專利名稱：用于皮膚傷口無疤痕愈合的多靶標RNAi治療的制作方法
用于皮膚傷口無疤痕愈合的多靶標RNAi治療發明涉及領域本發明是關于皮膚傷口或其他皮膚疾病，如銀屑病、系統性紅斑狼瘡引起的皮膚 損傷的組合物和方法，其中使用的方法是針對多個致病基因的寡聚核苷酸序列的小干擾 RNA(siRNA) “雞尾酒”。本應用享有2007年11月6日申請的、美國臨時申請號為60/985，820的專利的優 先權，本發明引用此專利以保持系統性和完整性。背景皮膚是機體最大的器官，由下層的內皮層(真皮)和外部的上皮層(表皮)組成， 皮膚的基本功能是作為對外界環境的保護屏障。由于受傷或疾病使大面積皮膚散失完整性 后，可能引起主要功能散失甚至死亡。在美國，每年有超過125萬燒傷患者和650萬因擠壓、 靜脈淤滯或糖尿病引起的慢性皮膚潰瘍患者。傷口治療的首要目標是快速的愈合并恢復功 能，同時盡量減少疤痕面積、恢復美觀(1)。近期細胞和分子生物學發展迅猛，極大增強了我 們對傷口修復和組織再生的生物學過程的理解，也提升了傷口護理的水平(2)。傷口修復皮膚損傷的快諫反應受傷后恢復組織完整性的過程，是一個系統發育過程中形成的基本而重要的功 能，即宿主的天然免疫反應過程。高等脊椎動物不象低等脊椎動物，后者組織損壞后還能重 構，而前者快速修復形成纖維化的疤痕。無論是創傷、微生物感染或外來物質造成的損傷， 均會以時間重疊的方式發生一系列事件，包括凝結、炎癥、上皮再生、形成肉芽組織、基質和 組織重塑等。修復過程主要由分子信號，主要是細胞因子相互作用介導，這種作用可激活和 調節細胞活性增加多倍，說明炎癥和愈合的重要性。受傷后的反應經常通過構建皮膚模型 來研究(1)，大多數組織損傷后發生的細胞事件以及介導因子的瞬時調節模式都和皮膚相 似。損傷初期引發凝結，隨后是局部的急性炎癥反應，接著間葉細胞富集、增殖，基質合成。 炎癥處理不當將導致慢性而非愈合性的傷口，不可控制的基質累積(經常包含各種細胞因 子通路)導致額外的疤痕和纖維化的后遺癥。在鑒別細胞因子的功能方面的不斷進步，為 探索通過抑制/增強細胞因子來控制或調節病理修復提供了可能性。胚胎傷口的無疤痕快諫愈合傷口愈合是一個動態的相互的過程，過程中涉及到可溶性介質、血細胞、細胞間質 和實質細胞。傷口愈合過程所包括的三個階段一炎癥、組織形成和組織重塑一部分在時 間上有重疊(1，2)。在胚胎皮膚形成階段，單細胞繁殖形成基底層后產生的角質細胞，經生 長停滯期后，在分化程序的嚴格控制下向上遷移成為形態學究全不同的表皮層。使用類似 的程序，表皮在有機體的整個生命過程中不斷更新。表皮形成后，成年哺乳動物皮膚也有快 速修復損傷的能力。然而，如果追求快速促進傷口愈合和防止感染，則會導致傷口愈合不完 美，常伴有表皮層和真皮層的傷疤出現。相對于成年人的皮膚傷口修復，妊娠早期哺乳胎兒的傷口是通過再生過程修復 的，其真皮和表皮能夠進行完美的無傷疤重建(1，2)。以下幾個是顯著的胎兒和成人傷口 修復之間的差異胎兒傷口修復得比較快，并且很少或者不出現炎癥反應(3)，其細胞因子
4/生長因子表達譜不同，通常是較低的(4)。TGF- β抗體可部分地減少疤痕數量有大量證據表明傷口修復受細胞因子、生長因子及其它們的受體等一系列因子的 調節(5-7)。它們能夠通過一種復雜但有序的模式影響細胞的遷移、生長和增生，同時與嗜 中性白細胞及巨噬細胞的浸潤、血管生成、纖維素增生、基質沉積、傷疤形成和表皮再植等 有關。在傷口修復過程中，除了血小板與巨噬細胞，成纖維細胞是細胞因子或生長因子的主 要來源。早期妊娠胎兒皮膚傷口的無疤痕修復主要是特定的細胞因子或生長因子作用的結^ ο這些因子中，涉及無疤痕愈合與產生疤痕的修復這兩個過程之間相互轉化的轉化 生長因子β (TGF-β)，已經得到廣泛研究。由于歷史原因而取名的生長因子，其主要功能 是調控細胞增值和分化，刺激細胞外基質如膠原的合成。在正常無疤痕胎兒的傷口中外源 添加TGF-β導致疤痕形成，同時還觀察到類似于成年人的炎癥反應。在成年鼠皮膚傷口使 用TGF-β抗體中和后傷口部分地減少了疤痕的數量，驗證了這種TGF-β的促纖維化特性。 TGF-β刺激產生I型膠原，這是成年機體皮膚主要的膠原類型。另一方面，TGF-β中和抗體 沒有完全阻止成人皮膚疤痕形成，因而近期一些研究對最為主要的疤痕形成因子的TGF-β 的功能提出了質疑(8-15)。研究發現在受傷的Ε16 (胚胎期第16天)動物模型中，TGF-β 1和β 2表達的 下降和快速清除伴隨著TGF-β 3水平的升高和半衰期的延長，發生有序的膠原沉積。相 反，Ε19(胚胎期第19天)動物非損傷模型中，增加和延長TGF-β 1和β 2的表達會導致 TGF-β 3表達的下降和延緩，伴隨無序的膠原結構。這意味著TGF-βΙ和β 2表達的增加， TGF-β 3表達的下降是晚期妊娠胎兒傷口形成的主要原因。這些觀察結果對于理解TGF-β 促進內源傷口愈合反應具有廣泛的意義，說明過量表達TGF-β很可能是快速有效保護機 體的應急反應的正常組分。然而，無感染的情況下，減少這一過量表達、炎癥和角化細胞抑 制，可以減少疤痕產生。C0X-2抑制劑減少傷疤組織形成和提高組織拉伸強度在研究胎兒傷疤修復過程中的白介素IL-6、IL-8和IL-10時，近來C0X-2也受到 了廣泛的關注，因其參與了炎癥失調性疾病的發生，如類風濕病、骨關節炎、心血管疾病和 癌癥形成等(16-20)。C0X-2參與炎癥早期的上調反應(20，21)，如傷口炎癥反應。C0X-2 指導合成的前列腺素參與調控炎癥反應的多個方面，包括血管滲透、促炎細胞的浸潤和活 化(22)。研究者對于成年人傷口修復過程中C0X-2途徑和其它途徑的炎癥反應的興趣逐漸 增加(35)，因為這些早期事件也調節修復的效果。根據C0X-2參與炎癥反應以及近期闡明 它在傷口修復的其他幾個方面的作用(23-25)，對C0X-2在胎兒傷口愈合中的作用進行了 研究。研究表明C0X-2酶在妊娠胎兒傷口修復過程的早期和晚期的表達存在差異。此外，C0X-2的產物PGE2也參與了許多反應過程，在胎兒傷口早期使用PGE2后， 出現修復過程延緩，最終形成傷疤的現象。在無疤痕修復中增加PGE2水平后，使無傷疤的 修復過程轉為生成傷疤的修復，更突出表明了 C0X-2通路在傷疤形成中的作用。盡管沒有 研究PGE2對膠原沉積物或膠原纖維是否有作用，但在胎兒傷口中使用后可以誘導炎癥反應 (26)。PEG2是具有免疫抑制或抗炎癥的特性還是作為一種促炎分子，最有可能是由PEG2受 體表達或活性的差異決定的。有幾個看似合理的關于PGE2介導胎兒傷口形成傷疤的機制PGE2能夠增強急性炎癥反應，除了已知的能干擾無疤痕愈合，還通過募集或活化炎性細胞 間接地促進疤痕的形成。PGE2處理既能延緩傷口修復，也能通過增加促纖維化因子TGF- β 使疤痕組織沉積(27)。在smad3缺失型小鼠中阻斷TGF-β信號途徑能夠加快修復的速率， 大量的數據表明抑制TGF-β 3水平對無傷疤的修復是至關重要的。最后一點，有數據表明 成纖維細胞在有PGE2的情況下繁殖加速，表明PGE2能夠直接促進纖維細胞的增生，促進膠 原形成和傷疤產生。之前的各種研究表明接觸PGE2后，膠原沉積和成纖維細胞繁殖均增加， 也支持了這一觀點。這些實質性的數據意味著低水平C0X-2表達和PGe2對于胎兒皮膚無 疤痕修復是必需的，PGE2S導胎兒皮膚疤痕形成的事實進一步支持了 C0X-2途徑在疤痕產 生中的作用。用C0X-2抑制劑celecoxib (賽來考昔)治療切割傷口，研究表明C0X-2的功 能是顯著抑制傷口部位幾個炎癥反應參數(28)。傷口修復過程中早期炎癥反應的降低對之 后的整個修復過程產生極重要的影響，即減少疤痕組織形成的同時，不損壞再上皮化過程 及不降低抗拉強度。HoxB13 KO小鼠皮膚傷口愈合更快、疤痕組織形成更少由于能在器官形成中精確地指導分化功能，進化保守的Hox轉錄因子家族一直被 認為是調節致死性皮膚再生的極具吸引力的候選靶標。研究確認Hox蛋白家族中一個特殊 成員--H0XB13-是中期妊娠皮膚來源的原代培養細胞中表達的主要Hox基因(29)。隨后使 用中期胚胎(該階段傷口可無疤痕愈合)皮膚和成年皮膚進行的傷口愈合研究表明HoxB13 在胎兒和成年人體內的表達水平不一致。有趣的是，與非傷口對照相比，HoxB13在胎兒傷 口組織中的表達水平較低；而成年人體內HoxB13的表達水平在傷口和非傷口組織中幾乎 沒有顯著區別。綜上所述，HoxB13的低水平表達在胎兒無疤痕傷口修復的過程中是不可或 缺的，也使通過降低或去除成人皮膚的HoxB13來促進傷口愈合的可能性增加。在HoxB13基因敲除(KO)的成年鼠皮膚切除或切割傷口展開的愈合研究表明，與 其野生型(WT)相比，HOXB13K0的傷口顯示了一些早期胚胎皮膚傷口的特征，包括快速愈 合、組織抗拉強度的增加以及真皮層傷疤的減少。生化鑒定顯示表皮與真皮中的透明質酸 (HA)在未受傷的成年HoxB13K0皮膚中的表達水平明顯高于WT皮膚。組織學對比研究表 明HoxB13K0皮膚切割傷口的愈合能力較強，真皮層修復也比WT傷口完整，其皮膚切除傷口 也比WT傷口愈合得更快。在HoxB13K0傷口中，膠原聚集得比較松弛，大部分交織成網狀 結構，類似于未受過傷的皮膚，說明HoxB13K0傷口中的膠原重塑后將重新組成正常的真皮 結構。利用生物芯片分析成年WT和HoxB13K0小鼠整個皮膚中的基因表達譜，結果表明幾 個表皮分化指標在未受傷的HoxB13K0成年鼠皮膚中明顯低于未受傷的WT成年鼠皮膚。對 HoxB 13K0小鼠的傷口修復研究進一步證實了 HoxB13是促進傷口無疤痕愈合的一個潛在靶 標基因(29-31)。傷口愈合過程涉及的其他因素胚胎皮膚損傷反應與成人極大不同，前者只有微弱的炎癥反應，很少量的成纖維 細胞增殖，而且只有重要的膠原蛋白沉積。因為血小板衍生生長因子(PDGF)在成人傷口愈 合調控過程中起到重要作用，有研究著重觀察了 PDGF對于胚胎傷口處細胞和細胞外基質 事件的影響。硅橡膠(SILASTIC)型損傷移植到子宮內1、3或5天后收集樣本，用標準的免 疫組化程序處理后進行評估。PDGF治療的移植損傷的急性炎癥反應、成纖維細胞聚集和透 明質酸沉積顯著增多。這些差異很大程度上是時間和PDGF劑量依賴性的，數據顯示胚胎修復是在無PDGF條件下開始的。胚胎傷口無疤痕愈合的關鍵特征是沒有一般受傷情況下的炎癥反應，而較晚期胚 胎和成人皮膚傷口愈合過程中有強烈的炎癥反應，并最終在傷口區域形成永久性疤痕。白 介素IL-6和IL-8在胚胎傷口修復中的作用已經被研究清楚，但傷口修復中的其他一些炎 癥介導因子的作用還不清楚。Smad3蛋白參與轉化生長因子β超家族介導的細胞內信號轉 導，對細胞增殖、分化、遷移以及詳細闡明皮膚傷口修復基質中樞具有重要作用。體外Smad3 和激素信號相互作用的研究表明這是控制細胞活性的重要機制，但是還未能在體內觀察到 相同的機制。Ashcrof t GS等體內研究發現，Smad3在雄激素抑制傷口愈合過程中發揮作用， 而不參與雌激素調節反應。野生型和Smad3缺陷型雌鼠卵巢切除后愈合延緩，并可用雌激 素替代療法恢復愈合速度。相反，閹割能夠加速野生型雄鼠的愈合，并可被外源性的雄激素 逆轉。令人驚奇的是，調節Smad3缺陷型鼠中雄激素的水平，傷口愈合反應沒有明顯變化。 突變型單核細胞能夠被脂多糖刺激，以與野生型細胞類似的方式產生特異的促炎介質(巨 噬細胞單核細胞抑制因子)，對雄激素介導的刺激反應緩和，而能維持雌激素誘導的巨噬細 胞抑制因子的正常反應。這些數據意味著Smad3在一般的傷口愈合反應的雌激素信號轉導 中發揮作用，也表明Smad3參與調節雌激素介導的炎癥細胞活性。纖粘連蛋白(FN)是一個多功能的粘性蛋白，參與傷口修復的多個步驟。有足夠的 證據表明FN蛋白的多樣性受RNA剪輯調控，而轉錄和RNA加工過程是受到發育、衰老以及 組織/細胞類型調控的。FN基因的表達、調控和生物學功能，以及各種剪輯形式仍然不清 楚。分別在胚胎期(懷孕21-23天)、斷乳幼畜(4-6周)和成年兔(> 6個月)的氣管和 皮膚部位切割形成傷口，通過mRNA差異表達分析，克隆cDNA測序后經real-tmie PCR確證， 分析基因表達譜。在剛斷乳幼兔氣管粘膜傷口中，Fnl和Sfrs3轉錄水平升高維持了超過 48個小時。鼻下氣管粘膜傷口中兩個基因表達上升比皮膚傷口更顯著，表明Fnl和Sfrs3 兩個基因在鼻下氣管粘膜傷口中的作用是組織特異性的。有證據表明SRp20確實參與FN的 替代性剪輯，在成人傷口修復過程中出現的是FN的變體。研究發現，鼻下氣管粘膜傷口愈 合的早期，Sfrs3分子活性增強與FN基因表達的調控相關，后者通過不同的剪輯機制調控。多靶標siRNA組成RNA干擾(RNAi)是一種序列特異性的RNA降解過程，提供了一種理論上可以簡便 而直接敲低或沉默任何基因的方式(33，34)。在自然發生的RNA干擾中，雙鏈RNA被RNA酶 III/解旋酶蛋白Dicer剪切成為小的干擾RNA分子(siRNA)，這是一種19-23個堿基對長 度的、3’末端有2個堿基突出的雙鏈RNA(dsRNA)。這些siRNA整合進入一個名為RNA誘導 的沉默復合物(RISC)的多組分核糖核酸酶，siRNA中的一條鏈保持與RISC結合，并將復合 物導向與RISC中引導ss-siRNA序列互補的同源RNA。該siRNA指導核酸內切酶消化RNA， 從而使之失活。有研究顯示利用化學合成的21-25個堿基對的siRNA在哺乳動物中顯示了 RNAi效果，且siRNA雜交(末端或中間)的熱力學穩定性在分子功能上起到了關鍵性的作 用(33，36，37)。重要的是，目前研究者還不可能滿懷信心地說潛在靶向疾病基因mRNA序列的候 選siRNA事實上一定會顯示有效的RNAi活性。相反，每一個合成的候選siRNA必須在培養 的哺乳動物細胞中進行檢測，以確定是否發生對靶基因的干擾。siRNA獨特的優勢是可以 在一項治療中聯合多個siRNA靶向多個致病基因，因為所有的siRNA來源相同，制備過程一
