專利名稱：Mek1蛋白阻斷物在制備抗病毒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種蛋白阻斷物在制備抗病毒藥物中的應 用，具體涉及MEK1蛋白阻斷物在制備抗病毒藥物中的應用。
背景技術：
目前應用的抗病毒藥物主要有2類。 一類是針對病毒自身成分設計的抗病 毒藥物，目前應用的抗病毒藥物多屬于這一類，如拉米夫定，是一種核苷類似 物，可抑制病毒的DNA合成，其抗病毒作用明確。但這類藥物針對病毒的核 酸成分，易導致病毒變異而形成耐藥性。另一類是宿主天然抗病毒物質來源的 抗病毒藥物。目前在臨床中應用的主要是干擾素，其主要與其他抗病毒藥物聯 合應用，僅用于病毒性肝炎等疾病的治療，且有較嚴重的毒副作用。目前使用 的抗病毒藥物遠遠不能滿足實際工作的需要。因此，尋找一種具有抗病毒譜更 廣、能克服病毒變異和毒副作用等問題的新型抗病毒藥物，是當前亟需解決的 重要問題。
如參考文獻1-3所述，目前的抗病毒藥物多局限于"病毒"本身單一因素， 而嚴重地忽略了病毒與宿主細胞相互作用這一重要環節。如參考文獻4和5所 述，細胞RAF/MEK/ERK信號級聯通路在病毒增殖過程中具有重要的作用。ERK 通路是由RAF、 MEK和ERK三組主要蛋白構成的三級激酶級聯通路。受外界 因素刺激，上述三組蛋白由前到后依次順序激活，最終，以ERK蛋白磷酸化標 志著整個通路的活化，而活化的ERK蛋白進一步作用不同的底物，發揮對細胞 生長、代謝、增殖、分化等一系列重要的生理功能。此外，該通路也與腫瘤的 發生、病毒感染和復制等過程密切相關。2001年Pleschka等發現(如參考文獻6和7所述)，甲型流感病毒進入宿 主細胞復制時可引起RAF/MEK/ERK信號級聯通路活化。用作用于MEK1/2的 抑制劑U0126可阻斷RAF/MEK/ERK信號級聯通路活化，并使甲型流感病毒產 量下降90%以上，證明病毒的增殖依賴激活的宿主細胞RAF/MEK/ERK信號級 聯通路。根據參考文獻8-18的記載，甲型流感病毒、單純皰瘆病毒I1型(HSV-2)、 Boma病病毒、痘病毒、人類免疫缺陷病毒l型、柯薩奇病毒、乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和戊型肝炎病毒(HEV)等重要病毒的復制 都依賴RAF/MEK/ERK信號級聯通路的活化作用。
MEK蛋白在RAF/MEK/ERK信號級聯通路活化過程中起著承上啟下的關鍵 作用。MEK蛋白有MEK1和MEK2兩種亞型，二者具有不完全重疊的生理功能， 但二者在病毒復制中各自的功能尚不清楚。目前，由于缺乏分別針對MEK1或 MEK2的特異性抑制劑，所以研究該通路的病毒復制功能時，主要是通過應用 MEKl/2抑制劑(U0126或PD98059)進行的。但此類抑制劑對MEK1和MEK2 無選擇性，對二者的活性均有抑制作用，以MEKl/2抑制劑為基礎開發的抗病毒 藥物對MEK1和MEK2各自的生理功能均有影響，因此此類藥物有一定的毒副 作用。
本發明涉及的參考文獻 De Clercq D， Vercruysse J, Kongs A,et al. Efficacy of artesunate and praziquantel in Schistosoma haematobium infected schoolchildren. Acta Trop 2002， 82:61-66. Mansky L M. Mutagenic outcome of combined antiviral drug treatment during human immunodeficiency virus type 1 replication. Virology 2003, 307:116-121. Ptak RG. HIV國l regulatory proteins: targets for novel drug development-Expert Opin I鵬stig Drugs 2002， 11:1099-1115. Avruch丄MAP kinase pathways: The first twenty years. Biochimica et Biophysica Acta 2007, 1773: 1150—1160.