使用免疫球蛋白片段的促胰島素綴合物的制作方法

專利名稱：：使用免疫球蛋白片段的促胰島素綴合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于促胰島素肽的長效配方的促胰島素肽綴合物。具體地，本發明涉及一種顯著提高體內功效持續時間的改良的促胰島素肽的綴合物，該肽綴合物是通過將促胰島素肽和非肽聚合物以及免疫球蛋白Fc共價連接產生的，以及本發明還涉及該肽綴合物的制備方法。
背景技術：
：肽由于它們的低穩定性而容易變性，由體內的蛋白水解酶降解，從而失去活性，并且肽具有相對較小，從而容易通過腎。因此，為了保持血液濃度和包括作為藥物有效成分的肽的藥物濃度，必須給病人頻繁地服用肽類藥物來保持所需要的血液濃度和藥物濃度。然而，該肽類藥物通常以注射劑的形式給藥，而這樣頻繁的給藥使得病人很痛苦。為解決這些問題，已經進行了許多努力。作為其中的一種努力，已經嘗試通過生物膜增加肽類藥物的傳送以通過口咽或鼻咽吸入來運送肽類藥物。然而，與注射相比，由于體內的傳送效率低，這種方法仍然很難保持該肽類藥物的體內活性。另一方面，已經進行了很多努力來改善肽類藥物的血液穩定性，并將藥物在血液中以高濃度保持長時間，從而使該藥物的藥效最大化。因此，這種肽類藥物的長效制劑需要增加肽類藥物的穩定性，并保持不會引起病人免疫反應的足夠高濃度的藥物濃度。作為穩定肽并抑制它通過蛋白水解酶降解的方法，已經進行了一些實驗來修飾對該蛋白水解酶敏感的特定氨基酸序列。例如，由于GLP-1(7-37或7-36酰胺)通過二肽基肽酶IV(DPPIV)在第8氨基酸(Ala)和第9氨基酸(Asp)之間進行剪切而損失了GLP-1的藥物濃度，因此具有減少血液中葡萄糖濃度以治療2型糖尿病作用的GLP-1(7-37或7-36酰胺)具有4分鐘或更短的生理活性的半衰期(Kreymann等，1987)。因此，已經進行了各種關于具有抗DPPIV的GLP-1類似物的研究，并且已經進行了用Gly取代Ala(Deacon等，1998;Burcelin等,1999)或用Leu或D-Ala取代Ala((Xiao等，2001))的實驗，從而在保持它的活性的同時增加了對DPPIV的抗性。GLP-1的N末端氨基酸，His'對GLP-l的活性是重要的，并且作為DPPIV的目標。因此，美國專利第5，545，618號描述了用烷基或酰基修飾N末端，并且Gallwitz等描述了第7位His進行N曱基化或a甲基化，或者整個His用咪唑fl代來增加對DPPIV的抗性并保持7生理活性。除了這些修飾，從希拉毒蜥蜴的唾液腺純化的GLP-1類似物exendin-4(美國專利第5,424，686號)具有對DPPIV的抗性并比GLP-I具有更高的生理活性。因此，它具有比GLP-1的半衰期更長的2至4小時的體內半衰期。然而，僅使用增加DPPIV抗性的方法，生理活性不能被充分地保持，并且在使用商業可獲得的exendin-4(exenatide)的情況下，它需要一天兩次被注射給病人，這對病人仍然是纟艮痛苦的。這些促胰島素肽具有一個問題，通常肽的大小很小。從而，它們不能在腎中被重新獲得，并且它們隨后被排出體外。因此，已經使用以化學方法在肽的表面添加例如聚乙二醇(PEG)的具有高溶解度的聚合物來抑制在腎中的損失的方法。PEG非特異性地結合到特異位點或目標肽的多個位點產生了增加肽的分子量的效果，并從而抑制通過腎的損失，并防止水解，而不產生任何的副作用。例如，國際專利公開第W02006/076471號申請描述了PEG結合到B型利鈉肽或BNP，BNP結合到NPR-A激活cGMP的產生，cGMP使得動脈血壓降低，并因此作為充血性心力衰竭的治療劑，從而保持生理活性。美國專利第6,924，64號描述了PEG結合到exendin-4的賴氨酸殘基來增加它的體內停留時間。然而，這種方法增加了PEG的分子量，從而增加了肽類藥物的體內停留時間，同時隨著分子量的增加，該肽類藥物的濃度顯著地減少了，并且肽的反應性也降低了。因此，產量被不希望的降低了。國際專利公開第WO02/46227號申請描述了使用基因重組技術通過將GLP-1，exendin-4或其類似物與人血清白蛋白或免疫球蛋白區(Fc)結合來制備融合蛋白。美國專利第6,756,480號描述了通過將曱狀旁腺激素(PTH)和其類似物與Fc區結合來制備Fc融合蛋白。這些方法可以解決如聚乙二醇化產量低和非特異性的問題，但是它們仍然具有這樣一個問題，即增加血液中半衰期的效果不像期待中的那么顯著，并且有時濃度也很低。為了使增加血液中半衰期的效果最大化，使用了各種類型的肽連結器，但是可能引起免疫反應。此外，如果肽具有二硫鍵，例如使用BNP,那么錯折疊的概率很高。因此，這類肽幾乎不可能被使用。此外，GLP-1衍生物即NN2211是通過取代GLP-1的氨基酸并被結合到酰基側鏈以形成與白蛋白的非共伯、鍵來制備的，從而增加了它的體內停留時間。然而，它具有11至15小時的半衰期，與exendin-4相比，它沒有顯示出半衰期的顯著增加。從而，GLP-1衍生物仍然需要一天一次地被注射(Nauck等，2004)。此外，CJC-1131是GLP-1衍生物，它具有將GLP-1和血液中的白蛋白共價結合的馬來酰亞胺反應基團，并且為了達到增加體內半衰期的目的，已經努力進行實驗來開發CJC-1131,但是這些努力現在已經停了下來。其后被提議的物質CJC-1134是共價結合到重組白蛋白的exendin-4,并且沒有顯示增加血液穩定性的顯著效果，它具有17小時的血液半衰期(鼠)(Thibauoleau等，2006)。
發明內容技術問題因此，本發明人將免疫球蛋白Fc和非肽聚合物與非N末端的氨基酸殘基處通過共價鍵連接到促胰島素肽的特異性位點，并發現本發明的綴合物具有顯著的增加體內功效和半衰期的用途。特別地，他們發現，在促胰島素肽的綴合物中，肽的綴合物例如exendin—4，exendin—4的N末端氛基《皮敲除的去一氛基一組氛醜一exendin—4，exeiidiri—4的N末端氨基被羥基取代的P-羥基-咪唑-丙酰基-exendin-4，exendin-4的N末端氨基用兩個曱基基團修飾的二曱基-組氨酰-exendin-4和第一個組氨酸的cc碳和N末端氨基均被敲除的咪唑-乙酰基-exendin-4都產生顯著的增加的體內功效和半衰期的作用。技術方案本發明的一個目的是提供一種促胰島素肽的長效制劑，它具有保持該促胰島素肽的體內活性并增加血液半衰期的作用。附圖簡述圖1顯示了測定天然exendin-4(N)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖2顯示了測定天然exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖3顯示了測定去-氨基-組氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖4顯示了測定(2-羥基-3-(1H-咪唑-4-基)丙酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖5顯示了測定(2-(lH-咪唑-4-基)乙酰基)-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖6顯示了測定Serl2突變的去-氨基-組氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖7顯示了測定Argl2突變的去-氨基-組氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖8顯示了測定去-氨基-組氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-人血清白蛋白(HSA)綴合物純度的反相HPLC的結果；圖9顯示了測定二甲