7樣，具有化學同源性(33，36-40)。總之，有關成人皮膚傷口無疤痕愈合所涉及的分子靶標，已經得到充分的確證和 評估。選擇分別靶向促纖維化因子TGF-β、促炎因子C0X-2和分化調節因子Hoxbl3的最有 效的siRNA成為緊迫需求，更需要將它們整合成多靶標雞尾酒藥物。未來需要一種強大的 治療手段，以提高那些深受損傷和各類疾病所致皮膚傷口之苦的病人的愈合效果。因此，使 用多靶標RNAi治療促進各種皮膚傷口的愈合符合當前的發展趨勢。小結本發明涉及使用siRNA分子治療皮膚傷口，所涉及的小干擾RNA (siRNA)分子是雙 鏈寡聚核苷酸，該寡聚核苷酸的靶標是具有互補核苷酸序列的單鏈(ss)RNA分子。ss靶RNA 分子可以是一種mRNA，后者至少編碼多肽或蛋白的一部分，多肽或蛋白的活性是促進炎癥、 傷口愈合或皮膚組織疤痕形成。ss靶RNA分子也可以是一種microRNA (miRNA)，其功能是 作為一種促進炎癥、傷口愈合或皮膚組織疤痕形成的調控分子。 這些分子結合藥學上可接受的載體，提供了 一種給藥方式。本發明的一個實施例 中，藥物由藥學上可接受的載體和至少三種siRNA分子組成，每一個siRNA分子與編碼一個 基因的mRNA分子結合，這些基因選自促炎通路基因、促血管生成通路基因和促細胞增殖通 路基因。本發明也提供了一種處理表皮或真皮傷口的方法，其中的傷口至少部分發生炎癥 和血管新生。該方法所指的給藥組分包括本發明中的至少一種siRNA和藥學上可接受的載 體，分子至少能夠抑制一個基因的表達，該基因的編碼產物可促進傷口愈合時的病理學或 非預期的過程。本發明的方法和組分對皮膚傷口和其它皮膚損傷的無疤痕愈合有促進作用。圖片的簡要描述
圖1.正常嘴唇和背部皮膚的蘇木素_伊紅(HE)染色(比例尺=50 μ m)。圖2.野生型和Hoxbl3敲除型傷口活組織檢查觀察到的膠原結構(比例尺= 50μπι)。A列.低倍鏡(目鏡為IOX或20Χ)下觀察野生型小鼠傷口活體組織檢查；B 列.高倍鏡(目鏡為100Χ)下觀察野生型小鼠傷口活體組織檢查；C.低倍鏡(目鏡為IOX 或20Χ)下觀察HoXbl3K0型小鼠傷口活體組織檢查；D.高倍鏡(目鏡為100X)下觀察 Hoxbl3K0型小鼠傷口活體組織檢查。第1排未受傷的正常組織；第2排第20天的傷口 活體組織檢查 ’第3排第30天的傷口活體組織檢查 ’第4排第60天的傷口活體組織檢 查。紅色箭頭所指為印度墨水染色位置。圖3.用從野生型和Hoxbl3敲除小鼠來源的真皮原代成纖維細胞開展劃傷實驗 (誤差棒為六次重復實驗計算結果)。圖4.表達REK的H0XB13小鼠增殖效率降低。1 X IO4個細胞接種到96孔板內，根 據Molecular Probe公司的操作說明進行MTT檢測。圖5.懸浮培養(lifted culture)過量表達H0XB13的細胞5天，將導致異常分化 (HE染色)。圖6. GFP-HOXB13蛋白定位于REK和293細胞核內。圖7. A.小鼠VEGF、VEGFRl和VEGFR2mRNA靶序列的位置。B.體外轉染s iRNA后 檢測mRNA被敲低的效果。
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圖8.局部導入靶向VEGF通路的siRNA抑制CpG-ODN誘導的血管增生。圖9. Raf-I的siRNA被HK聚合物介導進入腫瘤內后抑制腫瘤生長。圖10.在PC3細胞的總RNA樣品中檢測所有三個mRNA序列的量。使用的引物可 以檢測到PC3細胞總RNA中的三種mRNA。左下標明的是用于RT-PCR分析的引物名稱，靶向 性siRNA標于泳道的上方。圖11. TGF^-2siRNA能夠顯著抑制PC3細胞中靶基因的表達。用于RT-PCR分析 的引物標于左下第二列，靶向性siRNA標于左下第一列。圖12. Coxl siRNA能夠顯著抑制PC3細胞中靶基因的表達。用于RT-PCR分析的 引物標于左下第二列，靶向性siRNA標于左下第一列。圖13. Hoxl siRNA能夠顯著抑制PC3細胞中靶基因的表達。用于RT-PCR分析的 引物標于左下第二列，靶向性siRNA標于左下第一列。圖14.用RT-PCR分析來選擇有效的siRNA寡聚核苷酸。瓊脂糖凝膠電泳分析檢 測三種siRNA對相應基因的沉默效果。A.通過在人和小鼠的細胞中的沉默活性鑒定有效的 靶向TGF-β的siRNA。B.通過在人細胞系中的沉默活性鑒定有效的靶向Cox_2的siRNA。 C.通過在人細胞系中的沉默活性鑒定有效的靶向Hoxbl3的siRNA。圖15.小鼠皮膚切割損傷模型。A.對照組和治療組在第0、5、7天的對比。B.在 C57小鼠背部中線兩側制造一對直徑為5mm的全層皮膚切割傷口，第5天的觀察結果。C.從 小鼠皮膚樣品中提取總RNA，用RT-PCR檢測靶標基因表達情況。圖16.用于體內siRNA導入的HK聚合物。左圖顯示，當HKP和siRNA在水溶液中 混合時，掃描電子顯微鏡觀察到形成的納米顆粒。使用了兩種HK聚合物運輸siRNA到皮膚 傷口。圖17.傷口愈合的動物皮膚模型。用小鼠皮膚切割傷口模型分析納米顆粒增強的 TGFi3-Ι-siRNA局部導入的治療效果。一共十只小鼠，每只背部兩個切口。對每個傷口的直 徑進行測量，并用相機拍照保存每個傷口圖片信息。圖18.納米顆粒-TGF β -1-siRNA導致靶基因沉默的治療效果。RT-PCR分析表明， TGF β -1特異性的siRNA或包含TGF β -1特異性siRNA的雞尾酒siRNA引起了 TGF^-I特 異性沉默。底端表示的是持家基因表達情況。圖19.用于傷口修復的納米顆粒TGFi3 -IsiRNA。四個實驗組中，第2組在第5天 傷口更小并且在第9天完全愈合。不使用HKP納米顆粒的活性TGF β -IsiRNA組(第3組) 顯示微弱的活性，而對照組siRNA及時結合HKP也沒有活性。圖20.HOxbl3siRNA在傷口愈合中具有類似的效果。使用納米顆粒包裹 Hoxbl3siRNA，在第4和第7天可觀察到一定的傷口愈合效果。用HKP包裹Hoxbl3siRNA有 更好更快的促進傷口愈合效果。圖21.運送TGF0-l、Hoxbl3和Cox_2siRNA的納米顆粒。小鼠皮膚傷口模型試驗 表明，用納米顆粒包裹TGF β -1、Hoxb 13和CoX-2siRNA能夠更好地促進傷口愈合。圖22.活體組織檢測野生型小鼠傷口的膠原結構。A.低倍鏡(10X或20X)下 觀察野生型小鼠傷口活體組織檢查；B.高倍鏡(100X)下觀察野生型小鼠傷口活體組織 檢查；C.低倍鏡(10X或20X)下觀察Hoxbl3K0型小鼠傷口活體組織檢查；D.高倍鏡 (100X)下觀察Hoxbl3K0型小鼠傷口活體組織檢查。第1排未受傷的正常組織；第2排第20天的傷口活體組織檢查；第3排第30天的傷口活體組織檢查；第4排第60天的傷 口活體組織檢查。紅色箭頭所指為印度墨水染色位置。圖23.納米顆粒/CoX-2siRNA治療后有類似正常皮膚的組織結構。在三種放大倍 數下對正常皮膚拍照，在治療組和正常真皮組織中可見毛細血管富集分布，而對照組則不 明顯。圖24. H2K4b具有潛在的抗真菌活性。幾個劑量(最高可超過100mg/ml)的H2K4b 或組蛋白(histatin)5加入到含白色念珠菌的YM(酵母麥芽糖)培養基中。室溫下旋轉培 養24小時，真菌被聚合物抑制的結果如圖2所示。實驗重復三次，數據記錄為平均值士標 準差的方式。*p < 0. 001，**P < 0. 01 ；H2K4b 與 Histatin 5 比較。圖25.分支型HKP顯示坑真菌活性。LDH-細胞毒性實驗檢測，將BHKP多肽(H3K4b、 H3 (G) K4b (PT73)和H2K4b)加入到正常人真皮成纖維細胞(NHDF)、牛主動脈內皮細胞 (BAEC)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)培養液中，通過LDH-細胞毒性試驗試劑盒測定細胞毒 性。實驗結果為三次實驗的平均值。發明的描述本發明涉及各種SiRNA分子，包含分子的組合物，以及它們的使用方法，這些均可 直接促進皮膚傷口愈合。本發明提供了一種由雙鏈寡聚核苷酸構成的小干擾RNA(SiRNA)分子，其中寡聚 核苷酸以序列互補的單鏈(ss) RNA分子為靶標。ss靶RNA分子可以是一種mRNA，后者至少 編碼多肽或蛋白的一部分，多肽或蛋白的活性是促進炎癥、傷口愈合或皮膚組織疤痕形成。 ss靶RNA分子也可以是一種microRNAOiiiRNA)，其功能是作為一種促進炎癥、傷口愈合或 皮膚組織疤痕形成的調控分子。在一項典型實施例中，靶標RNA分子編碼基因選自促炎通 路基因、促血管生成通路基因和促細胞增殖通路基因。在其他實施例中，siRNA序列應該能 靶向和抑制至少兩個物種的同一基因，例如人和小鼠，或者非人哺乳動物。各項實施例中， siRNA分子序列如表1-11列出所示。在一項具體實施例中，siRNA分子長度為19-27個堿基對。分子可以是兩端同為 平末端，同為粘性末端，或者一端為平末端一端為粘性末端。siRNA分子可以在單個核苷酸 水平進行修飾，或者對整個寡聚核苷酸骨架修飾，也可以不經修飾。分子置于藥學上可接受的載體內形成可給藥的組合物。在特定的實施例中，一個 siRNA分子與至少編碼一個蛋白質的mRNA結合。更進一步的，一個siRNA分子與至少編碼 一個人類蛋白的mRNA結合。在另一項額外實施例中，一個siRNA分子與人類mRNA分子結 合，也與同源的小鼠mRNA結合，即mRNA在各自的種內編碼同樣或類似的蛋白質。具體實施例中，組合物包括一種藥學上可接受的載體和至少三種siRNA分子，每 種siRNA分子與選自促炎通路基因、促血管生成通路基因和促細胞增殖通路基因的相應 mRNA分子結合。在另一項實施例中，每種siRNA雞尾酒包含至少三種siRNA，靶向至少三種 不同的基因序列。優先選擇每個基因來自不同的信號通路。一種組合物是siRNA分子的混 合物，可以作為一個“雞尾酒”。在一些實施例中，一個雞尾酒至少含有三種siRNA分子，雞尾酒 混合物選自表A、B、C、D中所列的序列。表A顯示的是一個特定的實施 M, ^ ft s iRNA( IE X Iil 5 ‘ -caaggauaucgaaggcuugcuggga-3 ‘ , Jx. Ijl
105 ‘ -ucccagcaagccuucgauauccuug-3 ‘ 子結合，一種s iRNA(正義鏈5 5 ‘ -ucagaccaggcaccagaccaaagac-3 ‘ 子結合，一種siRNA(正義鏈5 5 ‘ -uuguagauggaaaucaccuccgggg-3‘
)與編碼人和小鼠HoxB13蛋白的mRNA分 ‘-gucuuuggucuggugccuggucuga-3 ‘,反義鏈 )與編碼人和小鼠Cox-2蛋白的mRNA分 ‘ -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3 ‘ , Jx. Ijl )與編碼人和小鼠TGFii -2蛋白的mRNA分子結 合。表A更進一步的顯示，一種s iRNA分子(正義鏈5 ‘ -GGUGGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU -3' _，反義鏈5' -AACACAUCUGGCU⑶UCCAGCCACC-3‘)靴向編碼人和小鼠Hoxbl3蛋白的 mRNA 分子，至少一種 s iRNA 分子(正義鏈5' -G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAUGU-3‘， 反義鏈5 ‘ -ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC-3 ‘)靴向編碼人和小鼠Cox_2蛋白的mRNA 分子，至少一種 siRNA 分子(正義鏈5 ‘ -CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3 ‘，反義鏈 5 ‘ -AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG-3 ‘)靴向編碼人和小鼠 TGF β _2 蛋白的 mRNA 分子。在其他的如表C披露的特定實施例中，一種siRNA(正義鏈 5 ‘ -caaggauaucgaaggcuugcuggga-3 ‘ , Jx. Ijl 5 ‘ -ucccagcaagccuucgauauccuug-3 ‘) 與編碼人和小鼠HoxB13蛋白的mRNA分子結合，一種siRNA(正義鏈 5 ‘ -ggucuggugccuggucugaugaugu-3 ‘ , Jx. Ijl 5 ‘ -acaucaucagaccaggcaccagacc-3 ‘) 與編碼人和小鼠C0X-2蛋白的mRNA 分子結合，一種s iRNA (正義鏈 5 ‘ -cacgagcccaagggcuaccaugcca-3 ‘ , Jx. Ijl 5 ‘ -uggcaugguagcccuugggcucgug-3 ‘) 與編碼人和小鼠TGFi3 -1蛋白的mRNA分子結合，，一種siRNA(正義鏈 5 ‘ -ccggaggugauuuccaucuacaaca-3 ‘ ，Jx.Ijl 5 ‘ -uguuguagauggaaaucaccuccgg-3 ‘ ) % 編碼人和小鼠TGF β -2蛋白的mRNA分子結合。更進一步，mRNA分子編碼一個或多個HoxB 13通路基因，Cox_2通路基因，TGF_beta 通路基因，或者這些通路基因的組合。在其他額外實施例中，mRNA分子編碼一個或多個促 血管生成基因，促炎癥基因，或者它們的組合；更進一步的，mRNA分子編碼一個或多個促炎 癥基因或者它們的組合。