[5] McCubrey JA, Steelman LS， Chappell WH,et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochimica et BiophysicaActa 2007, 1773: 1263—1284 Pleschka S， Wolff T， Ehrhardt C， et al. Influenza virus propagation is impaired by inhibition of the Raf/MEK/ERK signalling cascade. Nat Cell Biol 2001， 3:301-305. Ludwig S， Planz O， Pleschka S， et al. Influenza-virus-induced signaling cascades: targets for antiviral therapy Trends Mol Med 2003， 9:46-52. Smith CC, Nelson J, Aurelian L,et al. Ras-GAP binding and phosphorylation by herpes simplex virus type 2 RR1 PK ( ICP10 ) and activation of the Ras/MEK/MAPK mitogenic pathway are required for timely onset of virus growth. J Virol 2000, 74:10417-10429. Hans A, Bajramovic JJ, Syan S, et al. Persistent, noncytolytic infection of neurons by Borna disease virus interferes with ERK 1/2 signaling and abrogates BDNF-induced synaptogenesis, Faseb J 2004， 18:863-865. Planz O, Pleschka S， Ludwig S. MEK-specific inhibitor U0126 blocks spread of Borna disease vims in cultured cells. J Virol 2001， 75:4871-4877. King CS， Cooper JA, Moss B， et al. Vaccinia virus growth factor stimulates tyrosine protein kinase activity of A431 cell epidermal growth factor receptors. Mol Cell Biol 1986， 6:332-336. Jacque JM, Mann A， Enslen H， et al. Modulation of HIV-1 infectivity by MAPK, a virion隱associated kinase. Embo J 1998, 17:2607-2618. Huber M， Watson KA， Selinka HC,et al. Cleavage of RasGAP and phosphorylation of mitogen-activated protein kinase in the course of coxsackievirus B3 replication. J Virol 1999, 73:3587-3594. Chung TW, Lee YC， Kim CH. Hepatitis B viral HBx induces matrix
5metalloproteinase-9 gene expression through activation of ERK and PI-3K/AKT pathways: involvement of invasive potential. Faseb J 2004， 18:1123-1125. Nijhara R， Jana SS， Goswami SK,et al. Sustained activation of mitogen-activated protein kinases and activator protein 1 by the hepatitis B vims X protein in mouse hepatocytes in vivo. J Virol 2001, 75:10348-10358. Guo H, Feng DY, Li B, et al. cross-talk between ERK and NF-kappaB signal transduction pathways in the hepatocytes expressing hepatitis C virus nonstructural protein 3.]