一種免佐劑具有防治1型糖尿病作用的免疫調節劑的制作方法

專利名稱：一種免佐劑具有防治1型糖尿病作用的免疫調節劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術、蛋白分離純化技術及醫學相關領域。更具體地，本發明涉及 融合蛋白CTB-GADIII的構建、表達及分離純化。在醫學領域中，本發明是一種免疫調節劑， 能用于預防和治療1型糖尿病。
背景技術：
糖尿病是最常見的慢性病之一。隨著人們生活水平的提高，人口老齡化以及肥胖發生率 的增加，糖尿病的發病率呈逐年上升趨勢。糖尿病分為1型和2型兩種。1型糖尿病是一種 自身免疫性疾病，表現為機體對胰腺抗原成分免疫欠耐受，針對胰腺P細胞發生自身免疫性 破壞，進而導致胰腺功能喪失，胰島素分泌減少或缺乏，出現高血糖等代謝紊亂。 一旦發病， 患者需要終生外源使用胰島素。因此1型糖尿病也曾經被稱為胰島素依賴性糖尿病或自免疫 性糖尿病。1型糖尿病約占總糖尿病患病人數的10%,多發生于青少年。成人隱匿性自身免疫 糖尿病是從貌似2型糖尿病患者中篩選出來的1型糖尿病，是l型糖尿病的亞型。因為它是 以胰島(3細胞破壞為主，從本質上屬于l型糖尿病。這種特殊類型的糖尿病患者占總患者人 數的10-15%。
目前1型糖尿病的治療研究主要集中在異種胰腺/胰島素細胞移植，胰島素及其他藥物治 療，預防以及治療疫苗，基因免疫治療以及致病基因的破譯等方面。在藥物開發方面主要的 研究成果集中于自身抗原疫苗的研究開發。 一般情況下，自身免疫性疾病可以通過免疫相關 自身抗原產生免疫耐受來中斷機體對自身抗原的免疫應答。1型糖尿病相關自身抗原有胰島 素(Ins)、谷氨酸脫羧酶(GAD)、熱休克蛋白60 (HSP60)等。GAD主要在腦組織和胰島P細 胞的分泌顆粒中表達，其主要作用是催化谷氨酸脫羧形成Y氨基丁酸(GABA),而GABA是一 種重要的神經遞質。目前確定GAD分為兩型GAD67和GAD65,分別由不同的基因編碼，其 氨基酸序列有7(U相似。上世紀90年代的研究確認，GAD65分子存在于胰島中，是1型糖尿 病的特異性靶抗原，因為針對GAD65的抗體可出現于發病前多年。l型糖尿病病人中的自身 抗體反應局限于GAD65特異性表位，只有11 / ~18%的病人具有與GAD67共同的表位。l"3 年，Kaufman等人發現，NOD小鼠體內存在針對GADM分子的自免疫性T細胞應答，由此開始 開展基于GAD65分子的藥物研究。使用基因方法發現，使P胰島細胞的GAD65表達缺失可保 護細胞免受T細胞介導的免疫攻擊，防止NOD小鼠發生1型糖尿病，即NOD小鼠的(3細胞 表達GAD65分子是發生1型糖尿病的必要條件。據報道GAD65的氨基酸序列與柯薩奇病毒蛋
3白序列相似，當病毒感染后，因病毒與P細胞具有相同抗原性而產生交叉免疫反應，針對病 毒的抗體及效應T細胞在消滅病毒的同時也破壞P細胞。2001年，研究者發現在NOD小鼠中 使用GAD質粒DNA可以達到預防1型糖尿病的作用。目前GAD65全肽作為1型糖尿病病人藥 物正在歐洲和美國進行三期臨床實驗。與此同時，對GAD65分子上各相關肽的研究也在進行 中。抗原肽特異性免疫較全肽的優勢在于可以更特異的誘導自免疫性T細胞的耐受，而對免 疫系統沒有較大影響。然而研究發現，在疾病后期，難以使用單一肽段或表位達到抑制疾病 的目的。有研究認為需要使用混合的非靶點肽在疾病后期進行治療作用，以激發未分化的T 細胞產生調節作用。也有研究發現，含有多表位的長肽基因注射給予NOD小鼠具有疾病后期 進行l型糖尿病治療的作用。
GAD65相關肽p217-236, p524-538以及p290-306都是|3細胞抗原靶決定簇。使用這些 肽可以在NOD小鼠發生胰腺炎前(4周齡以前)達到預防1型糖尿病的效果，誘導體內的Thl 型炎癥應答向Th2型保護性應答或其他的調節性應答漂移。但是在疾病中后期，單獨使用這 些肽沒有抑制疾病的作用，這是由于在已經建立的Thl炎癥應答的內環境中，單純使用單肽 注射難以產生足夠的調節作用。