有關雞尾酒的進一步實施例中，至少三種siRNA分子結合至少兩 種或更多的mRNA分子。在其他實施例中，siRNA分子混合物選自表E-H列出的混合物。在額外實施例中，siRNA雞尾酒至少抑制一個基因的表達，這個基因選自促炎通路 基因、促血管生成通路基因和促細胞增殖通路基因。在特定實施例中，siRNA雞尾酒抑制多 個基因的表達。在額外實施例中，siRNA雞尾酒包含表3、4和5中的序列，抑制人和小鼠細 胞中HoxB13、TGF-betal、TGF_beta2和C0X-2基因的表達。更進一步的，s iRNA雞尾酒包 含表6、7和9中的序列，抑制人和小鼠細胞中PDGFa、FGF-2和LaminBl蛋白的表達。在進一步的實施例中，siRNA雞尾酒包含至少三種siRNA，比例可以為1 1 1， 或者1 1.5 0.5，或者0.5 0. 5 2，也可以是依據每種siRNA的效力和應用時的治 療要求而確定的其他比例。本發明進一步提供了藥學上有效的載體，以增強siRNA雞尾酒導入疾病組織和細 胞的效率。在各種組合物的實施例中，載體由一個或多個成分組成，這些成分從由鹽溶液、糖 溶液、多聚物、脂質、乳劑、凝膠和膠束材料組成的庫中選擇。更多的組分或載體包括多聚 陽離子結合試劑，陽離子脂質，陽離子膠束，陽離子多肽，親水性接枝共聚物，非天然陽離子水性接枝聚甲醛，配體功能化的陽離子聚合物，配體功能化的親 水性接枝共聚物，生物可降解聚酯纖維，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸乙醇酸 (PGLA)和聚乙二胺樹枝狀聚合物(PAMAMDendrimer)。組合物的進一步實施例中，載體是組 氨酸_賴氨酸聚合物，可形成包含siRNA分子的納米顆粒，顆粒直徑為100-400nm。可通過以下步驟鑒別有效的siRNA分子1)建立一個靶向互補的ss靶標RNA分 子序列的siRNA集合，所說的靶向性siRNA分子由各種序列組成；2)體外選擇對靶分子最 有效的siRNA分子；3)在動物傷口模型中評估選定的siRNA分子；4)選擇模型中最有效 的siRNA分子。一種藥學上可接受的載體在第(2)步加入到每一種siRNA中，成為藥學組 合物，并用動物傷口模型評估每一種siRNA。動物傷口模型優先地選擇Hoxbl3敲除小鼠的 唇裂模型或背部皮膚切割傷口模型。更優先選擇同時用兩種動物模型中評估siRNA分子。 由于靶基因表達于疾病組織的不同細胞類型，特定siRNA雞尾酒的效力不但用細胞檢測確 認，也在動物疾病模型中檢測和確認。優先選定那些治療效果比單一 siRNA組分好的siRNA 雞尾酒。為了使siRNA雞尾酒獲得最佳協同效應，本發明也提供了制備每種組合物的最佳 比例的方法。本發明也將治療真皮或表皮傷口作為一個研究主題。傷口可以是由物理損傷、燒 傷、過敏、糖尿病、炎癥或腫瘤引起。傷口的基本特征是應該至少有部分炎癥或新生血管。方 法包括給藥方面的內容，即組合物至少由發明中的一種siRNA分子和一種藥學上可接受的 載體組成，分子至少抑制一個基因的表達，這個基因可促進傷口修復的病理學和非預期的 進程。組合物可用于軟膏、噴劑、透皮貼劑，或者其他臨床常用的劑型。siRNA治療的成功不僅依賴于靶標的鑒定和活性siRNA分子的序列，更重要的 是依賴于體內導入靶組織和進入細胞質的效率(41-43)。皮膚傷口愈合治療的siRNA雞 尾酒劑型應該是利用合適的臨床驗證過的載體進行局部給藥。除了使用咪喹莫特乳膏 (5% )作為siRNA雞尾酒藥物局部給藥的載體，我們還使用其他三種聚合物為基礎的載 體，包括組氨酸_賴氨酸聚合物(HKP) (44)、聚乙二醇化的PEI (45)和PAMAM樹枝狀聚合物 (Dendrimer)(46)。siRNA雞尾酒抑制一個促血管生成基因、一個促炎癥基因或一個促疤痕形成基因 的表達，或者同時抑制這些基因。在關于本方法進一步的實施例中，使用的siRNA列于表 1-11。在本方法的額外實施例中，方法中的雞尾酒是表A-I中的siRNA的混合物。
具體實施例實施例1.用于傷口愈合分析的唇裂模型前期的預研究表明Hoxbl3K0小鼠模型背部皮膚傷口愈合后疤痕較小。背部和唇 皮膚的差異使我們提出疑問，即KO小鼠唇部傷口愈合后形成的疤痕是否會更小，因為唇表 皮組織的肌肉和脂肪層比上背部皮膚更松散無序。我們首先比較了背部和唇的結構，唇部 區域不像背部皮膚結構，其肌肉和脂肪層并沒有形成獨特的層狀結構(圖1)。目前還不 清楚是否唇部傷口結構改變會影響傷口修復過程。為探討是否可以用小鼠唇裂模型研究 傷口愈合過程，我們建立了小鼠唇手術割裂模型來模擬兔唇裂顎。在一般的麻醉和無菌 條件下，在HOXB13K0和野生型小鼠(8-16周齡)皮膚和前排牙齒處制造單個的0. 5cm的
12全層皮膚切割傷口，接著用6. 0的尼龍縫合傷口，以此模擬兔唇裂顎。手術由我們的合作 研究者Eric J Stelnicki醫生設計和執行，他是一名專業的唇裂外科醫生。用10%的無 菌印度墨水處理傷口以便跟蹤，手術后的每只動物單獨喂養。在特定的時間點對唇傷口 活組織檢測收集樣品進行組織化學、免疫組化和基因表達分析。從野生型小鼠唇皮膚組 織中分離總RNA樣品，用RT-PCR分析確認Hoxbl3的表達。用Bio-Rad的iScript cDNA 合成試劑盒進行逆轉錄，PCR的上下游引物分別為5 ‘ -CTCCAGCTCCTGTGCCTTAT-3 ‘和 5' -ACTGGCCATAGGCTGGTATG-3‘，測序檢測確認 Hoxbl3 的產物(SeqWright 公司)。實施例2. HoxB13K0小鼠顯示快諫的傷口愈合和較少的疤痕形成建立唇損傷模型后，Hoxbl3 KO小鼠(由Dr. Mario R. Capecchi饋贈)接著進行同 樣的手術。KO型小鼠與野生型(WT) X57BL6型小鼠進行回交繁殖至少10代，以確保WT和 KO型小鼠具有相同的遺傳背景。在損傷后的第20、30和60天對唇傷口進行活組織檢測， 馬森三色染色(Masson Trichrome染色)分析膠原結構(圖2)。第20天(B_Day20)和第 30天(B-Day 30)，WT小鼠比Hoxbl3K0小鼠膠原染色更密集，傷口收縮更明顯。事實上，第 20天和第30天時，由于野生型小鼠膠原收縮過于強烈，致使我們無法同時看清楚收縮的膠 原和周圍的組織結構。到第60天，野生型小鼠膠原依然致密，但是已經不如第20和30天 時那么明顯了。相反，傷口組織活檢表明Hoxbl3 KO小鼠在第20、30和60天時膠原結構均 較松散，意味著KO小鼠唇部疤痕形成減少，這與我們在上背部觀察到的結果一致。t施徹丨3. HoxB 13高祁佘小鼠的成纖維細胞曾葙率和i千移活件降低,接著我們在體外比較了 WT和KO小鼠原代成纖維細胞的活性。用新生3天的小鼠 制備真皮原代成纖維細胞，用頸脫位法處死小鼠并用70%的乙醇消毒，收集皮膚組織，在含 20 μ g/ml慶大霉素的PBS中浸泡45分鐘，接著懸浮于25U/ml分散酶溶液(Sigma)中4°C 放置過夜。用尖的鉗狀骨針分離表皮層和真皮層，將表皮層進一步處理分離出角化細胞。 真皮層繼續用100U/ml的膠原酶37°C下處理一小時。用細胞濾網過濾后，用組織培養皿收 集細胞，加入含10% FBS的高糖DMEM培養基，實驗測定之前傳代兩次。增殖實驗中細胞在 96孔板的接種密度為5000/孔，每天進行MTT分析(Molecular Probes, CA)表明HoxB 13 敲除小鼠成纖維細胞增殖活性下降。用血球記數板手動計數證實了這一結果(數據未顯 示)。已有研究報道HoxB13是一種激活凋亡通路的神經細胞增殖抑制劑(Economides等， 2003)。因此，HoxB13K0的成纖維細胞增殖率應該上升，這與我們觀察到的結果一致。很有 可能HoxB13的功能與細胞類型有關。事實上，HoxB13的過量表達與前列腺癌有關，因而 HoxB13被推測是前列腺癌的一種生物標志物(Edwards等，2005)。此外，我們還開展了體外 的刮傷實驗來模擬切割傷口，在6孔板的每個孔內接種2 X IO5個原代真皮成纖維細胞，板 內已經預包被了 I膠原、IV膠原和纖粘連蛋白。接著將細胞孵育在含0.2%的FBS的DMEM 高糖培養中24小時，用PipetMan 吸頭刮單層細胞創建一個缺口。經過4和24小時的 DMEM/0. 2% FBS后，用Olympus的Microsuite軟件測定缺口的愈合情況。加入血小板衍生 生長因子B(10ng/ml)并監測其對WT和KO成纖維細胞遷移的影響。如圖3所示，損傷后4 小時在沒有PDGF的條件下，HoxB13K0型成纖維細胞在預包被I膠原、IV膠原和纖粘連蛋白 表面的遷移率比WT型成纖維細胞更緩慢。此外，HoxB13K0型成纖維細胞會對PDGF的刺激 做出反應。損傷后的24小時，遷移活性差異并不明顯。實施例4. HoxB13的過量表達抑制增殖并促進終端分化
當小鼠表皮角化細胞(REK)培養在氣體_液體界面(Tammi等，2000)時，REK細 胞將分化成表皮的各層細胞。用這個作為體外角化細胞分化模型，我們研究了 HoxB13對 于REK分層的影響。通過逆轉錄病毒轉導和克隆選擇獲得表達HoxB13的REK細胞克隆。 HoxB13的cDNA亞克隆到MLV載體上，并置于CMV啟動子的調控之下，通過三個質粒的共轉 染得到逆轉錄病毒顆粒(Li等，2001)。含HoxB13或僅含空載體的逆轉錄病毒顆粒轉導REK 細胞，感染復數(MOI)約為10，在2μ g/ml的嘌呤霉素(puromycin)條件下篩選(注1 μ g/ ml的嘌呤霉素足以殺死非轉導細胞)。具有嘌呤霉素抗性的細胞以每孔一個的密度接種到 3塊96孔板內，孵育兩周后，觀察每孔細胞，將單克隆轉移擴增，并用1 μ g/ml的嘌呤霉素持 續培養。RT-PCR分析時，設計的引物一條位于載體，一條位于HoxB13的cDNA上，RT-PCR確 認HoxB13或載體的表達情況。MTT分析表明，與只轉導空載體的REK細胞相比，表達HoxB13 的REK細胞增殖速度減緩(圖4)。當將這些REK細胞置于氣體-液體界面時，REK細胞中 過量表達HoxB13會導致過度終端分化(圖5)。用兩株其他的REK-HoxB13克隆獲得了類似 結果。由此可見，HoxB13過量表達影響角化細胞的增殖和層化。實施例5. HoxB 13是細胞核蛋白為了確定HoxB13的細胞內定位，我們去掉綠色熒光蛋白(GFP)的終止密碼子和 HoxB 13的起始密碼子，構建一個GFP-HoxB13融合蛋白，其表達受CMV啟動子驅動。使用 Lipofectamine (Invotrogen, CA)將含 GFP-HoxB 13cDNA 的質粒轉染到 REK 或 293T 人腎表 皮細胞，轉染后24小時熒光顯微鏡監測GFP的表達情況。與之前報道胚胎皮膚發育過程中 HoxB13表達于細胞質(Komuves等，2003)內不同，我們發現GFP_HoxB13定位在細胞核內， 說明HoxB13是一個核蛋白(圖6)。HoxB13蛋白定位于核內使得小分子抑制劑或單克隆抗 體抑制劑很難起作用，因此，用siRNA抑制劑通過降解細胞質內的mRNA來抑制蛋白表達是 較為合理的一種治療手段。實施例6.鑒別組成多靶標siRNA雞尾酒的活性siRNA雙鏈的siRNA靶向VEGF通路的因子包括mVEGF-A (XM_192823)、 mVEGFR-1 (D88689)和mVEGGFR-2 (MN_010612)，每個基因選擇兩個靶標序列。這些序 列是(5，到 3’)mVEGF-A(l.AAGCCGUCCUGUGUGCCGCUG ;2. AACGAUGAAGCCCUGGAGUGC)； mVEGFR-1(1. AAGUUAAAAGUGCCUGAACUG ；2.AAGCAGGCCAGACUCUCUUUC) ；mVEGFR-2(1. AAGCUCAGCACACAGAAAGAC ；2. AAUGCGGCGGUG ⑶ GACAGUA)。從螢火蟲熒光酶素基因(Luc， AF434924)選擇兩禾中 siRNA 序列作為非相關對照:Luc (1. AAGCUAUGAAACGAUAUGGGC ； 2. AACCGCUGGAGAGCAACUGCA)。通過BLAST分析這些siRNA和相應靶標序列的特異性，而 mVEGF-A設計成可同時靶向各種mVEGF-A異構體。所有的siRNA按常規的21nt雙鏈RNA寡 聚核苷酸設計，由Qiagen合成，siRNA的中間為19個配對的堿基對，每條RNA單鏈的3’末 端有dTdT的突出結構。為了獲得更好的RNAi效果，我們照例對每個mRNA分子使用了兩種 21nt的雙鏈RNA靶向同一 mRNA的不同序列。體外RT-PCR檢測mRNA被siRNA敲低的效果。 使用RNAwiz試劑盒(Ambion，#9736)根據操作數明書純化細胞質RNA，并用DNase處理，用 特定的引物進行RT-PCR分析。用于逆轉錄反應的mRNA特異性反向引物均為47個堿基對的 寡聚核苷酸，5'端有30個堿基的通用序列(稱為“TS1”序列，用大寫表示)，連接著一個17 個堿基的mRNA分子特異性的序列(小寫字母表示)。這些引物分別是(從5'到3'端) DmVEGFA Dn :GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg ；2) :mVEGFRlDn :GAA
14CATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAtagattgaagattccgc ；3) mVEGFR2Dn GAACATCGATGACAAGCTT AGGTATCGATaggtcactgacagaggcg0逆轉錄(RT)之后，用同一個反向(下游)引物TSl進行 PCR檢測，其序列為GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA。然而每個基因的30個堿基長度的 上游引物序列卻不相同1)VEGFA Up :GATGTCTACCAGCGAAGCTACTGCCGTCCG ； 2)mVEGFRl Up: GTCAGCTGCTGGGACACCGCGGTCTTGCCT ； 3)mVEGFR2 Up GGCGCTGCTAGCTGTCGCTCTGTGGTTCTG 持家基因GAPDH進行RT-PCR作為RS-PCR (ribo spacer PCR)中mRNA定量的對照。脫 氧胸腺嘧啶(dT)寡聚核苷酸(19nt)用于GAPDH的逆轉錄實驗。隨后用于PCR的引 物為 20 堿基長度的寡聚核苷酸1)GAPDH Up CCTGGTCACCAGGGCTGCTT ； 2) GAPDH Dn CCAGCCTTCTCCATGGTGGT。根據之前描述的操作說明進行RT-PCR。用于檢測mVEGF-A表達的 引物為 5，-GCGGGCTGCCTCGCAGTC-3，(正義 / 上游)和 5，-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3，(反義 /下游)。圖7顯示所有的三種s iRNA均能有效敲低相應基因。為了評估包含三種siRNA 的雞尾酒的效力，我們用眼部血管增生小鼠模型檢測賴氨酸-組氨酸聚合納米顆粒介導的 體內導入效果。實施例7.局部導入siRNA雞尾酒抑制腫瘤血管增牛在前期預研究中，包含CpG的寡聚核苷酸經水溶性藥丸包裹后植入角膜層間，能 誘導VEGF-介導的血管增生。這一系統用于檢測局部導入siRNA制劑的抑制效果，該siRNA 制劑靶向VEGF及其受體(VEGFR1和VEGFR2)。所有實驗中，使用的單一劑量為10 μ g的 siNRA與一定量的HKP納米顆粒，在CpG ODN藥丸植入后24小時結膜下注射給藥。檢測單 個siRNA，也對三者1 1 1的混合物(siVEGFA、siVEGFRl和siVEGFR2)進行檢測。藥丸 植入后第4天和第7天監測角膜緣新血管生成的情況。如圖8所示，藥丸植入后第4天，與 對照組SiLacZ相比，所有三種siRNA均顯著抑制了角膜血管增生(P < 0. 05)。三種siRNA 聯合起來更有效，抑制超過60%的血管增生(P < 0. 01)。用組氨酸-賴氨酸聚合物納米顆 粒通過結膜下給藥完成siRNA局部導入。使用這一眼部血管增生模型證實了多靶標siRNA 雞尾酒的協同效應。這些數據有力支持了我們在此提出的用多靶標siRNA雞尾酒來促進成 人皮膚傷口愈合的觀點，愈合后疤痕更少且抗張強度更高。實施例8.同時靶向人和小鼠基因的25nt的siRNA制備25nt的siRNA，其序列同時針對人和小鼠直系同源基因序列。例如，設計的針 對HoxB13的序列能同時靶向人HoxB13和小鼠HoxB13基因。表1提供了鑒別出來的用于 siRNA治療的序列(36-37)，每個序列靶向人和小鼠相應的基因。因此，從小鼠細胞中確定 的有效序列經確證后也能用于人細胞。如果兩種細胞內的檢測均證明s iRNA有效，則小鼠 動物模型中獲得的沉默活性理論上也能在人體內有相似的效果。用這一方法，可以解決如 單克隆抗體類抑制劑藥物的種屬特異性問題。此外，作為siRNA治療候選藥物，從小鼠模型 研究中獲取的效率和毒性數據能夠非常容易地擴展應用到人體。實施例9. HK疑合物增強siRNA的局部導入HKP-siRNA納米顆粒介導的局部導入取得了顯著的抗血管增生活性。在另一項用 HKP提高siRNA導入腫瘤內的獨立實驗中，靶標基因表達明顯下降，腫瘤生長曲線顯示了顯 著的抗腫瘤活性。哺乳動物脂肪墊內注射MDA-MB-435細胞10天后，將產生可見腫瘤的小 鼠分成多個實驗組，每組包含四只小鼠八個腫瘤，測量腫瘤的長寬并計算大小。將4μ g的 siRNA通過瘤內注射到每個腫瘤內，每5天注射一次。將腫瘤小鼠分成未治療組、β-半乳糖苷酶siRNA和Raf-IsiRNA三個組，以研究獲取Raf-IsiRNA與最適聚合物載體的抗腫瘤 活性的更多細節。如圖9所示，用HKP將Raf-IsiRNA導入腫瘤內后可抑制腫瘤生長，HKP已 經被確證為局部導入siRNA的高效載體。這使我們得出結論，在劑型合適的情況下，HKP可 以幫助siRNA進入皮膚傷口。過去幾十年，生物降解性聚酯纖維，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸乙醇 酸(PGLA)和聚乙二胺(PAMAM)樹枝狀聚合物已經廣泛應用到制藥學和生物醫學上。生物 降解性聚酯纖維被認為是少數幾個同時具備可控降解、很好的生物相容性和高度安全性等 特點的合成材料之一。不同的藥物和給藥途徑需要不同的劑型，因而各種類型的由生物降 解性聚酯纖維和聚乙二醇(PEG)組成的區段共聚物被開發出來。PAMAM dendrimer代表一類新型的名為“致密星形(dense star)”的巨噬細胞結 構狀的聚合物。不像一些經典的聚合物，dendrimer分子高度均一，分子量分布很窄，大小 和形狀明確，末端表面高度功能化。制備過程從一個核心啟動核開始，并經過一系列的重復 步驟，隨后每一個生長步驟代表“新一代”聚合物，新聚合物具有更大的分子直徑，活性表面 位點數量翻番，分子量也將近增加一倍。聚乙二胺(PAMAM) dendrimer是dendrimer中最常 用的一種，適用于許多材料科學和生物技術領域。PAMAM dendrimer由聚二胺核心和叔胺分 支構成。實施例10. siRNA雞尾酒降低,培養細胞,中靶某因的表汰制備體外靴向人和小鼠HoxB13、TGF-β和Cox_2mRNA的siRNA。1.準備siRNA 對三個mRNA中的每一個均準備三種25nt的平末端序列hmHX-25-l 正義鏈 5，~r (GGUGGCUGGAACAGCCAGAU⑶⑶U) -3，反義鏈5，-r (AACACAUCUGGCU⑶UCCAGCCACC) -3，hmHX-25-2 正義鏈 5，~r (GCUGGAACAGCCAGAUGUGUUGCCA) -3，反義鏈5，-r (UGGCAACACAUCUGGCU⑶UCCAGC) -3，hmHX-25-3 正義鏈 5，~r (CGCCAGAUUACCAUCUG⑶UUCAGA) -3，反義鏈5，-r (UCUGAAACCAGAUGGUAAUCUGGCG) -3，hmTF-25-l 正義鏈 5，~r (GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA) -3，反義鏈5，-r (UGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCC) -3，hmTF-25-2 正義鏈 5，~r (CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU) -3，反義鏈5，-r (AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG) -3，hmTF-25-3 正義鏈 5，~r (GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU) -3，反義鏈5，-r (AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC) -3，hmCX-25-l 正義鏈 5，~r (G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAUGU) -3，反義鏈5，-r (ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC) -3，hmCX-25-2 正義鏈 5，~r (GAGCACCAUUCUCCUUGAAAGGACU) -3，反義鏈5，-r (AGUCCUUUCAAGGAGAAUGGUGCUC) -3，hmCX-25-3 正義鏈 5，~r (CCUCAAUUCA⑶CUCUCAUCUGCAA) -3，反義鏈5，-r (UUGCAGAUGAGAGACUGAAUUGAGG) -3，2.設置一個對照序列 Lu25-a 正義鏈 5，~r (GAGGAGCCUUCAGGAUUACAAGAUU) -3，
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反義鏈5，-r (AAUCUUGUAAUCCUGAAGGCUCCUC) -3，3.合成制備六對引物，用于PCR檢測人和小鼠HoxB13、TGF-i3和Cox_2三個基因 的cDNA序列hHxup5'-GCCTCTCGGAGCGCCAGATT-3’
hHxdn5'-CTAGTACTGGTTATCGTGAT-3’
mHxup5'-CTCCAGCTCCTGTGCCTTAT-3’
mHxdn5'-ACTGGCCATAGGCTGGTATG-3’
hCxup5'-CGGGCTGGGCCATGGGGTGGA-3'
hCxdn5'-CCTATCAGTATTAGCCTGCTT-3'
mCxup5'-GGAAGCCTTCTCCAACCTCT-3’
mCxdn5'-GGATACACCTCTCCACCAAT-3’
hTGb2up5’ -GAGTACTACGCCAAGGAGGTT--3
hTGb2dn5’ -CCATTCATGAACAGCATCAGT--3
mTGb2up5’ -CTACTGTGTGCTGAGCACCTT--3
mTGb2dn5，-CGCTGCTCGGCCACTCTGGCT--34.用人前列腺癌PC3細胞系檢測基因表達敲低情況，將第2步中的SiRNA進行一 系列的標準轉染試驗，根據試劑供應商(Irwitrogen)的操作說明進行轉染。5.提取總RNA，用第3步中的PCR ·引物進行RT-PCR分析，結果如圖10、11、12、13 所示。從圖中可以看出，siRNA轉染后，RT-PCR檢測到的相應基因表達顯著下降，而各種對 照(非靶向)siRNA對表達沒有影響。實施例IL體外沉默TGF-β、Cox~2和HoxB13的有效siRNA表1提供了針對HoxB13、TGF-β和Cox-2中任一基因的10種siRNA序列。每個靶基因選擇四個siRNA選擇的對照siRNA靶向的是與人和小鼠均沒有同源性的非相關序列，名 為 Lu25-a (正義鏈5 ‘ -GAGGAGCCUUCAGGAUUACAAGAUU-3 ‘；反義鏈，5 ‘ -AAUCUU GUAAUCCUGAAGGCUCCUC-3 ‘)。革巴向人禾Π 小鼠 HoxB 13 基因的 siRNA 序列為hmHX_l (正義鏈，5 ‘ -GGUGGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU-3 ‘；反義鏈，5 ‘ -AACACAUCUGGCUG UUCCAGCCACC-3 ‘ ) ;hmHX_2 (正義鏈，5 ‘ -GCUGGAACAGCCAGAUGUGUUGCCA-3 ‘； 反義鏈，5 ‘ -UGGCAACACAUCUGGCUGUUCCAGC-3 ‘ ) ;hmHX_3 (正義鏈， 5 ‘ -CGCCAGAUUACCAUCUG⑶UUCAGA-3 ‘；反義鏈，5 ‘ -UCUGAAACCAGAUGGUAAUCUGG CG-3 ‘)；和 hmHX-4 :(正義鏈，5 ‘ -CAAGGAUAUCGAAGGCUUGCUGGGA-3 ‘；反義鏈， 5 ‘ -UCCCAGCAAGCCUUCGAUAUCCUUG-3 ‘)。靴向人和小鼠 C0X-2 基因的 s iRNA 序列 為hmCX-l (正義鏈，5 ‘ -G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAUGU-3 ‘；反義鏈，5 ‘ -ACAUCAUC AGACCAGGCACCAGACC-3 ‘ ) ； hmCX-2 :(正義鏈，5 ‘ -GAGCACCAUUCUCCUUGAAAGGACU-3 ‘； 反義鏈，5 ‘ -AGUCCUUUCAAGGAGAAUGGUGCUC-3 ‘ ) ;hmCX_3 (正義鏈， 5' -CCUCAAUUCA⑶CUCUCAUCUGCAA-3 ‘；反義鏈，5' -UUGCAGAUGAGAGACUGAAUUGAGG-3 ‘) 和 hmCX-4 (正義鏈，5 ‘ -GUCUUUG⑶CUGGUGCCUG⑶CUGA-3 ‘；反義鏈，5 ‘ -UCAGACCAG GCACCAGACCAAAGAC-3 ‘)。靶向人和小鼠TGF- β基因的siRNA序列為hmTF_l (正義 鏈，5 ‘ -GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA-3 ‘；反義鏈，5 ‘ -UGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCC-3' ) ； hmTF-2 (正義鏈，5 ‘ -CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3 ‘；反義鏈，5 ‘ -AGAAGUU GGCAUGGUAGCCCUUGGG-3 ‘ ) ；hmTF-3 (正義鏈，5 ‘ -GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU-3 ‘； 反義鏈，5 ‘ -AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC-3 ‘)禾口 hmTF_4 (正義鏈， 5' -CCCCGGAG⑶GAUUUCCAUCUACAA-3‘；反義鏈，5' -UUGUAGAUGGAAAUCACCUCCGGGG-3‘)。