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2007, 32:259-263. Korkaya H, Jameel S, Gupta D, et al. The ORF3 protein of hepatitis E virus binds to Src homology 3 domains and activates MAPK. J Biol Chem 2001, 276:42389-42400
發明內容
本發明發現單獨抑制MEK1蛋白水平可抑制依賴RAF/MEK/ERK信號級聯 通路的病毒復制，但單獨抑制MEK2則不能實現抑制病毒復制的效果。基于本 發明的研究結果，本領域技術人員根據常識可知，特異性抑制細胞MEK1蛋白 的MEK1蛋白阻斷物能抑制依賴RAF/MEK/ERK信號級聯通路的病毒復制，可克 服現有抗病毒藥物易于變異、抗病毒譜窄、毒副作用大的問題。
本發明所述的MEK1蛋白阻斷物是指在不影響細胞MEK2蛋白水平及功能 的前提下，能特異性減少MEK1蛋白水平或特異性抑制MEK1蛋白的活化，從 而降低RAF/MEK/ERK信號級聯通路的活化水平，抑制病毒增殖的物質。
在本發明的優選實施方式中，MEK1蛋白阻斷物可通過抑制 RAF/MEK/ERK信號級聯通路而抑制HSV-2的復制。基于本發明的研究結果， 本領域技術人員根據常識可知，本發明所述MEK1蛋白阻斷物也可抑制其它依 賴RAF/MEK/ERK信號級聯通路增殖的病毒，如甲型流感病毒、腸道病毒71 型(EV71)、 Borna病病毒、痘病毒、人類免疫缺陷病毒1型、柯薩奇病毒，以及肝炎病毒中HBV、 HCV和HEV。
本領域技術人員根據常識可知，MEK1的特異性抑制劑也可通過抑制細胞 RAF/MEK/ERK信號級聯通路實現抑制病毒復制的效果。
在優選實施方式中，本發明提供的MEK1蛋白阻斷物是指能與人的mW/ mRNA特異性結合的并且發揮轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)作用的RNA分子。人的mRNA序列，又稱MAP2K1 (mitogen-activated protein kinase kinase 1 ) mRNA，為線性mRNA，全長2603 bp,準入號(ACCESSION )為NM—002755。
本發明還具體提供一種雙鏈小干擾RNA (siRNA)，其正義鏈核苷酸序列 為5 ， gcaacucaugguucaugcu 3 ，(如SEQ ID No: 1所示)，反義鏈核苷酸序列為 5, agcaugaaccaugaguugc 3，(如SEQ ID No: 2所示)。該小干擾RNA分子與 weH mRNA特異性結合后，通過阻斷meW mRNA表達，抑制病毒對 RAF/MEK/ERK通路活化，同時也顯著地抑制病毒的增殖。
在本發明的具體實施方式
中，該小干擾RNA分子與人meW mRNA特異性 結合后，可通過抑制RAF/MEK/ERK信號級聯通路的活化，抑制單純皰疹病毒 HSV-2的復制。
本領域技術人員根據常識可知，本發明所述的雙鏈小干擾RNA也可抑制 其它依賴RAF/MEK/ERK通路的病毒的增殖，如甲型感病毒、Borna病病毒、 痘病毒、人類免疫缺陷病毒i型、柯薩奇病毒、肝炎病毒中HBV、HCV和HEV。
本發明所述MEK1蛋白阻斷物與其他抗病毒藥物相比有其獨特的優點
① 與同時阻斷MEK1和MEK2達到的抗病毒作用相比，機制更明確，目 標更有針對性，對機體更安全；
② 可解決因病毒變異帶來的現有疫苗和藥物失效的問題； ◎是一種全新機制的抗病毒藥物，具備廣譜的抗病毒作用； ④簡單易行，容易開展，成本低。
圖1為HSV-2感染HEK 293細胞不同時間的細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)狀態；
A:正常狀態的HEK293細胞 B: HSV-2感染后16h的細胞狀態