使用抗原免疫預防和治療1型糖尿病的效果與以下三方面的因素相關1.抗原肽的選 擇。使用肽進行免疫治療，在疾病后期抑制疾病發展的效果與選擇的肽密切相關。研究發現 存在不同的T細胞表位肽，分別具有不同的預防、治療甚至是加劇疾病發展的能力。2.免疫 治療介入時間。使用抗原肽容易在疾病發生前期控制疾病發展，但在已經發生胰腺細胞浸潤 后，給予單一抗原肽難以在炎癥環境中誘發足夠的耐受和調節作用，因而難以達到治療作用。 3.給藥途徑。研究發現相同肽使用注射或粘膜免疫可以達到不同甚至完全相反的效果。此外 對于需長期服藥的1型糖尿病病人而言，口服是最受歡迎的給藥方式。然而對于多肽藥物而 言，由于胃腸道內存在大量肽水解酶和蛋白水解酶，口服極易被催化分解，失去藥物活性； 或發生首過效應而被肝臟代謝消除。口服耐受的產生和維持，必須盡早和長期口服大量抗原， 如果抗原的來源有限或成本過高，都將限制其廣闊的應用前景。
霍亂毒素B亞基(CTB)是一種重要的疫苗載體，它是霍亂毒素的無毒亞基，具有結合真 核細胞神經節苷脂GM1受體的功能，可以使得與它結合的抗原分子緊密結合在粘膜細胞表面， 是很好的粘膜免疫劑，能達到無創給藥的目的。同時使用CTB作為在位佐劑，可以有效降低 抗原給予量以及免疫次數，防止致命性過敏反應的發生。本發明使用CTB作為載體，將GAD65 三肽串聯連接在CTB下游，可以得到用于粘膜免疫的疫苗，其中CTB所具有的佐劑功能，可 以非特異性刺激T細胞或作用于巨噬細胞，起到呈遞特異性抗原的作用；串聯多肽可以增大表位劑量，提高藥效。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有防治人1型糖尿病作用的免疫調節劑。 本發明的另一目的是提供生產該免疫調節劑的方法。 本發明的再一 目的是提供了該免疫調節劑的免疫途徑。 本發明的最終目的是公開該免疫調節劑的用途。
在本發明的第一方面，提供了一種具有防治人1型糖尿病作用的免疫調節劑。該調節劑 采用基因工程手段，將源于GAD65的多肽基因依次插入CTB基因的下游，使串聯抗原多肽與 CTB融合表達。為敘述方便，在實施例中，本發明的串聯抗原多肽使用"GADIII"表示，含 有人GAD65 p217-236, p524-538, p290-306依次串聯。CTB是指來源于霍亂毒菌的霍亂毒素 的B亞基。將串聯多肽與CTB融合表達，能強化抗原多肽的免疫原性。將三段抗原表位與CTB 融合表達所獲得的具有防治人1型糖尿病作用的免疫調節劑表示為CTB-GADIII。
在本發明的第二方面，提供了生產該免疫調節劑的方法，其技術路線詳述如下
1. GADIII基因的設計與獲得。
GADIII是人GAD65上三段抗原肽串聯得到的多肽。三段抗原肽的氨基酸序列分別是 p217-236 EYVTLKKMREIIGWPGGSGD, p524—538 SRLSKVAPVIKAR匿， p290 — 306AALGIGTDSVILIKCDE。根據此三肽的氨基酸序列，選擇原核和真核生物均使用的密碼子， 借助于計算機設計六條寡核苷酸，分別作為一條上游引物和五條下游引物，并在上游引物1 的5'端加上限制性內切酶NheI的酶切位點，下游引物6的5，端加上終止密碼子和限制性 內切酶HindIII的酶切位點，通過聚合酶鏈式反應(PCR)法獲得GADIII串聯多肽的核苷酸 序列。
2. pET28a-CTB-GADIII重組基因工程菌的構建。
將霍亂霉素B亞基(CTB)的DNA序列插入pET28a質粒中，得到重組質粒pET28a-CTB由 我們實驗室保存。GADIII基因經NheI和HindIII切割后插入經同樣酶切割的pET28a-CTB質 粒中，組成融合表達的重組質粒pET28a-CTB-GADin,重組質粒轉化大腸桿菌BL21,獲得重 組基因工程菌。
3. 包涵體形式表達融合蛋白。 '
在37 'C下培養含有表達融合蛋白的重組質粒的重組基因工程菌，用終濃度為3~ 15mmol/L的ct-乳糖誘導表達融合蛋白；