將siRNA轉染進入特定的細胞培養物為從mRNA和蛋白水平檢測選定的siRNA對于HoxB13基因敲低的效果，用 LipofectAmine 2000將四種siRNA轉入表達HoxB13的REK細胞內。類似的，為檢測選定 的siRNA對于Cox-2基因敲低后的mRNA和蛋白水平，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培 養基將從美國標準生物品收藏中心(ATCC)購買的人包皮成纖維細胞(HFF)培養在IOcm板 內，并添加100 μ g/ml的鏈霉素和100U/ml的青霉素，接著用LipofectAmine 2000將siRNA 轉染細胞。細胞經PBS洗滌兩次后用無FBS的培養基孵育24小時，然后用10% FBS的培養 基替換無血清培養基，促進細胞分裂。為檢測選定的siRNA對于TGF-β基因敲低后的mRNA 和蛋白水平，將SiRNA-LipofectAmine 2000轉入小鼠胚胎上皮細胞(MEEC)后進行RT-PCR 分析。潛在的缺陷是用LipofectAmine 2000轉染這些細胞不一定一直有效，因而也必 須考慮如電轉或其他轉染試劑作為替代方法。為獲得滿意的結果，必須進行有效的轉染和 RT-PCR 分析。RT-PCR 檢測 mRNA 水平從轉染了 siRNA的HoxB13 (小鼠)表達型REK細胞、Cox-2 (人)表達型細 胞和小鼠胚胎上皮細胞中分離純化總RNA進行RT-PCR分析。逆轉錄(RT)后用如下 引物PCR檢測HoxB 13 (小鼠)擴增子上游引物5 ‘ -CTCCAGCTCCTGTGCCTTAT-3 ‘ 和下游引物5 ‘ -ACTGGCCATAGGCTGGTATG-3 '。逆轉錄(RT)后用如下引物PCR 檢測Cox-2 (人)擴增子上游引物5 ‘ -CGGGCTGGGCCATGGGGTGGA-3 ‘ 和下游 弓丨物5 ‘ -CCTATCAGTATTAGCCTGCTT-3 ‘。逆轉錄(RT)后用如下弓丨物PCR檢測 TGF-β (小鼠)擴增子上游引物5 ‘ -CTACTGTGTGCTGAGCACCTT-3 ‘ 和下游弓丨物 5' -CGCTGCTCGGCCACTCTGGCT-3‘。PCR擴增產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色， PCR擴增結果應該反映了特定siRNA對特定mRNA敲低的效果。這些實驗確定了每個siRNA 的效率，為選擇最有效siRNA提供了初步的信息。為了獲得足夠數量的總RNA進行PCR檢 測，RT-PCR檢測應與轉染試驗緊密配合，并對特定細胞系的最佳轉染條件進行優化。此外， 選擇最有效的siRNA的實驗應該重復三次，保證準確無誤。實施例12.體內選擇最有效的siRNA雞尾酒通過細胞培養的體外研究選定分別針對HoxB13、Cox-2和TGF-β基因的最有效 siRNA后，將三者以如1 1 1、2 1 1或3 1 1等不同比例混合成雞尾酒。由于 HoxB 13在皮膚傷口愈合中的重要作用，可以適當增加ΗοχΒ13在雞尾酒中的比例。評估多靶標siRNA雞尾酒的小鼠模型為了評價最適的siRNA雞尾酒和最佳的劑型，我們利用ΗοχΒ13敲除(KO)成年小 鼠為模式動物。研究發現，與相應野生型(WT)相比，ΗΟΧΒ13Κ0傷口具有幾個類似早期妊娠 胚胎傷口的特征愈合更快速、抗張強度更高和真皮傷疤更小。生化分析揭示，與WT的皮 膚相比，ΗοχΒ13Κ0非傷口皮膚的表皮和真皮中的HA都明顯升高。基于以上結果，我們認為 ΗοχΒ13在成人皮膚中起促進分化的作用，缺少ΗοχΒ13能營造類似胚胎的環境，這種胚胎樣
18微環境有利于傷口愈合。除了被廣泛接受的HoxB13K0小鼠背部皮膚傷口模型，我們還在常 規麻醉和無菌條件下建立了一個小鼠唇裂模型，以模擬兔唇裂顎。在HoxB13 KO和野生型 小鼠(8-16周齡)皮膚和前排牙齒處制造單個的0. 5cm的全層皮膚切割傷口，接著用6.0 的尼龍縫合傷口，以此模擬兔唇裂顎。用于運送多靶標SiRNA雞尾酒的載體劑型我們首先測試了組氨酸_賴氨酸分支聚合物用作藥物給藥劑型的可行性，以便建 立聚合物-siRNA納米顆粒系統。在馬里蘭大學生物聚合物核心工廠的Ranin Voyager合成 器上(PTI，Tucson, AZ)合成聚合物，分支型HK聚合物有利于siRNA的移動，與siRNA混合 后可用于局部給藥。聚合物經HPLC純化(Beckman，Fullerton，CA)。本研究使用的第二分 支 H (組氨酸)K (賴氨酸)聚合物應為 R-KR-KR-KR，其中 R = [HHHKHHHKHHHKHHH] 2KH4NH4]。 H3K4b是具有同上述的聚合物相似核心和結構的多聚物，只是R的結構變為R = KHHHKHHHKHHHKHHHK。HKP水溶液可與siRNA水溶液以4 1的質量比進行混合，形成平均 直徑為150-200nm的微粒。混合后的HKP-siRNA水溶液為半透明的，沒有明顯的沉淀聚集 現象，并且可以在4°C的條件下儲存至少三個月。除了 HK聚合物，我們還測試了兩個不同的 聚合物載體一聚乙二醇化PEI和PAMAM dendrimer—導入siRNA雞尾酒到皮膚傷口周圍 區域的能力。所有的這些siRNA聚合物劑型溶于無RNA酶(RNase free)的D5W溶液中。皮膚傷口中的多靶標siRNA雞尾酒給藥用兩種不同的皮膚傷口模型評估各種劑型，包括三種siRNA以不同的三種比例組 成的固定劑型。靴向HoxB13、Cox-2和TGF-β的siRNA比例為1 1 1、2 1 1和 3:1: 1，混合后的siRNA再與H3K4b聚合物配比。研究分成以下幾個組Gl 每個唇裂傷 口用 20 μ g 對照 siRNA-HK 聚合物(50 μ 1) ；G2 每個唇裂傷口用 20 μ g 的 HoxB13 siRNA-HK 聚合物(50 μ 1) ；G3 每個唇裂傷口用20 μ g的C0X-2siRNA-HK聚合物(50 μ 1) ；G4 每個唇 裂傷口用20 μ g的TGF- β siRNA-HK聚合物(50 μ 1) ；G5 每個唇裂傷口用20 μ g的第一種 比例的雞尾酒siRNA-HK聚合物(50 μ 1) ；G6 每個唇裂傷口用20 μ g的第二種比例的雞尾 酒siRNA-HK聚合物(50 μ 1) ；G7 每個唇裂傷口用20 μ g的第三種比例的雞尾酒siRNA-HK 聚合物(50μ1)。每組使用四只動物，ΗοχΒ13Κ0和WT小鼠用同樣的給藥方式。這項研究結 果證實了雞尾酒siRNA比單一 siRNA效果更好，具有協同效應。不同載體劑型對傷口愈合的影響在小鼠唇裂模型中，用單一的如1 1 1比例siRNA雞尾酒測試三種不同載體 劑型。實驗組包括G1 20 μ g對照siRNA-HK聚合物(50 μ 1) ；G2 20 μ g對照siRNA-PEG PEI (50 μ 1) ；G3 20 μ g 對照 siRNA-PAMAM 樹枝狀聚合物(50 μ 1) ；G4 20 μ g 雞尾酒 siRNA-HK 聚合物(50 μ 1) ；G2 20 μ g 雞尾酒 siRNA-PEG PEI (50 μ 1) ；G3 20 μ g 雞尾酒 siRNA-PAMAM樹枝狀聚合物(50 μ 1)。每組使用四只動物，隨后分析體內mRNA和蛋白質的 水平。這一結果為多靶標siRNA雞尾酒臨床可行性方案提供了最佳載體劑型。體內靶基因的mRNA和蛋白水平的敲低從HoxB13K0和WT小鼠的背部皮膚傷口或唇裂傷口中割取皮膚樣品，浸泡在 含10% FBS和抗生素/抗真菌素的高糖DMEM培養基內，表面用70%的乙醇消毒，切割 成5mm2的切片，在DMEM中用分散酶(5mg/ml)4°C消化過夜。從組織細胞中抽提總RNA，用 RETROscript試劑盒(Ambion)根據操作說明進行逆轉錄。抗體染色過程中，多聚甲醛固定的成年WT和HoxB13K0小鼠皮膚樣品經加工后石蠟包埋并切片(6ym)，55°C烘烤過夜。體 內免疫組化檢測Cox-2和TGF-β也可以用相似的RNA純化和樣品制備程序。判斷最有效 的siRNA雞尾酒劑型應該考慮到皮膚傷口模型、HoxB 13的基因型以及每一種siRNA的比例。 分析mRNA也使用相同的原則，因為mRNA的敲低水平也是反映多靶標siRNA雞尾酒效力的 關鍵指標。多把標siRNA雞尾酒的潛在治療效力為了對siRNA雞尾酒的治療優勢進行初步評估，我們將開展兩項分析組織學分 析和HA分析。多聚甲醛固定的標本經加工后石蠟包埋并切片(6 μ m)，玻片55°C烘烤過夜 后根據標準操作流程用蘇木素-伊紅(HE)染色或用Masson' s trichrome染色膠原蛋 白。檢測HA時，皮膚切片用2%的FBS封閉，在生物素標記的HA結合蛋白(bHABP，1 μ g/ ml，溶于 PBS ；Associates of Cape Cod, Inc.，Falmouth, MA)內 4°C孵育過夜，PBS 漂洗， Cy-3-streptavidin (1 ； 500 ；Jackson ImmunoresearchLaboratories) liilmT"IP W 30 yJf 鐘，PBS漂洗，最后用前述的方法計數。陰性對照只用PBS孵育。使用Leica DMLB顯微鏡 觀察免疫熒光，并用Optronics公司的DEI-750D Digital System拍照成像。組織學分析 提供了治療和未治療皮膚傷口形態學差異方面的圖像信息，也反映了 HA蛋白的表達濃度。實施例13.津立多靶標siRNA雞尾酒的臨床可行件方案選擇了最佳的載體劑型后，根據載體劑型來確定雞尾酒中siRNA的最適比例，最 適比例也與特定的小鼠模型有關。隨后用唇裂模型檢測siRNA和雞尾酒。多靶標siRNA雞尾酒劑型的劑量依賴曲線為確定治療候選的s iRNA雞尾酒劑型的合適劑量，用小鼠唇裂模型檢測6個不 同劑量，檢測組分別為Gl 每個傷口每個傷口每個傷 口 20μ g/50y L ；G4 每個傷 口 30μ g/50y L ；G5 每個傷 口 40μ g/50y L ；G6 每個傷 口 60 μ g/50 μ L。每組包含四只動物，除了進行組織學和形態學評估外，也進行分子生物學和 生化分析。組織學和HA分析多聚甲醛固定的標本經加工后石蠟包埋并切片(6 4!11)，玻片551烘烤過夜后 根據標準操作流程用蘇木素-伊紅(HE)染色或用Masson' strichrome染色膠原蛋白。 檢測HA時，皮膚切片用2%的FBS封閉，在生物素標記的HA結合蛋白(bHABP，1 μ g/ml, 溶于 PBS ；Associates ofCape Cod, Inc.，Falmouth, MA)內 4°C孵育過夜，PBS 漂洗，在 Cy-3-streptavidin (1 ； 500 ；Jackson Immunoresearch Laboratories)中室育 30 分鐘，PBS漂洗，最后用前述的方法計數。陰性對照只用PBS孵育。使用Leica DMLB顯微 鏡觀察免疫熒光，并用0ptrOniCSDEI-750D Digital System拍照成像。組織學分析提供了 治療和未治療皮膚傷口形態學差異方面的圖像信息，也反映了 HA蛋白的表達濃度。膠原蛋白含量測定通過測定樣品中羥脯氨酸的含量確定膠原蛋白含量。簡要步驟如下收集8-16周 齡成年小鼠(n = 6，WT或ΗοχΒ13Κ0型小鼠)的背部全層皮膚樣品(約16mg)，凍干過夜后 用6N的HCl在110°C下水解18小時(保證溶液覆蓋整個組織)，再用NaOH將pH值調至 6-7之間。樣品用水稀釋至5ml，用Whatman的濾紙過濾，然后將下列溶液持續加入到Iml 的樣品中氯胺T溶液(1.0ml，0. 05M，室溫下放置20分鐘)、高氯酸(1. 0ml，3. 15M，室溫下放置5分鐘)和20%的ρ-二甲氨基苯甲醛(l.Omi)。樣品在60°C下孵育20分鐘后冷卻到 室溫，557. 5nm下測定吸光度，根據標準曲線計算羥脯氨酸的濃度。用如下的公式計算膠原 蛋白含量羥脯氨酸(yg)X7.46=膠原蛋白(yg)。張力學檢測在本研究中，將傷口及周圍的皮膚小心切割下來后用4%的福爾馬林固定過夜。所 有的組織必須固定相同的時間，一旦開始收集傷口樣品，之后的所有時間點均進行張力學 檢測。張力學分析之前，所有樣品切成統一的長度和寬度，厚度根據傷口位點決定。張力學 研究用拉伸強度試驗檢測系統分析，結果以系數Y表示，Y通過計算應力/張力獲得，代表總 的傷口強度。應力是將傷口區域從傷口代表性區域分離出來所需的力量，張力是樣品/長 度在分離時的起始長度。WT和HOXB13K0型傷口在受傷后的任何時間點，其原始張力和代表 性區域差異并不顯著(數據未顯示)，因此，Y系數的差異主要是來源于應力值的不同。實施例14.制備siRNA抑制劑本發明提供了一種新的選擇siRNA靶向序列的方法，該方法有三個不同于其他方 法的重要方面(I)SiRNA靶向的序列是人和小鼠同類基因的同源序列，這意味著每一個siRNA可 以敲低人或小鼠中的同一基因的表達。例如，一個有效的特異性針對HoxB13的siRNA可以 抑制人HoxB13的表達，也可以抑制小鼠HoxB13的表達。(2)序列有三種不同的長度21nt、23nt和25nt。用不同的模型系統鑒別靶向特 定序列的siRNA的最佳長度。(3)此處使用的siRNA寡聚核苷酸可以是平末端或粘性末端，其中的“寡聚核苷 酸”或類似的術語是與天然產生的短的寡聚核苷酸相關，也涉及合成或修飾的寡聚核苷酸， 這與前面段落的描述一致。寡聚核苷酸長度可以是19nt，或者更長為20-27nt，甚至可以為 超過35nt的長度。寡聚核苷酸可以是19_35nt之間的任意長度的siRNA，優先選擇siRNA的長度在 19-27nt之間。siRNA可以兩端均為平末端，或者均為粘性末端，或者一個平末端一個粘性 末端，粘性末端可以有1-4個或者更多的堿基突出。在優選的實施例中，本發明提供的siRNA為21、23和25bp的平末端結構，“多聚核 苷酸”和“寡聚核苷酸”在此作為同義詞使用。表1.靶向人和小鼠基因組中HoxB13、Cox-2和TGF-β的siRNA序列 表2-10中列出的是靶mRNA的編碼序列，將“U”替換成“t”即成為類似表1的 siRNA序列。表2.轉化生長因子- β 1的序列 表3.轉化生長因子- β 2的序列 表4. C0X-2 的序列 表5. HoxB 13 的序列 表 7. Lamin Bl 的序列