C: HSV-2感染后48h的細胞狀態D: HSV-2感染后％h的細胞狀態 圖2為本發明實施例4轉染siRNA及病毒接種的實驗流程圖； 圖3為用不同濃度的特異性siRNA敲減MEK1、 MEK2和MEKl/2后HSV-2 (MOI=1.5)引起的細胞CPE狀態，其放大倍數為100倍； 圖4為siRNA敲減MEK1后HSV-2的UL30蛋白和gB蛋白表達的Western blot 結果圖5為siRNA敲減MEK2后HSV-2的UL30蛋白和gB蛋白表達的Western blot
結果圖6為siRNA敲減MEKl/2后HSV-2的UL30蛋白和gB蛋白表達的Western blot結果圖7顯示siRNA敲減MEK1 、 MEK2和MEKl/2后對HSV-2感染滴度的影響。
具體實施例方式
本發明發現，通過特異性抑制MEK1蛋白的水平及活化狀態，阻斷病毒對 RAF/MEK/ERK通路的激活，可顯著抑制HSV-2的復制，抑制率高達96.8%。 這一結果與我們以及其他學者用U0126 / PD98059同時阻斷MEKl/2對HSV-2 復制抑制效果是一致的。說明MEK1亞型是依賴RAF/MEK/ERK通路的病毒復 制過程中不可缺少的關鍵蛋白，特異性抑制MEK1蛋白的MEK1蛋白阻斷物具 有制備廣譜抗病毒藥物的應用前景。
應用RNAi技術敲減(knock-down ) MEK1亞型對病毒復制的抑制作用可 達到同時敲減MEKl/2蛋白具有的效果，特異性阻斷MEK2蛋白的水平，未見 到有抑制病毒復制的作用。下面結合實施例詳細闡述本發明的具體內容
以下所述，僅為本發明的優選實施例而已，并非用于限定本發明保護范圍。
實施例一HSV-2感染HEK293細胞模型的建立
1、 試劑和耗材
細胞培養液按照產品說明書配制高糖Dulbecco，s Modified Eagle Medium (DMEM)無菌培養液，分裝后4。C保存。分別配成血清濃度為10%的細胞培 養液和2%的細胞維持液，備用。
胰蛋白酶溶液使用PBS配制胰蛋白酶溶液(0.25%胰蛋白酶， 0.02%EDTA)，過濾除菌，無菌分裝后置于4"保存。
培養介質T25塑料培養瓶、6孔板、12孔板、96孔細胞培養板。
2、 主要儀器
美國NAPC0 5。/。C02培養箱，日本Olympus倒置顯微鏡，-80°。超低溫冰 箱，-20。C低溫冰箱，4。C離心機，高溫高壓濕熱滅菌器。
美國Labconco公司DELTA系列二級生物安全柜(purified class II biosafety cabinet )。病毒學和細胞培養實驗均在BSL-2水平的生物安全柜中進行。
3、 細胞系，細胞培養和傳代
HEK293細胞系為正常人胚胎腎二倍體細胞，呈貼壁生長狀態。使用細胞 培養液培養HEK 293細胞，待細胞生長融合率(confluence)或覆蓋率為80% 時，用不含血清的DMEM洗滌，胰酶消化細胞。棄去胰酶并用細胞培養液充 分吹打混勻，調整細胞濃度為1 5xl()S個/ml。然后根據要求將不同體積的細 胞懸液接種到新的細胞培養瓶或培養皿中，37。C、 5。/。C02條件下培養24 48h， 每天觀察2次，直至細胞融合率達80%左右。
4、病毒的培養、感染滴度的滴定以及細胞病變效應(CPE)的觀察(1) 病毒的培養以及感染病毒的細胞模型的制備
將凍存的HSV-2 333標準株從-8(TC冰箱中取出，冰浴緩慢融化。選擇生長 狀態良好、融合率為60~70%的HEK293細胞，棄去瓶內培養液，將病毒液按 IO倍稀釋后接種在培養瓶中的細胞上，使病毒液恰好能夠覆蓋細胞表面，放置 在培養箱中培養lh,然后補充加入4ml細胞維持液(2%FBS DMEM)繼續培 養。在接種后6h、 12h、 18h、 24h、 36h、 48h、 72h時間點觀察細胞病變情況。 出現75%細胞病變時收獲細胞和培養液。
將收獲的細胞和含病毒的上清液反復凍融3次，離心收集上清液作為病毒 原液，分裝到1.5ml離心管中，-8(TC凍存備用。
(2) 病毒感染滴度的滴定
選擇狀態良好的生長約48h的單層細胞，DMEM清洗細胞，胰酶消化，用 培養液(10%FBS DMEM)配制成104細胞/ml的細胞懸液。標記96孔細胞培 養板，將細胞懸液加入到各個微孔中，每孔0.1ml。
將細胞培養板放置到37°C， 5。/。C02的培養箱中培養約24h，使細胞融合率 達到80%。
按照10"、 10—2........ 1(T1Q比例梯度稀釋病毒原液，得到不同稀釋度的