基-組氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖10顯示了測定GLP-1(N)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖11顯示了測定去-氨基-組氨酰-GLP-1(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖12顯示了測定天然exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反相HPLC的結果；圖13顯示了通過12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定(2-(lH-咪唑-4-基)乙酰基)-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的結果;圖14顯示了去-氨基-組氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物降低血液中葡萄糖濃度的作用的測定結果。優選實施方式在本發明的一個實施方案中，提供了一種長效的促胰島素肽的綴合物，其中在其兩端具有反應基團的促胰島素肽和非肽聚合物共價地相互連接。本發明的促胰島素肽是用于促進胰島素在胰臟|3細胞中合成和表達的具有促胰島素功能的肽。這些肽包括前體，激動劑，衍生物，片段和突變體，并優選GLP(胰升血糖素樣肽)-l，exendin3和exendin4。GLP-1是由小腸分泌的激素，通常促進胰島素的生物合成和分泌，抑制胰升血糖素的分泌并促進細胞中葡萄糖的吸收。在小腸中，胰升血糖素前體被分解為三種肽，它們是胰升血糖素、GLP-1和GLP-2。此處，GLP-1指GLP-1(1-37),它起初是以不具有促胰島素功能的形式存在。但是，隨后它被加工并被轉化為有活性的GLP-1(7-37)的形式。GLP-1(7-37)氨基酸的序列如下GLP-1(7-37)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEPIAWLVKGRG10GLP-1衍生物指顯示與GLP-1有至少80%同源性的氨基酸序列的肽，它可以是被化學改性的并顯示至少與GLP-1相等或更好的促胰島素功能。GLP-1片段指在天然GLP-1的N末端或C末端添加或敲除了一個或多個氨基酸的形式，其中該添加的氨基酸可以是非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)。GLP-1突變體指具有促胰島素功能的肽，其具有不同于天然GLP-1的一個或多個氨基酸序列。exendin3和exendin4是由39個氨基酸組成的促胰島素肽，其具有與GLP-1的氨基酸序列的53%的同源性。exendin3和exendin4的氨基酸序列如下Exendin-3HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSExendin-4HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSexendin激動劑指與體內受體進行反應的化合物并具有與exendin相等的生理活性，其與exendin的結構無關。Exendin衍生物指與天然exendin相比具有至少80°/。的氨基酸序列同源性的肽，它可以在氨基酸殘基上的一些基團上被化學取代(例如，a-曱基化，a-羥基化)，被敲除(例如，脫氨)或被修飾(例如N-曱基化)，并具有促胰島素功能。exendin片段指在天然exendin的N末端或C末端添加或敲除了一個或多個氨基酸的片段，其中可以添加非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)，并具有促胰島素功能。exendin變體指具有與天然exendin不同的至少一個氨基酸序列的肽，它具有促胰島素功能。exendin激動劑，衍生物，片段和突體的每種制備方法可以單獨或結合使用。例如，本發明包括的促胰島素肽的氨基酸序列具有至少一個氨基酸與天然促胰島素肽不同的氨基酸并在N末端的氨基酸殘基處被脫氨。在一個特定實施方案中，本發明使用的天然促胰島素肽和改性的促胰島素肽可以使用固相合成方法被合成，并且包括天然促胰島素肽的大多數天然肽可以通過重組技術產生。此外，在本發明中使用的促胰島素肽可以結合到非肽聚合物的不同位點上。根據本發明制備的肽的綴合物可以根據被連接到促胰島素肽的位點的改變具有不同的活性。例如，它可以分別與N末端和除了N末端的例如C末端的其它末端結合，其體外活性不同。乙醛反應基團在低pH選擇性地結合到N末端，并且在例如pH9.0的高pH可以結合到賴氨酸殘基來形成共價鍵。允許聚乙二醇化反應在不同pH中進行，并且隨后位置異構體可以使用離子交換色語柱從反應混合物中分離出來。如果促胰島素肽與非N末端的對于體內活性重要位點的位點結合，使用非肽聚合物上的馬來酰亞胺連接器可以將活性琉基引入到該天然氨基酸序列中被修飾的氨基酸殘基的位點以形成共《介鍵。如果促胰島素肽與非N末端的對于體內活性重要位點的位點結合，使用在非肽聚合物上的乙醛連接器將活性氨基引入到該天然氨基酸序列中被修飾的氨基酸殘基的位點以形成共價鍵。當使用非肽聚合物上的乙醛連接器時，它與N末端的氨基和賴氨酸殘基反應，并且可以使用改性形式的促胰島素肽來選擇性地增加反應產量。例如，使用N末端阻斷方法，賴氨酸殘基取代方法，在C末端將氨基引入的方法等，可以僅將被反應的一個氨基保留在所需位點，從而增加聚乙二醇化和結合反應的產量。保護N末端的方法包括二曱基化，以及曱基化，脫氨作用，乙酰化作用等，但不限于這些烴基化方法。在一個優選實施方案中，本發明的促胰島素肽綴合物是免疫球蛋白Fc區特異性地結合到促胰島素肽的非N末端氨基的氨基上的促胰島素肽的綴合物。在一個特定實施方案中，本發明人在pH9.0誘導了天然exendin-4的聚乙二醇化來選擇性地將PEG結合到促胰島素肽的賴氨酸殘基上。可選地，為了在Lys殘基進行聚乙二醇化，具有被敲除的或被保護的N末端的exendin-4衍生物的聚乙二醇化在pH7.5中進行。通過敲除N末端組氨酸的a氨基，或通過用羥基取代N末端氨基，或通過用兩個曱基修飾N末端組氨酸的cc氨基，或通過敲除第一氨基酸(組氨酸)的ct碳并將其與N末端氨基連接起來以保留咪唑-乙酰基等來阻斷N末端的聚乙二醇化。這些衍生物通過下面的化學式表示<化學式1>去-氨基-組氨酰(DA)-exendin-4桝M、臨,H9—肽p-羥基-咪唑-丙酰基(HY)一exendin-4,瘋人◎肽咪唑乙酰基(CA)一exendin—4，嚴l"IC，—肽二曱基-組氨酰(DM)-exendin-4與N末端結合不同的是,被保持在8.5%(表1)。此外當將PEG結合到賴氨酸殘基而不是N末端時，體外活性即使通過敲除exendin-4的N末端氨基制備的去-氨基-纟且氛醜一exendin—4(以下稱、為DA—exendin—4)，通過用輕基耳又4戈exendin—4的N末端氛基制備的P-羥基-咪唑-丙酰基-exendin-4(以下稱為HY-exendin-4)，通過用兩個曱基修飾exendin-4的N末端氨基制備的二甲基-組氨酰-exendin-4(以下稱為DM-exendin-4)和通過敲除exendin-4的第一組氨酸的ct碳并將其與N末端氨基連接制備的。米唑乙酰基-exendin-4(以下稱為CA-exendin-4)的Fc綴合物顯示了與天然exendin-4綴合物可比的體外活性和血液半衰期(表1)，這些綴合物顯示了出乎意料地高體內功效持續時間(圖14)。根據本發明制備的DM-exendin-4-免疫球蛋白Fc綴合物，DA-exendin-4-免疫3求蛋白Fc綴合物，CA-exendin-4-免疫5求蛋白Fc綴合物和HYexendin-4-免疫球蛋白Fc綴合物顯示了50小時或更長的增加的血液半衰期。