4. 融合蛋白的純化。將所述重組基因工程菌的菌體裂解后離心收集含有融合蛋白的包涵體沉淀、用包涵體洗 滌液和0. 5-2mol/L尿素溶液洗去部分雜質、再用6-8mol/L尿素溶液變性溶解包涵體、經離 子交換柱層析純化、緩沖液復性、分子篩SephadexG100柱層析，得到純化的CTB-GADIII融 合蛋白。
在本發明的第三方面是提供了該免疫調節劑的免疫途徑。利用鼻粘膜給藥進行粘膜免疫 簡便易行，藥物經鼻粘膜部豐富的毛細血管吸收后直接進入體循環，使藥物不良反應發生幾 率大為降低。通過鼻粘膜給藥可免受胃腸道中酶的破壞和肝臟對藥物的首過清除效應，有利 于提高生物利用度和血藥濃度，極大減少藥物用量。采用黏膜方式給藥，誘使機體重新建立 對這些表位的免疫耐受，從而抑制了可能發生的自身免疫攻擊。
在本發明的第四方面是該免疫調節劑的用途。如上所述，此免疫調節劑能用于防治人1 型糖尿病的發生。我們選用國際上通用的1型糖尿病動物模型N0D( nonobese diabetic mouse, N0D)小鼠，隨機分成三組，每組10只，分別是CTB-GADIII融合蛋白鼻腔粘膜免疫組，CTB 蛋白鼻腔粘膜免疫組，PBS空白對照組。分別于8周齡、IO周齡、12周齡3次免疫，使用PBS 溶解蛋白，不加其他佐劑，每次免疫劑量為0. OOluraol/只。每月測定小鼠體內血糖水平。 結果顯示，CTB-GADIII可以降低機體對GADIII的體液免疫，顯著推遲NOD小鼠糖尿病的發 生，并顯著降低糖尿病發病率。


圖l載體質粒pET28a-CTB (A)以及pET28a-CTB-GADIII (B)結構圖。 圖2重組質粒pET28a-CTB-GADIII C端部分基因測序結果。
圖3 SDS-PAGE電泳顯示重組質粒pET28a-CTB-GADIII的融合表達。1.大腸桿菌BL21細胞全 蛋白；2大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；3.載荷pET28a-CTB-GADIII質粒的大腸 桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；4.標準分子量蛋白。
圖4 SDS-PAGE電泳顯示純化的CTB-GADIII蛋白。1. CTB-GADIII單體蛋白；2. CTB-GADIII五 聚體蛋白；3.標準分子量蛋白。
圖5各組NOD小鼠免疫后血清抗GADIII抗體分析。每月從小鼠眼底叢靜脈取血，使用 rhVEGF-GADIII融合蛋白作為包被抗原，測定抗GADIII抗體滴度。
圖6各組NOD小鼠免疫后不同周齡發病率統計。每四周一次從小鼠眼底叢靜脈取血用于血糖 分析。兩次連續測定結果〉11. lmmol/L判定為發病。結果顯示CTB-GADI11融合蛋白鼻腔粘 膜免疫可以顯著降低NOD小鼠發病率。
具體實施例方式
6以下結合附圖對本發明的技術方案進一步說明。
(1) 菌株，細胞系和質粒
宿主菌E. coli BL21 (Escherichia coli BL21)是基因工程常用工具菌種，在與基因
工程研究有關的實驗室一般都有保存。 質粒pET28a購自Novagen公司。
質粒pET28a-CTB由本實驗室構建并保存，CTB蛋白、rhVEGF-GADIII融合蛋白也由本實 驗室分離純化。
(2) 酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、質粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產品； PCR回收試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產品。
(3) 培養基LB培養基，配方見參考文獻Salmbrook J，Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spr ing Harbor Laboratory Press, 1989。