表8. VEGF A 的序列 實施例15. SiRNA雞尾酒的制備方法本發明提供了在同一治療方案中靶向多個疾病控制基因的s iRNA雞尾酒治療方 法。本發明提供的RNAi制劑，如s iRNA寡聚核苷酸，具有相同的化學性質，來源相同制備 過程類似，它們均是由四種堿基組成的不同序列。發明提供了促進傷口無疤痕愈合的siRNA 雞尾酒，該雞尾酒靶向參與傷口愈合的基因，包括TGF- β、C0X-2、HoxB 13和其它基因。
本發明規定了實驗和治療中SiRNA雞尾酒及其應用的兩個非常重要的特征(1) siRNA雞尾酒包括至少靶向三個基因的三種siRNA (不是靶向同一基因的三種 序列)，根據治療要求選取合適的比例。(2)每一個組合中的siRNA雞尾酒靶向的每個基因的功能應具有系統生物學網絡 背景，例如這些基因在同一信號通路或不同信號通路起作用。表A.靴向 HoxB13、C0X-2 和 TGF- β 2 的 siRNA 雞尾酒 表B.靶向HoxB13、C0X_2和VEGFA的第二類雞尾酒 表C.靶向 HoxB13、C0X-2、TGF- β 1 和 TGF- β 2 的備用 siRNA 雞尾酒 表D.靶向 HoxB13、TGF- β 1 和 TGF- β 2 的備用 siRNA 雞尾酒 表F.靶向 HoxB13、COX-2, TGF- β 1 和 PDGFa 的備用 siRNA 雞尾酒 表H.靶向HoxB13、COX-2和Lamin的備用siRNA雞尾酒 實施例16.有關siRNA的補充說明同時靶向人和鼠mRNA序列的siRNA設計方法siRNA設計原則中的一條是所有25個堿基對長度的siRNA都能夠靶向人鼠同源 的同一基因序列。例如，靶向Hoxb 13的siRNA能夠同時靶向人Hoxb 13基因和鼠Hoxb 13基 因。使用siRNA設計的一般原則及專利保護的運算法則在計算機中設計siRNA序列，保證 其具有如下特性(1)適宜的熱力學特性，(2)與RISC結合能力增強，(3)消除免疫激活結 構域，(4)人鼠同源性，(5)通過blast搜索避免“脫靶效應”和(6)能作為siRNA雞尾酒藥 物。任意序列都能夠同時靶向人和鼠相關基因。因此，從鼠細胞研究中確定的有效序列可 使用人細胞模型作進一步的確認。鑒定出靶向TGF- β、Cox-2 和 Hoxbl3mRNA 的有效 siRNA在根據計算機設計合成的10個25堿基對長度的siRNA序列中，我們首先選擇了 3個序列進行檢測。在相應細胞如人PC-3細胞(IV級骨轉移前列腺癌細胞)中檢測這些 siRNA寡聚鏈(Qiagen公司合成)之前，首先使用RT-PCR確定總RNA樣品中靶標基因的表達 (圖14)。有趣的是，我們在PC-3細胞中觀察到了 TGF-β、Cox-2和Hoxbl3mRNA的大量表 達。我們進一步鑒定這三個基因在C166細胞中的表達情況。RT-PCR結果再次確認了 C166 細胞同時表達這三個基因。這樣，我們就可以轉染任一基因靶向的s iRNA至相應細胞，通 過提取總RNA和RT-PCR分析評估基因沉默的效果。在6孔培養板上使用三個不同的劑量 進行轉染0.5yg、lyg和2yg，根據說明書使用Lipo 2000進行轉染。為避免RT-PCR中 過度擴增達到平臺期，我們在擴增階段只用了 25-30個循環，這樣就可以區分每個特異性 靶向的siRNA序列的沉默活性。通過凝膠電泳對RT-PCR產物進行定量分析。圖23列出了 對靶向TGF-β ,Cox-2和Hoxbl3基因的有效siRNA的選擇。在人PC-3細胞和鼠C166細胞 中轉染這三個靶向TGF-β ,Cox-2和Hoxbl3基因的siRNA，然后提取總RNA進行RT-PCR分 析后，我們選擇了如下幾個有效的25個堿基對siRNA，對其改善皮膚無疤痕傷口愈合的潛 在治療效果作進一步研究(l)hmTF-2 正義鏈5，-CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3，，反義鏈5，-AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG-3，；(2) hmCX-1 正義鏈5，-G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAU⑶_3，，反義鏈5，-ACAUCAUCA GACCAGGCACCAGACC-3'；(3)hmHX-l 正義鏈5，-G⑶GGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU-3，，反義鏈 5， -AACACAUCUGGC腳UCCAGCCACC-3’用于傷口愈合分析的皮膚切除傷口模型小鼠背部中央線兩側各切一個5mm直徑的全層皮膚切除傷口(使用C57小鼠或 Balb/c小鼠，圖15)。通過觀察傷口表型如傷口閉合的改變以及靶基因的敲除和組織學變 化來比較治療組和對照組傷口的差異。為了評估小鼠皮膚組織中siRNA介導的基因表達敲 低水平，我們使用RT-PCR檢測皮膚總RNA樣品中TGF- β、Cox_2和Hoxbl3mRNA的表達。根 據廠家說明書提取皮膚樣品的總RNA(RNAque0us-4PCR)。將0. 25 μ g總RNA與oligo (DT) 引物在70°C下孵育3分鐘，然后根據PCR反應條件，使用TGF-β、Cox-2和HoxB13基因的 特異性引物，在含有反轉錄酶20μ1反應體系中42°C下反轉錄30分鐘。(1)鼠TGF-β， 正義鏈5， -CTACTGTGTGCTGAGCACCTT-3，，反義鏈5， -CGCTGCTCGGCCACTCTGGCT-3，， 擴增產物長度488bp。(2)鼠 Cox-2,正義鏈5’ -GGAAGCCTTCTCCAACCTCT-3，，反義 鏈5，-GGATACACCTCTCCACCAAT-3，，擴增產物長度37Ibp ； (3)鼠 HoxB13，正義鏈 5，-CTCCAGCTCCTGTGCCTTAT-3，，反義鏈5，-ACTGGCCATAGGCTGGTATG-3，，擴增產物長度 205bp。用于siRNA體內導入的組氨酸_賴氨酸聚合物優化的組氨酸-賴氨酸聚合物已經被運用到siRNA的體內外轉染。HK聚合物中的 一對H3K4b和PT73，具有一個賴氨酸主鏈及四個含有多重組氨酸、賴氨酸或天冬氨酸的支 鏈。當這種HKP水溶液與siRNA溶液以4 1的N/P比混合后，將自動形成納米顆粒(平均 直徑為100-200nm，圖16)。具最佳分支的組氨酸賴氨酸聚合物HKP是通過Ranin Voyager 合成器合成的(PTI，Tucson，AZ)。兩種已經投入使用的HKP為H3K4b和PT73，他們具有一 個共同的(R) K (R) -K (R) - (R) K (X)結構，在 H3K4b 中 R = KHHHKHHHKHHHKHHHK,而在 PT73 中 R = KHHHKHHHNHHHNHHHN,X = C(0)NH2，其中 K =賴氨酸，H =組氨酸，N =曲林菌素。將 HK 溶解后，以質量比為4 1的比例與siRNA溶液混合，形成平均直徑為150-200nm的納米顆 粒。HKP-siRNA水溶液為半透明狀，沒有明顯的沉淀物聚集，可以在4°C下儲存至少三個月。 我們將甲基纖維素用于HKP在皮膚傷口中siRNA的導入。皮膚切除傷口模型用于傷口愈合的研究我們首先用皮膚切除傷口模型做的實驗是為了分析組氨酸-賴氨酸聚合物介導 TGFi3-siRNA局部給藥后的治療效益。用十只小鼠，每只小鼠背部中央線兩側各切一個5mm 直徑的全層皮膚切除傷口(使用C57小鼠或Balb/c小鼠)。使用甲基纖維素作為常規的局 部給藥載體。小鼠背部的兩個傷口其中一個只用甲基纖維素，另一個傷口給予甲基纖維素 加納米顆粒/siRNA復合物，前五天每天給藥，觀察時間點設在第0、5、9和15天。最后，將所 拍圖片放一起后，我們發現納米顆粒增強siRNA導入治療組的傷口愈合效果非常明顯。第 5天觀察，治療組的傷口愈合速度明顯大于對照組。而到了第9天，治療組幾乎所有的傷口 均愈合良好，而對照組仍然有很多開放性傷口。到了第15天，兩組之間淺表皮膚已經沒有 很大的差別。
切除皮膚傷口愈合的量化我們開展的第二個實驗是為了量化各時間點傷口的愈合情況。同時，我們還要確 定這種治療效果是由HK聚合物引起或是siRNA本身的作用。每組10只共四組小鼠用于實 驗研究1)僅使用甲基纖維素，2)甲基纖維素加納米顆粒/TGFi3-l-siRNA，3)甲基纖維素 加TGF β -1-siRNA, 4)甲基纖維素加納米顆粒/對照siRNA。通過對第5天和第9天測定的 數據進行平均處理后，我們發現第2組和其他組織間具有顯著性的差異，盡管在第3組也觀 察到了一定的效果。很明顯，傷口快速愈合的治療效果是納米顆粒增強TGFi3-Ι-siRNA導 入的結果。皮膚切除傷口樣品中靶基因敲除的證實我們已經知道納米顆粒增強的TGFii-I能夠促進傷口快速愈合，而一個關鍵的問 題是傷口周圍的組織是否也出現了靶基因的敲低現象。為驗證這個問題，我們首先從每組 最典型的樣品中提取了總RNA，進行RT-PCR分析。如圖21顯示，納米顆粒/TGF β-IsiRNA 治療組的傷口組織中TGFii-I的表達水平相對于對照組明顯降低。有趣的是，HK聚合物包 裹的靶向TGF0 -l、Hoxbl3和Cox-2的siRNA雞尾酒與HKP包裹的TGF^-IsiRNA具有相似 的TGF β -1敲除活性，因為HKP包裹的特異性靶向Hoxbl3或Cox_2siRNA也會出現TGF β -1 的下調現象。傷口修復過程中皮膚組織的病理組織切片圖使用三種放大倍數觀察圖中箭頭所指傷口區域周圍真皮組織結構。創傷形成后 第14天收集皮膚樣品，三聚甲醛固定后進行Masson' strichrom染色，檢測膠原疤痕組 織。TGF3 IsiRNA, Cox-2 si RNA-和Hoxbl3siRNA_納米顆粒治療組的傷口修復到了類似于 正常皮膚構造。用TGF β IsiRNA、Cox-2 si RNA和Hoxbl3siRNA納米顆粒復合物治療后的傷 口出現正常的網狀膠原纖維的新生真皮組織，形成松散的波浪狀結構。而在對照組或對照 siRNA-納米顆粒治療組中新生膠原纖維密集分布，呈非正常的平行狀。這些事件使膠原纖 維排列更緊密(圖22)，便于膠原交聯，最終降低傷疤的厚度。分子內和分子間的膠原纖維 交聯后導致耐破強度的增加。導入HKP-Cox-2-siRNA導致正常組織樣的皮膚結構我們知道納米顆粒增強的TGF β -1對皮膚傷口愈合治療有效，我們也想知道靶向 Cox-2和Hoxbl3基因的siRNA聚合物是否也有這種效果。同時，我們還需要確定組織病理 學變化確實是由納米顆粒/siRNA引起的(圖23)。圖中顯示正是納米顆粒/siRNA促進了 類似正常皮膚的組織構造。抗拉強度是單位面積皮膚的載荷能力。傷口的耐破強度是指打 破任何大小的一個傷疤所需的力量，耐破強度因皮膚的厚薄而異。一個傷口的抗拉強度大 概在受傷后的第60天達到峰值。一個完全愈合的傷口其抗拉強度只有未受傷皮膚的80% 左右ο組氨酸-賴氨酸聚合肽的抗真菌作用前期研究已經表明，相對于線性狀的類似物質，HK聚合物能夠更有效的將siRNA 導入到細胞內。為了證明分支狀HKP能夠有效的抗菌，我們研究了不同分支數量的HKP抑制 白色念珠菌(C. albicans)生長的情況(圖24)。在37. 5% μ g/ml (4. 5 μ Μ)的濃度下，H2K3b 對C. albicans的抑制率為11. 3 %，而在50 μ g/ml (6. 0 μ Μ)的濃度下，抑制率為61. 7 %。 H2K4b具有更強的抗C. albicans作用，在37. 5% μ g/ml (4. 5 μ Μ)的濃度下抑制率達到將近40%，在5(^8/1111(6.(^10的濃度下抑制率高達85%。很明顯HKP的分支程度越高，其 抗C. albicans菌生長的作用越明顯。相對于體外活性，這些多聚肽之間的體內毒性差異 更明顯。前期的數據表明對小鼠靜脈注射給藥H3K(G) 4b的劑量高達IOOOg(50mg/kg)時， 在給藥后的十秒之內沒有見到急性毒性或亞急性毒性(肺、肝和腎)。相反，給藥相同劑量 的H2K4b后24小時，肝臟、肺和腎均出現了毒性。在檢測的三個器官中，腎臟對多肽的最敏 感。與H2K4b相比，H3K4b和H3K(G)K4b終末分支中陽離子的增加可能是引起體內外毒性 降低的部分原因，電荷的降低可能會減少與細胞膜表面負電荷的相互作用。H3K(G)4b聚合 物與H3K4B相比多了八個額外的谷氨酸，因而平均每個氨基酸的單位電荷量相對較少。因 為在H3K (G) 4b和H3K4b的每個終端臂中都有五個賴氨基，然而，我們懷疑微弱的差別就很 容易導致H3K(G)4b的毒性H3K4b低。另外一個可能性是甘氨酸會破壞終端分枝的α螺旋 結構，增加聚合物的靈活性，使之容易被酶催化降解。幾個多肽的二級結構表明了含甘氨酸 多肽的Η3Κ (G) 4b和不含甘氨酸的多肽H2K4b和H3K4b之間的α螺旋含量有顯著差異。實 際上，前期的圓二色光譜研究已經證明H 3K(G)4b相對于H3K4b具有更少的α螺旋結構。基于在幾個動物模型中使用SiRNA療法改善無疤痕傷口愈合的大量研究，我們對 分支狀組氨酸_賴氨酸聚合肽用于有效的siRNA體內(真皮)導入非常有信心。實施例17.后期研究實驗設計為了達到預期的實驗目的，即開發出一個臨床可行的、用于改善成年人皮膚傷口 無疤痕組織修復，且不出現抗拉強度的降低和表皮細胞再生的RNA干擾治療方案，我們設 計了三個具體目標體外鑒定特異性沉默TGF- β C0X-2和Hoxbl3表達的最有效siRNA如表1所示，我們已經用電子計算機對靶向基因Hoxbl3、C0X-2和TGF- β 1分別設 計了 10個SiRNA序列。我們從中分別選取了 3個SiRNA，并對它們在兩個代表性細胞系即 人PC-3和鼠C166細胞系中的靶基因敲低效率進行了檢測。篩選靶向每個基因的最有效siRNA為確保能夠篩選出最有效的siRNA作將來的治療使用，我們將使用已鑒定的 siRNA作為基準，進一步評估針對TGF β -UC0X-2和Hoxbl3三個基因的其余三組siRNA (每 組三個)。選擇一個靶向非相關基因，且與人、鼠基因沒有同源性的siRNA作為對照序列 CT-I (正義鏈，5，-GAGGAGCCUUCAGGAUUACAAGAUU-3’ 和反義鏈 5，-AAUCUUGUAAUCCUGAAGGC UCXUC-3’ )，該siRNA在我們之前發表的幾項研究中已經被證實。三個同時靶向人和鼠Hoxbl3基因的序列如下hmHX-1 (正義鏈，5，-CAAGGAUAUCGAAGGCUUGCUGGGA-3，，反義鏈，5，-UCCCAGCAAGCCUUCGAUAUCCUUG-3，)；hmHX-2 (正義鏈，5，-GGACAAGAGGCGCAAGAUCUCGGCA-3，，反義鏈，5，-UGCCGAGAUCUUGCGCCUCUUGUCC-3，)；hmHX-3 (正義鏈，5，-GCAAGAUCUCGGCAGCCACCAGCCU-3，，反義鏈，5，-AGGCUGGUGGCUGCCGAGAUCUUGC-3，)三個同時靶向人和鼠Cox-2的siRNA序列為hmCX-1 (正義鏈，5，-CAUCA⑶UUUUCAAGACAGAUCAUA-3，，反義鏈，5，-UAUGAUCUGUCUUGAAAAACUGAUG-3，)；