通過結合到不影響肽活性的Lys殘基上，最少地減少了濃度。此外，通過去除N末端的氨基或a碳觀察到了出乎意料地葡萄糖降低的高活性。免疫球蛋白Fc區用作藥物載體是安全的，因為它是在體內代謝的生物可降解多肽。此外，與整個免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fc區具有相對低的分子量，并且因此13有利于綴合物的制備，純化和生產。由于免疫球蛋白Fc區不包含其氨基酸序列根據抗體子類而不同并且因此是高度非同源性的Fab片段，因此可以預測免疫球蛋白Fc區可以極大地增加物質的同源性并減少抗原。本發明中使用的促胰島素肽用載體物質和非肽聚合物連接。可以用于本發明的載體物質可以選自包括免疫球蛋白Fc區，白蛋白，轉鐵蛋白和PEG的組，并優選免疫球蛋白Fc區。在此使用的術語"免疫球蛋白Fc區"指免疫球蛋白的重鏈恒定區2(C2)和重鏈恒定區3(C3),而不是免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區，重鏈恒定區1(Cl)和輕鏈恒定區1(CJ)。它還可以包括重鏈恒定區的絞鏈區。此外，本發明的免疫球蛋白Fc區可以包含Fc區的部分或全部，只要它具有與天然蛋白基本相似或更好的生理活性，除了重鏈和輕鏈的可變區外，Fc區包括重鏈恒定區1(Cl)和/或輕鏈恒定區1(CU)。此外，IgFc區可以是在C2和或C3的氨基酸序列的相對長的部分具有缺失的片段。即，本發明的免疫球蛋白Fc區可以包括1)Cl結構域，C2結構域，C,,3結構域和C4結構域，2)Cul結構域和C2結構域，3)Cl結構域和C"3結構域，4)C2結構域和C3結構域，5)—個或多個結構域和免疫球蛋白絞鏈區(或絞鏈區的一部分)的結合，和6)重鏈恒定區和輕鏈恒定區的每個結構域的二聚體。本發明的免疫球蛋白Fc區包括天然氨基酸序列和其序列衍生物(突變體)。由于一個或多個氨基酸殘基的缺失，插入，非保守或保守取代或其結合，因此氨基酸序列衍生物是與天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgGFc中，已知214至238,297至299，318至322,或327至331位置是結合中起重要作用的氨基酸殘基，可以用作修飾的適合目標。其它各種衍生物也是可行的，包括可以形成二硫鍵的區被敲除，或者天然Fc形式的N末端的某些氨基酸殘基被除去或者曱硫氨酸殘基被添加在此。此外，為了去除效應子作用，缺失可以在補體結合位點進行，例如Clq-結合位點和ADCC(抗體依賴細胞介導的細胞毒作用)位點。制備這些免疫球蛋白Fc區的序列衍生物的方法在國際專利公開第WO97/34631和WO96/32478中公開。通常不改變分子活性的蛋白質和肽中的氨基酸交換在現有技術中是已知的(H.Neurath,R.L.Hill,TheProteins,AcademicPress,NewYork,1979)。大多數通常發生的交換是雙向的Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser，Ala/Gly,Ala/Thr，Ser/Asn,Ala/Val，Ser/Gly,Thy/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile,Leu/VaLAla/Glu,和Asp/Gly交換。如果需要，Fc區可以通過磷酸化，硫酸鹽化，丙烯酸酯化，糖基化，甲基化，法尼基化，乙酰化，酰胺化等進行修飾。上述Fc衍生物是與本發明的Fc區具有相同生理活性或例如對于耐熱，pH等具有改善的結構穩定性的衍生物。此外，這些Fc區可以是從人或其它動物中分離得到的天然形式，動物包括牛，羊，豬，小白鼠，兔，倉鼠，鼠和豚鼠，Fc區可以是從轉換的動物細胞或微生物中獲得的重組體或其衍生物。在此，它們可以由天然免疫球蛋白通過從人或動物有機體分離全部免疫球蛋白并用蛋白水解酶處理它們獲得。木瓜蛋白酶將天然免疫球蛋白消化為Fab和Fc區，并且胃蛋白酶的處理使得產生pF'c和F(ab)2片段。例如，這些片段可以進行分子篩色譜來分離Fc或pF'c。優選地，人源Fc區是從微生物獲得的重組體免疫球蛋白Fc區。此外，本發明的免疫球蛋白Fc區可以是具有天然糖鏈的形式，與天然形式相比增加的糖鏈或與天然形式相比降低的糖鏈，或可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖鏈的增加，降低或去除可以通過現有技術中已知的方法實現，例如化學方法，酶法和使用微生物的基因工程方法。從Fc區去除糖鏈導致第一補體成分C1的Clq部分的親和力明顯降低和抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用或補體依賴性細胞毒性反應的降低或損失，因此在體內不誘導不需要的免疫反應。在這點上，去糖基化或無糖基化"glycosylated)形式的免疫球蛋白Fc更適合本發明的用作藥物載體的目的。在此使用的術語"去糖基化"指從Fc區酶法去除含糖部分，而術語"無糖基化"指通過原核生物，優選大腸桿菌來產生的不含糖基化形式的Fc區。另一方面，免疫球蛋白Fc區可以從人或包括牛，羊，豬，小白鼠，兔，倉鼠，鼠和豚鼠的其它動物，并優選人中獲得。此外，免疫球蛋白Fc區可以是從IgG,IgA,IgD,IgE和IgM,或通過其結合或其雜交體獲得的Fc區。優選地，它源自人血中的豐富蛋白中的IgG或IgM,并且最優選已知的能提高配體結合蛋白的半衰期的IgG。另一方面，在此使用的術語"結合"指相同來源的編碼單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽被連接到不同來源的單鏈多肽來形成二聚體或多聚體。即，二聚體或多聚體可以由選自包括IgGFc,IgAFc，IgMFc,IgDFc，和IgEFc片段的組的兩個或多個片段形成。在此使用的術語"雜交體"指編碼不同來源的兩個或多個免疫球蛋白Fc區的序列均存在于單鏈免疫球蛋白Fc區中。在本發明中，各種類型的雜交體是可行的。即，結構域雜交體可以由選自包括IgGFc，IgMFc,IgAFc,IgEFc和IgDFc的Cnl，C2,andCH4的組的一至四個結構域組成，并且可以包括絞鏈區域。另一方面，IgG被分類為IgGl,IgG2，IgG3和IgG4亞類，并且本發明包括其結合體和雜交體。優選的是IgG2和IgG4亞類，并且最優選的是幾乎不具有例如CDC(補體依賴性細胞毒性)效應子功能的IgG4的Fc區。也就是，作為本發明的藥物載體，最優的選免疫球蛋白Fc區是源于人的IgG4非糖基化的Fc區。源于人的Fc區比非源于人的Fc區更加優選，非源于人的Fc區在人體中作為抗原并51起例如針對該抗原產生新抗體的不希望的免疫反應。在此使用的術語"非肽聚合物"指通過除了肽鍵之外的任何共價鍵相互連接的包括兩個或多個重復單元的生物相容的聚合物。可以用于本發明的非肽聚合物可以選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化的多元醇(polyoxyethylatedpolyol)，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，例如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸-羥基乙酸)的生物可降解的聚合物，脂類聚合物，角素，透明質酸和其結合的組，并優選聚乙二醇。此外，現在技術中已知的和本領域的技術人員容易制備的它們的衍生物也包含在本發明的范圍中。通過現有的框內融合方法獲得的用于融合蛋白的肽連接器具有如下缺點，它在體內容易被蛋白分解酶裂解，因此不能預期的獲得通過栽體充分增加活性藥物的血液半衰期的效果。