病毒液。測定HSV-2的感染滴度，作為HSV-2在細胞中病毒復制的指標，以及 確定后續實驗中所需病毒感染的劑量。病毒感染滴度以TCIDso或感染復數 (multiplicity of infection ， MOI)表示，即凡能使50%(半數)細胞出現"CPE" 的最高病毒稀釋度，即為一個感染單位。按照Reed-Muench法(終點法)計算。
(3) 細胞病變效應(CPE)的觀察
棄去各孔中的培養液，按照標記將不同稀釋度的病毒液加入到各孔中，每 個稀釋度重復4孔，每孔0.1ml;設立陰性對照組，孔內不加病毒液只加入等體 積的維持液。然后將培養板放置到C02培養箱中培養。HSV-2感染HEK293細 胞后出現的CPE較典型，便于用普通倒置顯微鏡觀察判斷。
在培養12h、 24h、 36h、 48h、 72h和96h觀察細胞狀態，HSV-2引起的宿主細胞CPE結果如圖l所示，HSV-2感染引起HEK 293細胞出現典型細胞病 變效應，即感染的細胞腫脹、核變大，核內/胞漿內出現嗜酸性包涵體；細胞融 合形成合胞體或多核巨細胞，呈片索狀或葡萄串狀排列，最終細胞壞死、脫落、
完全溶解。
實施例二 MEK1、 MEK2特異性雙鏈siRNA的設計和制備
利用GenBank中公布的基因序列，通過BLAST工具分析和比對不同種屬 的MEK1和MEK2基因序列，選擇一段在人類基因中特有的保守序列，設計并 合成分別針對人類細胞MEK1和MEK2 mRNA的2種特異性siRNAs，命名為 siMEKl和siMEK2 (表1 )，用于研究抑制weW或/和me^基因表達對HSV-2 復制的影響。此外，在siMEKl和siMEK2的基礎上，在各自的5 ，末端改變2 個堿基，設計2個突變型siRNA,即siMutl和siMut2,作為轉染試驗中的非特 異性對照之用。
根據GenBank中基因序列(GenBank準入號NM—002755.2 )確定 siMEKl和si Mutl核苷酸序列位置。根據GenBank中mek2基因序列(準入號 NM一030662.2 )確定siMEK2和s iMut2核苷酸序列的位置。四個雙鏈siRNA 序列如下
1. siMEKl:與mRNA的1311-1149位點特異性結合 正義鏈5， gcaacucaugguucaugcu 3' (如SEQIDNo: 1所示) 反義鏈5， agcaugaaccaugaguugc 3， (如SEQIDNo: 2所示)
2. siMutl
正義鏈5， gcaacucaugguucaGUcu 3，(如SEQ ID No: 3所示) 反義鏈5， agacugaaccaugaguugc 3，(如SEQ ID No: 4所示)
3. siMEK2: 與meM mRNA的1116-1134位點特異性結合
正義鏈5' gaaggagagccucacagca 3，(如SEQ ID No: 5所示) 反義鏈5， ugcugugaggcucuccuuc 3，(如SEQ ID No: 6所示)
4. siMut2正義鏈5'gaaggagagccucacGAca3，(如SEQIDNo: 7所示)反義鏈5'ugucgugaggcucuccuuc 3，(如SEQ ID No: 8所示)
實施例三建立敲減(knock-down )mRNA和/或mRNA靶標的細胞
模型
(1)瞬時轉染實驗
于轉染前一天將HEK293細胞接種于35mm培養皿中，接種密度為1 x 105個/孔，每孔加入培養液2ml。 24小時后，細胞長至覆蓋培養皿底面積30~50%時，可準備轉染。在1.5ml離心管中配制下述溶液20 ~ 30 nM siRNA溶于200|il無血清無雙抗DMEM培養液，輕輕混勻10秒。將8~12jul轉染試劑(INTERFERin transfection reagent)加入到200 )a 1無血清無雙抗DMEM培養液中。室溫靜置10分鐘。用無血清和不含雙抗的DMEM培養液洗滌細胞后加入1 ml含有37。C預熱的10%FBS的DMEM培養液。將上述混合液加入到細胞培養皿中，繼續培養細胞至48h。
(2)細胞總蛋白提取棄去培養液，向培養細胞中加入lml預冷PBS后，用細胞刮收取細胞。4。C離心后去上清得到細胞沉淀。向沉淀中加入細胞裂解液lOOjul,使細胞充分裂解30 50min， 4°C 20000 x g離心10 min,收集上清。