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hmCX-2 (正義鏈，5，-GUCUUUG⑶CUGGUGCCUG⑶CUGA-3，，反義鏈，5，-UCAGACCAGGCACCAGACCAAAGAC-3，)；hmCX-3 (正義鏈，5，-GUGCCUG⑶CUGAUGAUGUAUGCCA-3，，反義鏈，5，-UGGCAUACAUCAUCAGACCAGGCAC-3，)。三個同時靶向人和鼠TGF-β 1的siRNA序列為hmTF-1 (正義鏈，5，-GAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCAU-3，，反義鏈，5，-AUGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUC-3，)；hmTF-2 (正義鏈，5，-CACGAGCCCAAGGGCUACCAUGCCA-3，，反義鏈，5，-UGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC⑶G-3，)；hmTF-3 (正義鏈，5，-GGCGCCGCCUCCCCCAUGCCGCCCU-3，，反義鏈，5，-AGGGCGGCAUGGGGGAGGCGGCGCC-3，)。經過一系列的轉染試驗后，分離純化RNA進行RT-PCR分析，確定這些siRNA是否 比已經鑒別確定的siRNA效果更好。siRNA轉染進入特定的細胞培養物我們發現人PC-3細胞系十分適合所有三個基因靶標的siRNA介導的基因沉默研 究，我們將堅持用PC-3細胞進行基因表達敲低的體外研究，分析mRNA和蛋白質表達水平， 并將其余三個siRNA與已經鑒別的siRNA比較。類似的，也用C166細胞研究檢測所有三個 基因的siRNA。兩個細胞系用DMEM培養基在ΙΟ-cm培養板上培養，培養基含有10%胎牛 血清(FBS)、100y g/ml的硫酸鏈霉素和100U/ml的青霉素，然后使用Lipofectamine 2000 轉染siRNA進入細胞。將細胞用PBS洗滌兩次后用無FBS的培養基孵育24小時，接著將含 10% FBS的培養基代替無血清培養基，啟動細胞周期。轉染實驗同時設置試劑對照組和非 特異性siRNA對照組，在6孔培養板上使用三個劑量轉染特定的siRNA 0. 5、1. 0和2. 0 μ g/ 孔。潛在的缺陷有使用Lipofectamine 2000對這些細胞轉染不一定總是有效，因而需要 電轉或其它轉染試劑作為替代備用方案。為確保獲得滿意的數據，有效的轉染和RT-PCR分 析等工作是十分必要的。RT-PCR測定基因在mRNA水平的表達從轉染的PC-3和C166細胞系中提取總RNA。為檢測Hoxbl3擴增子(鼠)， 逆轉錄反應后使用下列引物進行PCR反應正向引物5 ’ -CGGGCTGGGCCATGGGGTGGA-3 ’ 和反向引物5’ -CCTATCAGTATTAGCCTGCTT-3’。同理，為檢測Cox-2擴增子(鼠)，逆轉 錄反應后使用下列引物進行PCR反應正向引物5 ’ -CGGGCTGGGCCATGGGGTGGA-3，和反 向引物5，-CCTATCAGTATTAGCCTGCTT-3，；為檢測TGF β -1擴增子(鼠)，逆轉錄反應后 使用下列引物進行PCR反應正向引物5，-CTACTGTGTGCTGAGCACCTT-3，和反向引物 5’ -CGCTGCTCGGCCACTCTGGCT-3’。PCR產物使用1 %瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠進行染 色,我們也通過購買定量 PCR 儀(Q-PCR，MyiQ real-timedetection systems)來提高 PCR 的質量。PCR產物能夠反映每個siRNA敲低特異性mRNA表達的水平。這一實驗可以確定 每個siRNA的效力，因此能簡單明了的看出某一個siRNA是否為最有效的。RT-PCR分析必 須在轉染之后快速進行，這樣可以優化特定細胞系有效轉染的條件，獲得足夠數量的總RNA 進行PCR分析。此外，應該重復三次試驗來確定每個基因的最有效的siRNA，將待檢測的三 個siRNA與之前已經鑒定的siRNA進行比較分析。
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ELISA檢測蛋白水平的改變為了檢測相應SiRNA轉染細胞后的蛋白表達情況，Western blot分析和ELISA分 析必須有效而且符合要求。細胞裂解液或細胞培養基直接用于蛋白檢測。雖然沒有檢測 Hoxb 13的商業化的ELISA試劑盒，我們可以使用鼠抗Hoxbl3多克隆抗體(Aviva Systems Biologies, SanDiego, CA)進行 Western blot 檢測 REK 細胞中 siRNA 介導的 Hoxbl3 基因 敲低情況。用鼠Hoxbl3蛋白N末端(1-79個氨基酸)制備兔抗Hoxbl3抗體，這一抗體能 夠識別野生(WT)和敲除的Hoxbl3蛋白，后者是在同源域的第33個氨基酸殘基停止翻譯的 截短蛋白。使用前，血清先進行陽離子吸附純化，接著用鼠Hoxbl3和兔Hoxbl3抗原進行陰 離子吸附純化，以消除可能與其他Hoxbl3的交叉反應。使用Leica DMLB顯微鏡觀察染色 情況，用 Optronics DEI750D 數字系統(Goleta5CA)拍照。人 C0X-2 基因使用 COX-2 ELISA 試劑盒(Zymed，San Francisco,CA)進行分析，該試劑盒是一種定量測定細胞上清和細胞裂 解液中人C0X-2的酶聯免疫夾心試驗。因為環氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是一種膜結 合酶，分子量為71kDa，因此選擇細胞溶解物進行ELISA分析。鼠TGFi^-I基因使用人/鼠 TGFbl (轉化生長因子 betal，TGF-betal 或 TGF-β 1) ELISA Ready-SET-Go 試劑盒(在預包 被板上)進行分析。選擇每個基因最有效siRNA的這些試驗應該重復三次。本室驗的潛在缺陷是有時候根據mRNA敲低水平篩選的最有效siRNA與根據蛋白 抑制篩選篩選的siRNA不一致。發生這樣的情況時，我們會根據mRNA水平數據進行篩選， 因為mRNA被抑制是RNA干擾機制的直接反映(盡管有些評論家持有不同的觀點)。蛋白水 平的表達抑制存在一定程度的偏差，有可能是非特異性或所謂的“脫靶”效應引起的，它可 能是微型干擾RNA(miRNA)介導的基因表達下調的結果，而不是由RNA干擾機制引起的。體內篩選最有效的siRNA雞尾酒通過細胞水平的研究選擇了 Hoxbl3、C0X-2和TGFi^-I三個基因各自最有效的 siRNA后，我們將它們組合成不同比例雞尾酒。組合比例可以是1 1 1、2 1 1和 3:1: 1等。考慮到Hoxbl3對于成年人傷口愈合的重要性，我們重點考慮的是Hoxbl3特 異性siRNA的比例。另外，我們將評估合適的鼠模型及siRNA納米顆粒復合物，這樣我們就 可以確定最有效的siRNA納米顆粒復合物作為有潛力的治療方案。評價多靶標siRNA雞尾酒的鼠模型為了評估合適的siRNA雞尾酒及最有效的復合物，我們從Ling Li博士實驗室獲 取了 Hoxbl3敲除(KO)的成年鼠，因為與相應的野生型(WT)鼠相比，Hoxbl3 KO鼠的傷口 在愈合過程中表現出妊娠胎兒傷口修復的一些特征，包括傷口的快速愈合、抗拉強度的增 加以及真皮傷疤的減少。生化評估顯示成年人未受傷的Hoxbl3 KO皮膚表皮與真皮中的透 明質酸(HA)明顯高于未受傷的WT皮膚。根據以上這些結論，我們推斷成年人皮膚的分化 是由Hoxbl3引起的，如果Hoxbl3被敲除，則會出現類似于胎兒的皮膚環境，增強傷口的修 復過程。除了使用公認的背部皮膚切除的Hoxbl3 KO小鼠模型，我們同時建立了一個小鼠 唇傷口模型來模仿兔唇裂鄂。在我們的研究中，在全身麻醉和無菌的條件下，Hoxbl3K0和 WT成年鼠(8-16周齡)將模仿兔唇裂鄂，對其前牙并聯位置處形成0. 5cm的全層皮膚切除 傷口，并進行縫合(6.0尼龍)。用于導入多靶標siRNA雞尾酒的復合物為建立聚合物-siRNA納米顆粒系統，我們決定首先檢測組氨酸_賴氨酸分支化聚合物。在馬里蘭大學的生物多聚物核心設備RaninVoyager合成器(PTI，Tucson，AZ)上 合成這些聚合物。能夠有效用于siRNA的體內轉導的這些分支狀HK聚合物，與siRNA雙 鏈化合物絡合后可用于局部給藥。該聚合物通過HPLC(Beckman，Fullerton，CA)純化。研 究中使用的第二分枝狀的H(組氨酸)和K(賴氨酸)聚合物必須為R-KR-KR-KR，其中R = [ΗΗΗΚΗΗΗΚΗΗΗΚΗΗΗ] 2ΚΗ4ΝΗ4]。H3K4b與上述聚合物具有相同的核心區域和結構，只有R分 枝不同，其R = KHHHKHHHKHHHKHHHK。HKP溶于水后，與siRNA水溶液以質量比為4 1的 比例混合，將形成平均直徑為150-200nm的納米顆粒。HKP-siRNA水溶液呈半透明，無明顯 可見的聚集沉淀，在4°C條件下至少可以儲存三個月(50)。除了 HK聚合物，我們同時檢測 了兩個不同類型的載體聚合物一聚二乙醇化的PEI和PAMAM Dendrimer-將siRNA雞尾 酒導入皮膚傷口區域的效率。所有的這些siRNA聚合物溶解于無RNA酶的D5W溶液，然后 加入2%的甲基纖維素(1 1)中或1.5%甲基纖維素PBS(1 1)混合液中。這一配方 用于傷口位置，并用Tegaderm透明敷料覆蓋(或者不需覆蓋)。多靶標siRNA雞尾酒在皮膚傷口處的給藥方式為了檢測在兩個不同皮膚傷口模型中各種組合藥物的效果，我們首先檢測固定 組合成分但比例不同的三個siRNA復合物，實驗設計靶向的三個基因為Hoxbl3、Cox-2 和TGF-β，比例為1 1 1、2 1 1和3 1 1，并與H3K4b形成聚合物。實驗組 為G1 每個唇外科傷口給藥20 μ g對照siRNA-HK聚合物(50 μ L) ；G2 每個唇傷口給藥 20 μ g Hoxbl3siRNA-HK 聚合物(50 μ L) ；G 3 每個唇傷 口給藥 20 μ g Cox-2siRNA_HK 聚合 物(50 μ L) ；G4 每個唇傷口給藥20 μ g TGF- β siRNA-HK聚合物(50 μ L) ；G5 每個唇傷口 給藥20 μ g雞尾酒siRNA-HK聚合物(50 μ L) ；G6 每個唇傷口給藥20 μ g兩個siRNA-HK聚 合物(50 μ L) ；G7 每個唇傷口給藥20 μ g三個siRNA-HK聚合物(50 μ L)。每組四只動物。 Hoxbl3K0和WT鼠給予相同的給藥方式。該實驗的目的是為證明s iRNA雞尾酒藥物相對于 單個siRNA的協同效應。而KO動物組和WT組之間的結果比較可以使我們觀察到不同的動 物檢測模型對于新型治療的反應。不同藥物組分對傷口修復的影響因為要檢測三個siRNA形成的雞尾酒，我們計劃僅在Hoxbl3WT鼠唇切除模型中檢 測這三個復合物。實驗中s iRNA組合的比例將重點放在1 1 1。實驗組包括Gl JOyg對 照 siRNA-HK 聚合物(50 μ L) ；G2 :20 μ g 對照 siRNA-聚二乙醇化 PEI 聚合物(50 μ L) ;G 3 20 μ g對照 SiRNA-PAMAM Dendrimer (50 μ L) ；G4 20 μ g雞尾酒 s iRNA-HK聚合物(50 μ L)； G5 20 μ g雞尾酒s iRNA-聚二乙醇化PEI聚合物(50 μ L)和G6 20 μ g雞尾酒siRNA-PAMAM Dendrimer (50 μ L)。