然而，在本發明中，可以使用對蛋白水解酶具有耐受力的聚合物將肽的血液半衰期保持到與載體相似的水平。因此，可以用于本發明的任何非肽聚合物可以沒有任何限制的被使用，只要它是具有上迷功能的聚合物即可，即，對體內蛋白水解酶有耐受力的聚合物。該非肽聚合物優選具有1至100kDa的分子量，并優選1至20kDa。此外，本發明的連接到免疫球蛋白Fc區的非肽聚合物可以是一種聚合物或不同類型聚合物的結合體。本發明中使用的非肽聚合物具有能夠結合到免疫球蛋白Fc區和蛋白質藥物的反應基。非肽聚合物在兩端具有反應基，其優選選自包括起反應的醛基，丙醛基，丁醛基，馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺書f生物的組。琥珀酰亞胺書于生物可以是琥珀酰亞胺基丙酸酯，羥基琥珀酰亞胺，琥珀酰亞胺羧曱基或琥珀酰亞胺碳酸酯。特別地，當非肽聚合物在兩端具有反應醛基時，在兩端與生理活性的多肽和具有最小非特異性反應的免疫球蛋白的連接是有效的。通過醛鍵的還原性烷基化產生的的終產物比通過酰胺鍵連接的更加穩定。在低pH下，眵基反應基選擇性地結合到N末端，并在例如pH9.0的高pH下結合到賴氨酸殘基上形成共價鍵。非肽聚合物兩端的反應基可以是相同的或不同的。例如，非肽聚合物可以在一端具有馬來酰亞胺基并在另一端具有醛基，丙醛基或丁醛基。當使用在其兩端具有反應性羥基的聚乙二醇作為非肽聚合物時，可以通過已知的化學反應將羥基活化為各種反應基，或者可以使用商業上可獲得的具有改性的反應基的聚乙二醇來制備本發明的促胰島素肽的綴合物。本發明的促胰島素肽的綴合物保持了現有的促胰島素肽的體內活性，例如促進胰島素的合成和分泌，控制食欲，體重損失，增加P細胞對血液中葡萄糖的敏感性，促進P細胞的增殖，延遲胃的排空和胰高血糖素抑制，此外還顯著地增加了促胰島素肽的血液半衰期和肽的體內功效的持續效果，該綴合物對治療糖尿病，肥胖癥，急性冠狀綜合癥或多囊卵巢綜合癥是有用的。在另一個實施方案中，本發明提供了制備促胰島素肽的綴合物的方法，該方法包括以下步驟(1)將具有反應基的非肽聚合物和促胰島素肽的氨基或巰基共價地連接，其中所述的非肽聚合物的兩端具有選自包括乙醛，馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物的組的反應基；(2)從(1)的反應混合物中分離出包括促胰島素肽的綴合物，其中所述非肽聚合物與非N末端的位點共價連接；和(3)將免疫球蛋白Fc區共價地連接到被分離的綴合物的非肽聚合物的另一端，產生含有免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的肽的綴合物，其中免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的肽分別與所述非肽聚合物的一個末端連接。在此使用的術語"綴合物"指通過將非肽聚合物和促胰島素肽共價連接，并且隨后將免疫球蛋白Fc區連接到該非肽聚合物的另一端所制備的中間產物。在一個優選實施例中，本發明提供了一種制備促胰島素肽的綴合物的方法，該方法包括以下步驟(1)將在兩端具有反應性醛基的非肽聚合物和促胰島素肽的賴氨酸殘基共價地連接；(2)從(1)的反應混合物中分離出包括促胰島素肽的綴合物，其中所述非肽聚合物與賴氨酸殘基共價連接；和(3)將免疫球蛋白Fc區共價地連接到被分離的綴合物的非肽聚合物的另一端，產生含有免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的肽的蛋白綴合物，其中免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽分別與所述非肽聚合物的一個末端連接。更優選的，(l)的非肽聚合物和促胰島素肽的賴氨酸殘基在pH7.5或更高的pH下被連接。在另一個實施方案中，本發明提供了包括本發明的促胰島素肽的綴合物的治療糖尿病的藥物組合物。包括本發明的綴合物的藥物組合物還可以包括藥物上可接受的載體。對于口服給藥，該藥物上可接受的載體可以包括粘合劑，潤滑劑，崩解劑，賦形劑，增溶劑，分散劑，穩定劑，懸浮劑，著色劑和芳香劑。對于注射制劑，藥物上可接受的載體可以包括緩沖劑，防腐劑，止痛劑，增溶劑，等滲壓劑(isotonicagent)和穩定劑。對于局部給藥的制劑，藥物上可接受的載體可以包括堿，賦形劑，潤滑劑和防腐劑。本發明的藥物組合物可以與上述的藥物上可接受的載體結合被制備成各種劑型。例如，對于口服給藥，藥物組合物可以被制備成小片，片劑，膠囊，酏劑，混懸液，糖漿或薄片。對于注射制劑，藥物組合物可以被制備成例如一次劑量的劑型的安瓿或例如多劑量容器的單元型劑型。藥物組合物還可以被制備成溶液，懸浮液，藥片，藥丸，膠囊和長效制劑。另一方面，適合藥物配方的載體，賦形劑和稀釋液的例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麥芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡膠，藻酸鹽，凝膠，磷酸鉤，硅酸4丐，纖維素，曱基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羥基苯曱酸甲酯，輕苯丙酯，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。此外，藥物配方還可以包括填充劑，抗凝血劑，潤滑劑，保濕劑，芳香劑和防腐劑。根據本發明的綴合物在治療糖尿病，肥胖癥，急性冠狀綜合癥或多囊卵巢綜合癥中是有用的。因此，包括該綴合物的藥物組合物可以在治療這些疾病時被給藥。在此使用的術語"給藥"指將預定量的物質通過某種適合的方式引入病人。本發明的綴合物可以通過任何常見的途徑被給藥，只要它可以到達預期的組織。給藥的各種方式是可以預期的，包括腹膜，靜脈，肌肉，皮下，皮層，口服，局部，鼻腔，肺部和直腸，但是本發明不限于這些已舉例的給藥方式。然而，由于口服給藥時，肽被消化，口服給藥的組合物的活性成分應該被包被或被配制以防止其在胃部被降解。優選的，本發明的組合物可以注射制劑被給藥。此外，本發明的藥物組合物可以使用將活性成分傳送到靶細胞的特定器械來給藥。本發明的藥物組合物的給藥頻率和劑量可以通過多個相關因素被確定，該因素包括要被治療的疾病類型，給藥途徑，病人年齡，性別，體重和疾病的嚴重程度以及作為活性成分的藥物類型。由于本發明的藥物組合物具有優良的體內功效和濃度的持續時間，它可以顯著地減少本發明的藥物的給藥頻率和劑量。通過下面的說明性的實施例獲得更好的理解本發明，但是這些實施例不能解釋為限制本發明。具體實施例實施例Lexendin-4的聚乙二醇化和位置異構體的分離3.4K丙酸ALD(2)PEG(PEG具有兩個丙醛基,IDBInc.,SouthKorea)和exendin-4(AP，USA)的N末端進行聚乙二醇化，使3mg/ml濃度的肽和PEG在4'C以1:15的摩爾比反應90分鐘。同時，該反應在pH4.0的lOOmM濃度的NaOAc緩沖液中進行，并且20mMSCB(NaCNBH3)作為還原劑被添加到其中來進行該反應。3.4K丙酸ALD(2)PEG和exendin-4的賴氨酸(Lys)殘基進行聚乙二醇化，使3mg/ml濃度的肽和PEG在4。C以1:30的摩爾比反應3小時。同時，該反應在pH9.0的lOOmM濃度的磷酸鈉緩沖液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中來進行該反應。單聚乙二醇化的肽使用SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)從每個反應溶液中被純化，并且異構體使用SOURCES(XK16ml,AmershamBiosciences)被分離。