(3 ) BCA法測定細胞裂解液蛋白的濃度按照PIERCE公司BCA蛋白檢測試劑盒的步驟，配制BSA標準樣品以及待測樣品，37"孵育30 min后，在570nm波長處測定吸光值。BSA標準品測定的標準曲線，在一定范圍內00570與蛋白濃度成正比。待測蛋白質的濃度經標準曲線擬合方程來計算。
(4)電泳及免疫反應
A、 制膠(5%濃縮膠，10%分離膠)；
B、 10jug蛋白樣品加入上樣緩沖液，煮沸，上樣；
C、 電泳，濃縮膠75V電壓，分離膠100V電壓；
D、 轉膜，70V, 2.5h;E、 封閉，常溫下lh;
F、 一抗反應，常溫下2h;
G、 TBST洗膜，三次，每次10min;
H、 二抗反應，2h;
I、 TBST洗膜，三次，每次5min;J、顯色、曝光。
分析結果表明，特異性siMEKl和siMEK2能夠分別明顯抑制MEK1蛋白或MEK2蛋白的表達。
實施例四特異性siRNA敲減MEK蛋白不同亞型的水平對HSV-2復制的影響應用MEK1和MEK2特異性siRNA技術分別使HEK293細胞中MEK1蛋白，或MEK2蛋白，或兩種蛋白的表達量同時減少。在此基礎上感染一定量的HSV-2后收集細胞。
利用Western blot的方法檢測細胞中RAF/MEK/ERK信號級聯通路嶙酸化ERK蛋白(p-ERKl/2 )表達量來說明RAF/MEK/ERK信號級聯通路的活化情況。同時，檢測細胞中的病毒蛋白量(HSV-2UL30蛋白和gB蛋白)來說明病毒在細胞中的復制情況，所用gB蛋白的抗體為美國EastCoast Bio公司生產的小鼠單克隆抗體，簡稱anti-HSVgB，工作液稀釋比例1: 1000;所用HSV-2 UL30蛋白的抗體為Roger Everett博士(英國University of Glasgow )惠贈，簡稱anti-HSVUL30,工作液稀釋比例1: 500。將lmg U0126溶入DMSO中配成10mM的儲液，分裝、閉光保存備用。轉染siRNA及病毒接種的實驗流程如圖2所示。
(1 )敲減MEK1 、 MEK2和MEK1/2對病毒引起細胞CPE的影響
HEK293細胞轉染siRNA48h后，用MOI= 1.5的HSV-2感染各組細胞，24h后觀察各組的CPE。
結果如圖3所示，與mock細胞相比，HSV-2感染組和30nM siMutl+2 (即siMutl和siMut2 )對照組中，細胞出現典型的CPE,約占80 ~ 90%; 20nM siMEKl
13組的病變率約為30%，而30nMsiMEKl組的未觀察到明顯病變；20nM和30nMsiMEK2組的病變率約90%和60%以上；20nM siMEKl +2組的病變率為30%，而30nM siMEKl+2 (即siMEKl和siMEK2 )實驗組未觀察到明顯病變。上述結果說明單獨抑制MEK1蛋白，或同時抑制MEK1和MEK2蛋白可明顯減少病毒引起細胞病變效應的發生，而單獨抑制MEK2蛋白則對病毒引起的細胞病變效應無抑制作用。
(2) 分別敲減MEK1、 MEK2和MEKl/2對病毒蛋白表達的影響
12孔板中接種HEK 293細胞，使其覆蓋率達到30 ~ 50%。分別將不同劑量的siRNA轉染到HEK293細胞中。細胞放置37。C培養40 h，然后更換1%細胞維持液lml/孔，再培養8h后接種HSV-2(MOK.5)， 37°C 5 % C02培養24h后，收集細胞。對于U0126對照組，HSV-2感染前lh向U0126對照組加入50pM的U0126。從相應孔中吸取0.5ml的維持液到1.5ml離心管中，然后加入相應體積的U0126，混勻后，用移液器把混合液加回孔中。同時收集上清液和細胞，分別進行病毒蛋白表達量和病毒感染滴度的測定，將收集的細胞裂解物，檢測細胞中病毒蛋白含量。
圖4為用Western blot檢測抑制MEK1后各組感染細胞中UL30和gB蛋白表達的情況。從圖中可見20nM和30nM siMEKl能有效地抑制病毒蛋白的表達，且呈劑量依賴關系。這一結果與siMEKl+2實驗組(圖6)對病毒蛋白影響的結果相似。但2種不同劑量的siMEK2對病毒的UL30和gB蛋白水平卻未見顯著地影響。上述結果說明單獨抑制MEK1蛋白可降低HSV-2的病毒蛋白含量，其效果與同時抑制MEKl/2蛋白降低病毒蛋白的情況一致。而單獨抑制MEK2蛋白則對HSV-2的病毒蛋白含量幾乎無影響，提示MEK1蛋白是HSV-2復制過程中依賴的關鍵蛋白。
(3) 敲減MEK1、 MEK2和MEKl/2后對病毒感染滴度的影響用終點滴定法檢測細胞上清液中病毒感染滴度，結果如圖7所示，與
