干。用2 ml蒸餾水水化，用LS320 (Beckmann公司)測定粒徑。脂質體 的平均粒徑為87 nm (number mean diameter )。用柱分離法分離脂質體和 游離藥物，測得包封率為93%。
實施例6:
本實施例是將拓撲替康釆用主動載藥法制成脂質體。將lml 5%磷脂 酰膽堿(PC)環己烷溶液與4 ml含枸櫞酸鈉(pH=4)的5%蔗糖水溶液混合 乳化，得到0/W乳劑，分裝lml/瓶凍干，用lml蒸餾水水化，得到小粒 徑脂質體，以Na0H溶液調節外水相至中性，加入適量鹽酸拓撲替康，在 55t:保溫10分鐘，得到包封拓撲替康的脂質體。用柱分離法分離脂質體和 游離藥物，測得包封率為99%。
權利要求
1、一種新的脂質體制備方法，其特征在于將用于形成脂質體的脂類物質和待包封的親脂性物質溶于有機溶劑形成油相(0)，將待包封的親水性物質溶于水形成水相(W)，將油相(O)、水相(W)按油相(O)與水相(W)體積比小于1的比例混合并乳化得到O/W型乳劑；a、將得到的O/W型復乳冷凍干燥除去溶媒；b、將得到的凍干產物水化得到脂質體。
2、 根據權利要求l所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于步 驟a中的有機溶劑指環己烷、氯仿、乙醚等與水不混溶易揮發除去的有機 溶劑，或其混合物；脂類物質主要為磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、 嫌脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油，以及調節磷脂膜性質的膽固醇；也可以為具有磷脂類似性質的其它兩性物質或乳化劑；以及不同脂類任意配比的混合 物；待包封的物質可以為藥物，也可以為其它物質。
3、 根據權利要求l所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于步 驟a和b中的乳化釆用攪拌，或振蕩，或渦旋振蕩，或勻乳，或高壓勻乳， 或超聲等機械做功操作，或為攪拌、渦旋振蕩、勻乳、高壓勻乳、超聲等 組合操作，或為處方成分自動乳化。
4、 根據權利要求l所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于在 制備過程中可加入荷電脂類物質在包封負電荷物質時，可加入荷正電的 脂類物質，在包封正電荷物質時，可加入荷負電的脂類物質；還可加入脂 溶性抗氧化劑。
5、 根據權利要求l所述的一種脂質體制備新方法，其特征在于在步 驟a和b中的水相(W)中可加入適當的凍干保護劑，包括二糖，單糖或 其它寡聚糖或甘露醇等具有凍干保護等作用的物質；或者為幾種凍干保護 劑的混合物，凍干保護劑與脂類物質的質量比通常大于1。
6、 根據權利要求5所述的一種脂質體制備新方法，其特征在于所述的二糖包括海藻糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、單糖包括葡萄糖、半乳糖、甘 露醇；其它寡聚糖包括三糖、四糖、五糖。
7、 根據權利要求l所述的一種脂質體制備新方法，其特征在于可將 步驟a中得到的0/W型乳劑過濾滅菌，其它步驟在無菌條件下完成。
8、 根據權利要求l所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于步 驟b中0/W型乳劑可以在浪氮或低溫裝置凍結，然后在凍干機中凍干；也可以直接在凍干機中凍干。
9、 根據權利要求l所述的一種新的脂質體制備方法，其待征在于步 驟c為水化凍干產物以形成脂質體，可釆用水或合適的緩沖液在適當的溫 度下完成，為加速水化，也可在機械力的作用下完成。
10、根據權利要求l所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于 所制備的脂質體粒徑小于200nm,可以用于多種途徑給藥。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，公開了一種新的脂質體制備方法，它解決了易氧化、易水解和易變性的藥物制備成脂質體過程中出現的一些難題，并且對于脂溶性藥物及兩性藥物具有較高包封率。制備工藝過程包括如下步驟a.將用于形成脂質體的脂類物質、親脂性物質溶于有機溶劑形成的溶液O；b.將待包封的水溶性物質溶于水中形成溶液W；c.將上述兩種溶液按合適的比例混合并乳化得到O/W型乳劑(包括微乳、膠束)；d.將得到的O/W型乳劑冷凍干燥除去溶媒；e.將得到的凍干產物水化，即得到脂質體。本工藝過程簡單，容易實施。
文檔編號A61K9/127GK101411687SQ200810229239
公開日2009年4月22日 申請日期2008年12月3日 優先權日2008年12月3日
發明者李鐵福, 汀 王 申請人:沈陽藥科大學