已經發現聚乙二醇化的N末端的峰被較早的發現，并且隨后依次發現聚乙二醇化的賴氨酸殘基的兩個峰。洗脫峰的聚乙二醇化的區域通過肽鐠法被證實。Lysl2-聚乙二醇化的綴合物被較早的洗脫，而Lys27-聚乙二醇化的綴合物在最后的部分被洗脫，并且N末端的位置異構體和Lys12的位置異構體相互被完全地分離。色譜柱SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)流速2.0ml/分鐘梯度A0->40%80分鐘B(A:20mMTrispH8.5,B:A+0.5MNaCl)色語柱SOURCES(XK16ml,AmershamBiosciences)流速2.0ml/min梯度A0-〉100%50minB(A:20mM檸檬酸pH3.0,B:A+0.5MKC1)實施例2exendin-4(N)-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物的制備使用實施例1描述的相同的方法，3.4K丙酸ALD(2)PEG和exendin-4的N末端反應，并且僅提純N末端異構體，并且隨后與免疫球蛋白Fc結合。該反應在肽免疫球19蛋白Fc1:8的比例下4'C下進行17小時，并且蛋白的總濃度是50mg/ml。該反應在100mMK-P(pH6.0)溶液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。使用兩個純化柱純化結合反應溶液。首先，使用SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)去除還沒有參與結合反應的大量的免疫球蛋白Fc。使用20mMTris(PH7.5)和1M具有鹽梯度的NaCL，具有相對較弱的結合力的免疫球蛋白Fc被較早地洗脫，并且隨后exendin-4-免疫球蛋白Fc被洗脫。通過這第一步的純化操作，一定程度上去除了免疫球蛋白Fc，但是由于免疫球蛋白Fc和exendin-4-免疫球蛋白Fc在離子交換色譜柱上具有相互類似的結合力，因此它們不能被相互完全地分離。因此，利用兩種材料各自的疏水性進行二次純化。在SOURCEISO(HR16ml,AmershamBiosciences)使用20mMTris(pH7.5)1.5M的硫酸銨，首次被純化的樣品被結合，并且該樣品用梯度減少濃度的硫酸銨被洗脫。在HIC色語柱中，具有較弱結合力的免疫球蛋白Fc被較早的洗脫，并且隨后具有較強結合力的exendin-4-免疫球蛋白Fc樣品被洗脫。由于它們具有明顯不同的疏水性，比起在離子交換色語柱中它們可以更容易地相互分離。然而，由于不同的摩爾比使用了過量的免疫球蛋白Fc,僅適用HIC色諳柱不能獲得高純度。通過反相HPLC測定的純度是91.6%(圖1)。色語柱SOURCEQ(XK16ml，AmershamBiosciences)流速2.0ml/分鐘梯度A0->25%70分鐘B(A:20mMTrispH7.5，B:A+1MNaCl)色i普柱SOURCEISO(HR16ml,AmershamBiosciences)流速7.0ml/分鐘梯度B100->0%60分鐘B(A:20mMTrispH7.5,B:A+1.5M硫酸銨)實施例3.exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備使用實施例1中描述的相同的方法，3.4K丙酸ALD(2)PEG和exendin-4的賴氨酸(Lys)反應，并且僅賴氨酸異構體被純化，并且隨后與免疫球蛋白Fc結合。在兩個異構體的峰之間，最后的異構體的峰(Lys27的位置異構體)具有更多的反應并且它容易與N末端異構體峰區分，用于結合反應。該反應在肽免疫球蛋白Fc1:8的比例，4。C下進行16小時，蛋白的總濃度是50mg/ml。該反應在lOOmMK-P(pH6.0)溶液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。在結合反應后，使用SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml的兩步純化操作與實施例2相同。通過反相HPLC測定的純度是91.7%(圖2)。實施例4.去-氨基-組氨酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備為了使3.4KPropionALD(2)PEG與去-氨基-組氨酰基exendin-4(DA-exedin-4，AP,USA)的賴氨酸(Lys)殘基發生聚乙二醇化，通過使肽和3.4KPropionALD(2)以1:30的摩爾比在4'C下反應來進行聚乙二醇化，肽的濃度是3mg/ml。反應溶液是lOOmMPH7.5的Na-磷酸緩沖液，并且20mMSCB作為還原劑;故添加到其中。聚乙二醇化的肽通過使用SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)和SOURCES(XK16ml,AmershamBiosciences)的兩步純化操作進行純化。在兩個異構體的峰之間，具有更多的反應并且容易與N末端異構體的峰區分的最后的異構體的峰(Lys27的位置異構體)用于結合反應。該反應在肽免疫球蛋白Fc1:8的比例，4'C下進行20小時，蛋白的總濃度是60mg/ml。該反應在lOOmMK-P(pH6.0)中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。在結合后，使用與實施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml進行兩步純化。通過反相HPLC測定的純度是95.8%(圖3)。色語柱SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)流速2.0ml/分梯度A0->20%70分B(A:20mMTrispH9.0,B:A+1MNaCl)色譜柱SOURCES(XK16ml,AmershamBiosciences)流速2.0ml/分梯度A0->50%50分B(A:20mM檸檬酸pH3.0,B:A+1MKC1)實施例5羥基-咪唑-丙酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備使用實施例4中描述的相同方法，3.4KPropionALD(2)PEG和p-羥基-咪唑-丙酰基exendin-4(HY-exedin-4,AP,USA)的賴氨酸(Lys)殘基反應。在兩個異構體的峰之間，具有更多的反應并且容易與N末端異構體的峰區分的最后的異構體的峰(Lys27的位置異構體)用于結合反應。該反應在肽免疫球蛋白Fc1:8的比例，4。C下進行20小時，蛋白的總濃度是60mg/ml。該反應在lOOmMK-P(pH6.0)中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。在結合反應后，使用與實施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml進行兩步純化。通過反相HPLC測定的純度是93.9%(圖4)。實施例6.咪唑-乙酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備使用與實施例4中描述的相同方法，3.4KPropionALD(2)PEG和咪唑-乙酰基exendin-4(CA-exedin-4,AP,USA)的賴氨酸(Lys)殘基反應。在兩個異構體的峰之間，具有更多的反應并且容易與N末端異構體的峰區分的最后的異構體的峰(Lys27的21位置異構體)用于結合反應。該反應在肽免疫球蛋白Fc1:8的比例，4'C下進行20小時，蛋白的總濃度是60mg/ml。