每組設置四只動物。在體內研究檢測后進行mRNA和蛋白水平的分析。 該研究能夠幫助我們判定多靶標siRNA雞尾酒作為臨床使用的最佳組合方式。mRNA水平和蛋白水平上檢測體內靶基因的敲低從Hoxbl3K0和WT鼠背部皮膚傷口和唇傷口中切下樣品，浸入含10% FBS的高 糖DMEM溶液中，添加抗生素/兩性霉素B，用70%的酒精進行表面消毒，切成5mm2左右的 小塊，在4°C下于DMEM(5mg/ml)中用中性蛋白酶消化過夜。細胞和組織中的總RNA樣品使 用RETROscript試劑盒(Ambion)進行反轉錄。對于抗體染色，用多聚甲醛固定成年WT鼠 和Hoxbl3K0鼠的皮膚樣品，植入石蠟中進行切片(6 4!11)，于551下烘烤過夜。使用相同的 方法提取RNA并制備樣品進行免疫組化分析以檢測體內Cox-2和TGF-β的變化。對于最有效siRNA雞尾酒的鑒定，必須考慮到以下因素，即皮膚傷口模型、Hoxbl3基因型以及每個 siRNA的比例。在同樣的原則下，mRNA水平的敲低是多靶標siRNA雞尾酒療效的一個關鍵 性指標。多靶標siRNA雞尾酒潛在的治療優勢為了對siRNA雞尾酒治療效果有一個初步評價，我們將開展組織病理學分析及透 明質酸(HA)分析。將皮膚樣品用甲醛固定、石蠟包埋后，進行切片處理(6μπι)。按照標準 的操作流程，將切片在55°C烘箱中烘烤過夜，并用蘇木紫和曙紅染色或用Masson三色對其 膠原染色。檢測HA時，用2%的FBS封閉皮膚切片，與生物素(biotin)標記的HA結合蛋白 (bHABP, 1 μ g/ml in PBS ；Associates of Cape Cod, Inc.，Falmouth, MA)4°C共孵育過夜， PBS 洗^條后與 Cys_3_ 鏈霄親禾口素(Cy_3_streptavidin，1 ； 500 ； Jackson Immunoresearch Laboratories)混合室溫下孵育30分鐘，PBS洗滌后根據前述方法進行包埋。作為陰性對照 組的組織僅孵育在PBS中。使用Leica DMLB顯微鏡觀察免疫熒光，經Optronics DEI-750D 數字化系統采集圖像。組織學分析將給我們呈現治療組和未治療組皮膚傷口的形態差異， 以及HA蛋白之間的強度差異。制定多靶標siRNA雞尾酒藥物的臨床應用方案siNRA雞尾酒的合適比例需要根據其與最佳聚合物的組合模式確定，并且與特定 小鼠模型相關。我們將設計實驗來檢測候選治療方案的藥理學特點及任何明顯的毒性作用 或副作用。為了能得到的更清晰的結果，我們假定使用的唇傷口模型就是我們選定的模型 (盡管真正的實驗結果需要完成前兩個研究之后才能得出)。多靶標siRNA雞尾酒的劑量依賴曲線為明確鑒定出來的具有治療效益的候選s iRNA雞尾酒的最佳使用劑量，我們將在 小鼠唇傷口模型中使用6個不同的劑量給藥。檢測組分別為Gl 傷口使用2μ g/50y L的 劑量；G2 傷口使用 ομ g/50l·! L的劑量；G3 傷口使用20 μ g/50 μ L的劑量；G4 傷口使用 30 μ g/50 μ L的劑量；G5 傷口使用40 μ g/50 μ L的劑量；G6 傷口使用60 μ g/50 μ L的劑 量。每組有4只小鼠。使用組織學和形態方法學評估分子生物學和生化特征。組織病理學和HA分析皮膚樣品用多聚甲醛固定處理，接著用石蠟包埋，并進行組織切片(6μπι)。按照 標準操作，樣品應于55°C烘箱中放置過夜，并用蘇木紫和曙紅染色或用Masson三色對其膠 原染色。對于HA的檢測，首先用2% FBS對皮膚組織進行封閉，4°C條件下與生物素標記 的 HA 結合蛋白(bHABP, 1 μ g/ml 溶于 PBS, Associates of Cape Cod, Inc.，Falmouth, MA) 培養過夜，用PBS沖洗，再與Cys-3-鏈霉親和素(Cy-3-str印tavidin，1 500 Jackson Immunoresearch Laboratories)混合，室溫孵育30分鐘，PBS洗滌并固定后分析檢測。 另外，將組織單獨孵育于PBS中作為陰性對照。免疫熒光使用Leica DMLB顯微鏡觀察， Optronics DEI-750D數字化系統采集圖像。組織學分析將給我們呈現治療組和未治療組皮 膚傷口的形態差異，以及HA蛋白之間的強度差異。膠原含量的定量分析通過測定樣品羥基脯氨酸(Hydroguinone)的含量來檢測膠原含量。將從8_16周 大的成年鼠中(WT鼠和Hoxbl3 KO鼠各6只)獲得的全層皮膚真皮樣品(約16mg)凍干， 隔夜后用6N HCl在110°C下水解18小時(HCl的量足夠覆蓋整個組織)，NaOH調節pH至6-7。用水將樣品稀釋至5ml，并用Wha tman濾紙進行過濾。接著將以下溶液連續加入至 1.0ml的每個樣品中氯胺T溶液(1.0ml,0. 05M，室溫放置20分鐘)、高氯酸(1.0ml, 3. 15M， 室溫放置5分鐘)，以及20%的ρ- 二甲氨基苯甲醛(1. Oml)。樣品必須在60°C環境下孵育 20分鐘并冷卻至室溫。在557. 5nm波長處讀取其吸光度，使用標準曲線法測定羥基脯氨酸 的濃度。使用以下公式計算膠原含量羥基脯氨酸含量(yg)x7.64=膠原含量(yg)，報 告的干重單位為yg/mg。皮膚張力的測量在本研究中，小心切除傷口及周邊的皮膚，將該組織用4%多聚甲醛固定過夜。所 有的組織都需固定相同的時間，在收集樣品后測量所有時間點的皮膚張力。分析張力前，將 樣品切成統一的長度和寬度，測量傷口位置的皮膚厚度張力學研究用Instron拉伸強度試 驗檢測系統分析，結果以系數Y表示，Y通過計算應力/張力獲得，代表總的傷口強度。應 力是將傷口區域從傷口代表性區域分離出來所需的力量，張力是樣品/長度在分離時的起 始長度。WT和HoxB13K0型傷口在受傷后的任何時間點，其原始張力和代表性區域差異并不 顯著(數據未顯示)，因此，Y系數的差異主要是來源于應力值的不同。總之，我們相信前期研究所得的這些大量數據對于理解多靶標SiRNA雞尾酒的特 點提供很有價值的信息，使我們更好地建立關于多靶標siRNA雞尾酒藥物如何改善成年人 皮膚傷口修復，并在快速愈合過程中產生更少的傷疤組織和更強的抗拉能力的臨床方案。 第一階段的SBIR研究能夠為我們產品開發及二期申請研究提供堅實的基礎。多靶標siRNA 雞尾酒藥療法是一個很新穎的治療方法，能夠治療各種類型的皮膚傷口，具備藥用市場價 值和美容市場價值。參考文獻1. Singer AJ, Clark RA :Cutaneous wound healing. N Engl JMed 1999,341 738-746.2. Martin P :ffound healing :aiming for perfect skinregeneration. Science 1997，276 :75-81.3. Rowlatt U :Intrauterine wound healing in a 20week humanfetus. Virchows Arch A Pathol Anat Histol 1979，381 :353_36L4. Lin RY, et al. 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權利要求
一種小干擾RNA(siRNA)分子，其包含雙鏈(雙鏈體)寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸靶向單鏈(ss)靶RNA分子中的互補核苷酸序列，其中所述ss靶RNA分子是編碼至少多肽或蛋白的一部分的mRNA，所述多肽或蛋白的活性促進炎癥、傷口愈合或皮膚組織的疤痕形成，或其中所述ss靶RNA分子是用作調控分子的microRNA(miRNA)，所述調控分子的活性促進炎癥、傷口愈合或皮膚組織的疤痕形成。
2.權利要求1的siRNA分子，其中所述靶mRNA分子編碼選自促炎通路基因、促血管生 成通路基因和促細胞增殖通路基因的基因。
3.權利要求2的siRNA分子，其中所述基因是Hoxbl3、TGF-β1、TGF-β 2或Cox_2。
4.一種組合物，其包含權利要求1、2或3的siRNA分子和藥學上可接受的載體。
5.一種組合物，其包含至少三種siRNA分子和藥學上可接受的載體，其中每種s iRNA 分子與編碼基因的mRNA分子結合，所述基因選自由促炎通路基因、促血管生成通路基因和 促細胞增殖通路基因組成的組。
6.權利要求5的組合物，其中所述至少三種siRNA分子的每一種與編碼選自所述組的 不同基因的不同mRNA分子結合。
7.權利要求6的組合物，其中所述基因的每一種選自不同的所述通路基因的組。
8.權利要求5的組合物，其中所述siRNA分子選自表A-H中鑒定的混合物。
9.權利要求5的組合物，其中所述siRNA分子靶向一種或多種表2、3、4或5中所列的 序列，所述序列抑制人和小鼠細胞中的Hoxbl3、TGF-β l、TGF-i3 2或Cox-2的表達。
10.權利要求5的組合物，其中所述siRNA分子選自表6、7、8或9中所列的抑制人和小 鼠細胞中的PDGFa、FGF-2、VEGF A或核纖層蛋白Bl的表達的siRNA分子。
11.權利要求4-10中的任一項的組合物，其中所述藥學上可接受的載體包括分支的組 氨酸多肽或分支的賴氨酸多肽。
12.用于治療受試者中的真皮或表皮傷口的方法，其中所述傷口的特征至少部分在于 炎癥和新血管形成，所述方法包括給所述受試者施用藥學有效量的權利要求1-3的任一項 的 siRNA。
13.用于治療受試者中的真皮或表皮傷口的方法，其中所述傷口的特征至少部分在于 炎癥和新血管形成，所述方法包括給所述受試者施用包含至少一種siRNA分子以及藥學上 可接受的載體的組合物，其中所述至少一種siRNA分子抑制至少一種基因的表達，所述基 因促進所述傷口的愈合中的病理學或不希望的過程。
14.權利要求13的方法，其中所述至少一種基因選自促炎通路基因、促血管生成通路 基因和促細胞增殖通路基因。
15.用于治療受試者中的真皮或表皮傷口的方法，其中所述傷口的特征至少部分在于 炎癥和新血管形成，所述方法包括給所述受試者施用藥學有效量的權利要求4-11的任一 項的組合物。
16.權利要求12、13、14或15的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
17.權利要求12、13、14或15的方法，其中所述受試者是人。
18.鑒定包含雙鏈(雙鏈體)寡聚核苷酸的siRNA分子的方法，其中所述寡聚核苷酸靶 向單鏈(ss)靶RNA分子中的互補核苷酸序列，其中所述ss靶RNA分子是編碼至少多肽或 蛋白的一部分的mRNA，所述多肽或蛋白的活性促進炎癥、傷口愈合或皮膚組織的疤痕形成，或其中所述ss靶RNA分子是用作調控分子的micr0RNA(miRNA)，所述調控分子的活性促進 炎癥、傷口愈合或皮膚組織的疤痕形成，所述方法包括步驟(a)產生經設計靶向所述ss靶RNA分子中的互補核苷酸序列的siRNA雙鏈體的集合， 其中所述siRNA雙鏈體的靶向性鏈包含不同的核苷酸序列；(b)選擇在體外對所述靶分子展示最高的期望的作用的siRNA雙鏈體；(c)在動物傷口模型中評估所選擇的siRNA雙鏈體；和(d)選擇在所述模型中展示最大的功效的siRNA雙鏈體。
19.權利要求18的方法，其還包括下列步驟將藥學上可接受的載體加至步驟(b)中 選擇的所述siRNA雙鏈體的每一種，從而形成藥物組合物，和在所述動物傷口模型中評估 所述藥物組合物的每一種。
20.權利要求18或19的方法，其中所述動物傷口模型是Hoxbl3敲除小鼠的唇切割傷 口模型，或Hoxb 13敲除小鼠的背部切割傷口模型。
21.權利要求18或19的方法，其中所述在動物傷口模型中評估所述siRNA雙鏈體的 步驟包括在Hoxbl3敲除小鼠的唇切割傷口模型和Hoxbl3敲除小鼠的背部切割傷口模型中 評估所述siRNA雙鏈體。
22.權利要求5的組合物，其包含靶向TGF-β1、Cox-2和Hoxbl3的siRNA雙鏈體。
23.權利要求22的組合物，其中所述siRNA雙鏈體包含下列寡聚核苷酸(1)hmTF-2 有義，5 ‘ -CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3 ‘反義，5' AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG-3 ‘；(2)hmCX-1 有義，5 ‘ -G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAU⑶-3 ‘反義，5 ‘ -ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC-3 ‘；和(3)hmHX-1 有義，5 ‘ -GGUGGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU-3 ‘反義，5 ‘ -AACACAUCUGGCU⑶UCCAGCCACC-3 ‘。
全文摘要
本發明提供了用于促進皮膚傷口無疤痕愈合和改善其它皮膚問題例如牛皮癬和狼瘡引起的皮膚損傷的小干擾RNA(siRNA)分子，包含其的組合物，以及使用其的方法。本發明包括抑制一個或多個基因的表達的siRNA分子和包含其的組合物以及使用其的方法，所述基因在傷口愈合中促進病理或不期望的過程。
文檔編號A61K31/70GK101917846SQ200880124132
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月6日 優先權日2007年11月6日
發明者L·李, P·Y·盧, V·西蒙南柯 申請人:圣諾制藥公司