siMutl+2組相比、20nM siMEKl組、20nM和30nM siMEK2組上清液中HSV-2感染滴度無顯著性差異(P>0.05 );而30nM siMEKl組、20nM和30nM siMEKl+2組上清液中HSV-2感染滴度則明顯降低，與siMutl+2組相比差異具有統計學意義(PO.05);此外，MEKl/2特異性抑制劑U0126組病毒感染滴度抑制情況在所有感染病毒的組中最低(P<0.05)。
上述結果說明單獨抑制MEKl蛋白可明顯降低病毒感染滴度，而單獨抑制MEK2蛋白對病毒感染滴度幾乎無影響，提示MEKl和MEK2亞型對HSV-2增殖復制作用具有顯著的差異，MEKl亞型是HSV-2復制過程中不可缺少的關鍵蛋白，而MEK2蛋白對HSV-2的復制過程無顯著影響。
綜上可知，MEKl蛋白是一個潛在有效的抗病毒藥物靶標，特異性抑制MEKl蛋白的MEK1蛋白阻斷物具有制備廣譜抗病毒藥物的應用前景，其抗病毒譜廣，可克服病毒變異，對機體更安全，其抗病毒靶標單一，作用位點更確切，可開發為一類新型抗病毒藥物。SEQUENCE LISTING
<110> 北京大學
<120> MEKl蛋白阻斷物在制備抗病毒藥物中的應用
<130> 082524
<160> 8
< 170> Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 19
<212> RNA
<213> siMEKl正義鏈
<■〉 1
gcaacucaug guucaugcu 19
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<212> 脂A
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17<formula>formula see original document page 18</formula>
權利要求
1、MEK1蛋白阻斷物在制備抗病毒藥物中的應用。
2、 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述MEK1蛋白阻斷物為MEK1 蛋白的特異性抑制劑。
3、 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述MEK1蛋白阻斷物為與 meW mRNA特異性結合的并且發揮轉錄后基因沉默作用的RNA分子。
4、 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述RNA分子為雙鏈RNA。
5、 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述RNA分子為小干擾RNA。
6、 根據權利要求1至5任一項所述的應用，其特征在于，所述病毒為依賴細 胞RAF/MEK/ERK信號通路復制的病毒。
7、 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述病毒為單純皰疹病毒ll型。
8、 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述小干擾RNA正義鏈核苷 酸序列如SEQIDNo: 1所示，反義鏈核苷酸序列如SEQ ID No: 2所示。
全文摘要
本發明涉及MEK1蛋白阻斷物及其在制備抗病毒藥物中的應用。本發明提供的MEK1蛋白阻斷物可通過特異性減少細胞內MEK1蛋白水平或特異性抑制MEK1蛋白的活化，由此抑制依賴宿主細胞RAF/MEK/ERK信號通路的病毒增殖。本發明具體提供一種MEK1蛋白阻斷物是與mek1 mRNA特異性結合的小干擾RNA分子，其正義鏈核苷酸序列如SEQ ID No1所示，反義鏈核苷酸序列如SEQ ID No2所示。本發明所述MEK1蛋白阻斷物可在不影響MEK2蛋白水平及功能的前提下，抑制依賴細胞RAF/MEK/ERK信號通路的病毒復制，抗病毒靶標單一，對機體安全，抗病毒譜廣，可克服病毒變異的問題，可開發為一類新型抗病毒藥物。
文檔編號A61K31/7088GK101474198SQ200910001250
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月16日 優先權日2009年1月16日
發明者浩 張, 彭宜紅, 羅志軍 申請人:北京大學