該反應在lOOmMK-P(pH6.0)中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。在結合反應后，使用與實施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml進行兩步純化。通過反相HPLC測定的純度是95.8%(圖5)。實施例7.Serl2突變的DAexendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備3.4KPropionALD(2)PEG和Serl2突變的DAexendin-4的賴氨酸(Lys)殘基進行聚乙二醇化，使所述肽和3.4KPropionALD(2)PEG以1:30摩爾比，肽的濃度為3mg/ml在25。C反應3小時。此時，反應在lOOmM濃度，pH7.5的Na-磷酸緩沖液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中進行反應。單聚乙二醇化的肽的純化操作使用SOURCEQ(XK16ml，AmershamBiosciences)而不使用SOURCES(XK16ml,AmershamBioscience)如實施例4中描述的進行。該反應在肽免疫球蛋白Fcl:8的比例，4'C下進行20小時，蛋白的總濃度是60mg/ml。該反應在100mMK-P(pH6.O)溶液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。由于Serl2突變的DAexendin-4具有更強的陰離子性質，不參與反應的過量的免疫球蛋白Fc僅使用SOURCEQ通過純化操作被有效地去除了。因此，使用SOURCEISO的純化操作被省略了，并且使用SOURCEQ的純化操作的條件與實施例2中的相同。通過反相HPLC測定的純度是92.5%(圖6)。實施例8.Argl2突變的DAexendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備使用與實施例7中描述的相同方法，3.4KPropionALD(2)PEG和Argl2突變的DAexendin-4(AP,USA)的賴氨酸(Lys)殘基反應并被純化。隨后，進行結合反應。該反應在肽免疫球蛋白Fcl:8的比例，4。C下進行20小時，蛋白的總濃度是60mg/ml。該反應在lOOmMK-P(pH6.0)溶液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。在結合反應后，使用與實施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml進行兩步純化。通過反相HPLC測定的純度是99.2%(圖7)。實施例9.氨基-組氨酰基exendin-4(Lys27)-白蛋白綴合物的制備使用與實施例4中描述的相同方法，3.4KPropionALD(2)PEG和去-氨基-組氨酰基exendin-4(AP，USA)的賴氨酸(Lys)殘基反應并被純化。該反應在肽作為載體物質的源于人血的白蛋白(Greencross,SouthKorea)以1:7的比例，4。C下進行24小時，蛋白的總濃度是50mg/ml。該反應在lOOmMK-P(pH6.0)溶液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。在結合反應后，使用與實施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml進行兩步純化。通過反相HPLC測定的純度是90.3%(圖8)。實施例10.二甲基-組氨酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備使用二曱基-組氨酰基exendin-4(DMexendin,AP,USA)，由與實施例4中描述的相同方法制備二曱基-組氨酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物。通過反相HPLC測定的純度是96.4%(圖9)。實施例11.GLP-1(N)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備3.4KButyrALD(2)PEG(具有兩個丁醛基團的PEG,Nekatar,USA)和GLP-1的N末端UP,USA)通過1:5摩爾比的肽和PEG在4。C下反應90分鐘進行聚乙二醇化，肽的濃度是3m/ml。此時，該反應在lOOmMK-P(pH6.O)溶液中進行，并且20raMSCB(NaCNBH3)作為還原劑被添加到其中。隨后，該反應在肽免疫球蛋白Fc以1:IO的比例，4'C下進行16小時，蛋白的總濃度是50mg/ml。該反應在lOOmMK-P(pH6.0)溶液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。在結合反應后，使用與實施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml進行兩步純化。通過反相HPLC測定的純度是91%(圖10)。實施例12去-氨基-組氨酰基-GLP-l(Lys27)-免疫球蛋白Fc綴合物的制備3.4KPropionALD(2)PEG和去-氨基-組氨酰基GLP-1的賴氨酸(Lys)殘基(AP，USA)進行聚乙二醇化，使l:30摩爾比的肽和3.4KPropionALD(2)在4'C下反應4小時，肽的濃度是3m/mi。此時，該反應在pH7.5,lOOmM濃度的Na-磷酸緩沖液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中來進行反應。單聚乙二醇化的肽的純化操作使用SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)進行。該反應在肽免疫球蛋白Fc以1:6的比例，4'C下進行16小時,蛋白的總濃度是60mg/ml。該反應在1OOmMK-P(pH6.0)溶液中進行，并且20mMSCB作為還原劑被添加到其中。在結合反應后，使用與實施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml進行兩步純化。但是，由于GLP-1免疫球蛋白Fc綴合物和免疫球蛋白Fc之間的疏水性的差異小于exendin-4免疫球蛋白Fc和免疫球蛋白Fc之間的疏水性，所以在SOURCEISO16ml中的溶解度下降了。因此，在上述純化操作后還要進行使用SOURCEISO16ml的純化操作。通過反相HPLC測定的純度是91.9%(圖11)。實施例13.使用ButyrALD連接器PEG的綴合物的制備使用3.4KButyrALD(2)PEG(具有兩個丁醛基團的PEG,Nektar,USA),用與實施例1中描述的相同方法制備3.4Kexendin-4。它使用實施例3中描述的相同方法與免疫球蛋白Fc結合。通過反相HPLC測定的純度是92.3%(圖12)。實施例14.exendin-4體外活性持續釋放的測定為了測定exendin-4的長效制劑的功效，使用測定體外細胞活性的方法。通常，為了測定GLP-1的體外活性，分離胰島瘤細胞或胰島，并且測定細胞中的cAMP's是否在GLP-1治療后增加。對于本實驗中使用的測定體外活性的方法，使用已知為老鼠胰島瘤細胞的RIN-m5F(ATCC.)細胞。這些細胞具有GLP-1受體，并且因此它們通常用于測定GLP-1家族的體外活性的方法中。用GLP-1，exendin-4處理RIN-m5F,并且實驗材料是不同的濃度。細胞中的信號分子cAMP's的出現通過實驗材料被測定，并且從而評價EC50，并相互比較。結果在表l中顯示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>_DMexendin-4:二曱基-組氨醜基exendin-4-DAexendin-4:去-氨基-組氨酰基exendin-4_HYexendin-4:p-羥基-咪口坐-丙酰基exendin-4-CAexendin-4:咪峻-乙酰基exendin-4-Serl2DAexendin-4:DAexendin-4其中exendin-4的第12位賴氨酸殘基用絲氨酸取代-DAGLP-1:去-氨基-組氨酰基-GLP-1-Exendin-4(N)-PEG-Fc:exendin-4的N末端和Fc區被連接到PEG的綴合物-Exendin-4(Lys27)-PEG-Fc:exendin-4第27位的賴氨酸殘基和Fc區被連接到PEG的綴合物-DMexendin-4(Lys27)-PEG-Fc:二曱基-組氨酰基exendin-4第27位的賴氨酸殘基和Fc區被連j妻到PEG的綴合物-DAexendin-4(Lys27)-PEG-Fc:去-氨基-組氨酰基exendin-4第27位的賴氨酸殘基和Fc區被連接到PEG的綴合物-HYexendin-4(Lys)-PEG-Fc:p-羥基-。米唑-丙醜基exendin-4第27位的賴氨酸殘基和Fc區被連接到PEG的綴合物-CAexendin-4ays)-PEG-Fc:咪峻-乙酰基exendin-4第27位的賴氨酸殘基和Fc區被連接到PEG的綴合物-Serl2DAexendin-4(Lys27)-PEG-Fc:Ser12去-氨基-組氨酰基exendin-4第27位的賴氨酸殘基和Fc區被連接到PEG的綴合物，其中exendin-4的第12位殘基被絲氨酸取代-DAexendin—4(Lys27)—PEG-Albumin:去-氨基—組氨酰基exendin—4第27位的賴氨酸殘基和白蛋白被連接到PEG的綴合物-DAGLP-l(Lys20,28)-PEG-Fc:去-氨基-組氨酰基GLP-1的賴氨酸殘基和Fc區被連接到PEG的綴合物實施例15.長效exendin-4的體內功效實驗為了測定長效制劑exendin-4的體內功效，使用測定糖尿病模型的db/db小鼠血液中葡萄糖濃度減少的效果的方法。100mcg/kg長效exendin-4制劑兩周給藥一次，并且100mcg/kg的天然exendin-4被每天給藥給6至7周大的糖尿病小鼠，不限制食物。在服用實驗材料后，每天收集血液，并且測定血液葡萄糖含量的變化。特別地，使用天然的exendin-4時，血液葡萄糖濃度在給藥1小時后被測定(圖14)。當給藥一次時，Exendin-4衍生物的綴合物能維持血液葡萄糖濃度的減少達10天或更久，而天然exendin-4的綴合物的減少葡萄糖的活性在8天后消失。工業適用性本發明的促胰島素肽的綴合物在體內維持相對高的活性，并且顯著增加血液半衰期，并且因此它可以如愿地用于各種肽類藥物的長效配方的開發中。權利要求1.一種促胰島素肽綴合物，所述綴合物含有通過非肽聚合物連接的促胰島素肽和免疫球蛋白Fc區，其中所述的非肽聚合物選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和它們組合的組，并且，其中所述非肽聚合物的一個末端與所述促胰島素肽的非N末端的氨基酸殘基連接。2.根據權利要求1所述的促胰島素肽綴合物，其中所述促胰島素肽選自包括GLP-1，exendin-3，exendin-4,激動劑，衍生物，片段和其變體,以及它們的組合的組。3.根據權利要求2所述的促胰島素肽綴合物，其中所述衍生物選自包括肽，和片段和其變體的組，其中所述的肽具有促胰島素功能并且取代，敲除或修飾了天然促胰島素肽的N末端的氨基。4.根據權利要求2所述的促胰島素肽綴合物，其中所述書f生物選自包括肽，和片段和其變體的組，其中所述的肽敲除了天然促胰島素肽的N末端的a碳并含有其氨基。5.—種促胰島素肽綴合物，其中exendin-4的衍生物和免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物被連接，其中所述exendin-4的衍生物的N末端的氨基被取代，被敲除或被修飾，其中所述非肽聚合物選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和它們的組合的組，并且，其中與含有天然exendin-4的綴合物相比，所述促胰島素肽綴合物具有降低血液中葡萄糖濃度和增加體內功效持續時間的改善效果。6.根據權利要求5所述的促胰島素肽綴合物，其中所述exendin-4衍生物選自包括通過敲除N末端氨基而制備的exendin-4衍生物，通過用羥基取代N末端氨基而制備的exendin-4衍生物，通過用二曱基修飾N末端氨基而制備的exendin-4衍生物，通過敲除所述促胰島素肽中的exendin-4的第一氨基酸即組氨酸的a碳而制備的exendin-4衍生物，通過用絲氨酸取代第12位氨基酸(賴氨酸)而制備的exendin-4書f生物和通過用精氨酸取代第12位氨基酸(賴氨酸)而制備的exendin-4衍生物的組。7.—種促胰島素肽綴合物，其中通過敲除exendin-4的N末端氨基而制備的去-氨基-組氨酰基exendin-4與免疫球蛋白Fc通過非肽聚合物連接，其中所述非肽聚合物選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和它們組合的組，并且，其中與含有天然exendin-4的綴合物相比，所述促胰島素肽綴合物具有降低血液中葡萄糖濃度和增加體內功效持續時間的改善效果。8.—種促胰島素肽綴合物，其中通過敲除exendin-4的N末端氨基而制備的去-氨基-組氨酰基exendin-4與白蛋白通過非肽聚合物連接，其中所述非肽聚合物選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和它們組合的組，并且，其中與含有天然exendin-4的綴合物相比，所述促胰島素肽綴合物具有降低血液中葡萄糖濃度和增加體內功效持續時間的改善效果。9.一種促胰島素肽綴合物，其中通過用羥基取代exendin-4的N末端氨基而制備的exendin-4與免疫球蛋白Fc通過非肽聚合物連接，其中所述非肽聚合物選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和它們組合的組，并且，其中與含有天然exendin-4的綴合物相比，所述促胰島素肽的綴合物具有降低血液中葡萄糖濃度和增加體內功效持續時間的改善效果。10.—種促胰島素肽的綴合物，其中通過用羥基取代exendin-4的N末端氨基而制備的exendin-4與白蛋白通過非肽聚合物連接，其中所述非肽聚合物選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和它們組合的組，并且，其中與含有天然exendin-4的綴合物相比，所述促胰島素肽綴合物具有降低血液中葡萄糖濃度和增加體內功效持續時間的改善效果。11.一種促胰島素肽的綴合物，其中通過敲除exendin-4的N末端組氨酸的a碳并含有N末端氨基而制備的exendin-4衍生物與免疫球蛋白Fc通過非肽聚合物連接，其中所述非肽聚合物選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和其組合的組，并且，其中與含有天然exendin-4的綴合物相比，所述促胰島素肽綴合物具有降低血液中葡萄糖濃度和增加體內功效持續時間的改善效果。12.—種促胰島素肽綴合物，其中通過敲除exendin-4的N末端組氨酸的cc碳并含有N末端氨基而制備的exendin-4衍生物與白蛋白通過非肽聚合物連接，其中所述非肽聚合物選自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和其組合的組，其中與含有天然exendin-4的綴合物相比，所述促胰島素肽的綴合物具有降低血液中葡萄糖濃度和增加體內功效持續時間的改善效果。13.—種促胰島素肽的衍生物，其中所迷促胰島素^"生物由下面的化學式1表示RrX-Y-Z-R2<化學式1>其中，R,選自包括組氨酸，去-氨基-組氨酰基，N-二曱基-組氨酰基，P-羥基-咪唑丙基和4-咪唑乙酰基的組；R2選自包括-NH2，-OH和-Lys的組；X選自包4舌Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gin-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va卜Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Uu-R4-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gin-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va卜Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-R4-Asn-Gly-Gly,和Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gin-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va卜Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-R4-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser的組；R3選自包4舌Lys,Ser和Arg的組；R4選自包括Lys,Ser和Arg的組；Y是聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂類聚合物，幾丁質，透明質酸和它們組合的組；和Z是免疫球蛋白Fc區。14.根據權利要求1所述的促胰島素肽綴合物，其中所述非肽聚合物的兩個末端分別與所述免疫球蛋白Fc區的氨基或巰基和所述促胰島素肽連接。15.根據權利要求1所述的促胰島素肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區是去糖基化的。16.根據權利要求1所述的促胰島素肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區由選自包括Cl，C2，C3和C4結構域的組的一個至4個結構域組成。17.根據權利要求16所述的促胰島素肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區還包括交鏈區域。18.根據權利要求1至5中的任何一項所述的促胰島素肽綴合物，其中所述促胰島素肽的Fc區是來自免疫球蛋白的Fc區，其中所述的免疫球蛋白選自包括IgG，IgA，IgD,IgE和IgM的組。19.根據權利要求18所述的促胰島素肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區的每個結構域是來自免疫球蛋白的不同源的結構域雜交體，其中所述的免疫球蛋白選自包括IgG,IgA，IgD,IgE和IgM的組。20.根據權利要求18所述的促胰島素肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區是由相同源的單鏈免疫球蛋白組成的二聚體或多聚體(即免疫球蛋白Fc的結合體)。21.根據權利要求18所述的促胰島素肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區是IgG4Fc區。22.根據權利要求21所述的促胰島素肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區是人源去糖基化的IgG4Fc區。23.根據權利要求1所述的促胰島素肽綴合物，其中所述非肽聚合物的反應基選自包括酰基，丙醛基，丁醛基，馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺衍生物的組。24.根據權利要求23所述的促胰島素肽綴合物，其中所述琥珀酰亞胺衍生物選自包括琥珀酰亞胺基丙酸酯，琥珀酰亞胺基羧曱基酯，羥基琥珀酰亞胺或琥珀酰亞胺基碳酸酯的組。25.根據權利要求23所述的促胰島素肽綴合物，其中所述非肽聚合物的兩個末端具有反應性眵基。26.根據權利要求25所述的促胰島素肽綴合物，其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。27.—種制備促胰島素肽綴合物的方法，所述方法包括以下步驟(1)將兩個末端具有反應基的非肽聚合物和促胰島素肽的氨基或巰基共價地連接，其中所述的反應基選自包括乙醛，馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物的組；(2)從(1)的反應混合物中分離出含有促胰島素肽的綴合物，其中所述非肽聚合物與除了N末端氨基酸之外的其他氨基酸共價連接；和(3)將免疫球蛋白Fc區共價地連接到被分離的綴合物的非肽聚合物的另一個末端，產生含有免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽分別與所述的非肽聚合物的一個末端連接。28.—種制備促胰島素肽綴合物的方法，所述方法包括以下步驟(1)在pH7.5或更高的pH下，將在兩個末端具有反應性醛基的非肽聚合物與促胰島素肽的賴氨酸殘基共價地連接；(2)從(1)的反應混合物中分離出含有所述促胰島素肽的綴合物，其中所述非肽聚合物與所述賴氨酸殘基共價連接；和(3)將免疫球蛋白Fc區共價地連接到被分離的綴合物的非肽聚合物的另一個末端，產生含有免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的肽綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽分別與所述的非肽聚合物的一個末端連接。29.根據權利要求27或28所述的制備促胰島素肽綴合物的方法，其中所述促胰島素肽是通過敲除N末端氨基制備的去-氨基-組氨酰基exendin-4。30.根據權利要求27或28所述的制備促胰島素肽綴合物的方法，其中所述促胰島素肽是通過用羥基取代N末端的氨基制備的exendin-4衍生物。31.根據權利要求27或28所述的制備促胰島素肽綴合物的方法，其中所述促胰島素肽是通過敲除exendin-4的第一個氨基酸即組氨酸的af灰制備的exendin-4書f生物。32.根據權利要求27或28所述的制備促胰島素肽綴合物的方法，其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。33.用于治療糖尿病，肥胖癥，急性冠狀綜合癥或多囊卵巢綜合癥的藥物組合物，所述組合物包括權利要求1至32中任何一項所述的肽綴合物。全文摘要本發明涉及一種具有改善體內功效和穩定性持續時間作用的促胰島素肽綴合物，該肽綴合物包括促胰島素肽，非肽聚合物和免疫球蛋白Fc區，它們以共價鍵相互連接，本發明還涉及該肽的綴合物的用途。本發明的促胰島素肽綴合物具有相對高的體內活性，并顯著增加血液半衰期，因此它可以如愿地用于各種肽類藥物的長效配方的開發。文檔編號A61K38/28GK101646451SQ200880001766公開日2010年2月10日申請日期2008年1月4日優先權日2007年1月5日發明者宋臺憲,宋大海,崔仁榮,權世昌,李寬淳,林昌基,鄭圣燁,金永勳申請人:韓美藥品工業株式會社