(4) CM52纖維素為Whatman公司產品，Sephadex G100為Pharmacia Biotech公司產品。 (5 )辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗為武漢博士德公司產品。
(6) 3、 3，、 5、 5，-四甲基聯苯胺(TMB)、 二氨基聯苯胺(DAB )、過氧化氫脲和牛血清白 蛋白(BSA)為美國西格瑪(Sigma)公司產品。
(7) 96孔酶標板為美國康寧(Corning)公司產品。
(8) 測定血清中血糖濃度的儀器為Hitachi Automatic Analyzer (Model-7150， Tokyo, Ja叩an)。
(9) 考馬斯亮藍試劑盒為南京建成生物工程研究所產品。 方法
分子生物學搡作方法
質粒提取、聚合酶鏈式反應、限制性核酸內切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉化大 腸桿菌；在基因工程研究領域，這些都是常規操作方法，參見Salmbrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989， pp, 16-340。
重組蛋白表達量的測定參見Salmbrook J, FristshEF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，方法進行。
實施例1: CTB-GADIII多肽基因的設計、合成和克隆根據CTB基因和GAD65抗原肽基因的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，借助于計 算機設計六條寡核苷酸片段，首先通過PCR法合成GADIII多肽基因，將該基因克隆到 pET28a-CTB基因的下游，轉化大腸桿菌得到重組質粒命名pET28a-CTB-GADIII。具體方法如 下
六條寡核苷酸
Pl: 5'-AAAGCTAGCGGTGGTGAATACGTTACTCTGAAAAAAATGCGTGAAATCATCGGTT-3' P2:5'-AAAAAGCTTAGTCACCTGAACCACCCGGCCAACCGATGATTTCACGCATT-3' P3:5'-GATAACCGGAGCAACTTTAGACAGACGTGAGTCACCTGAACCACCCGGCCAA-3' P4:5'-AAAAAGCTTACATCATACGAGCTTTGATAACCGGAGCAACTTTAGAC-3' P5: 5'-AACGGAGTCAGTACCGATACCCAGAGCAGCCATCATACGAGCTTTGA丁AA-3' P6: 5'-AAAAAGCTTATTCGTCGCATTTGATTAAGATAACGGAGTCAGTACCGATAC-3'
上游引物Pl引入NheI酶切位點，下游引物P6引入HindIII酶切位點。 通過PCR獲得GADI多肽基因將寡核苷酸片段Pl和P2按一定比例混合，二者互為引物 和模板，94 。C 1 min, 53 °C 1 min， 72 °C 30 sec,共30個循環；72 'C, 10 min。將擴 增獲得的PCR產物經試劑盒純化后作為模板，使用引物l和引物3作為上下游引物，94 °C 1 min, 57 °C 1 min, 72 'C 30 sec,共30個循環；72 °C ， 10min。通過PCR獲得GADII (1) 基因片段，再使用經試劑盒純化后的GADII (l)作為模板，引物1和引物4作為上下游引物， 94 °C 1 min， 57 °C 1 min, 72 °C 30 sec,共30個循環；72 °C, 10 min。 PCR獲得GADII 基因片段。使用純化后的GADII基因片段為模板，引物1和引物5作為上下游引物，94 °C 1 min， 60 °C 1 min， 72 °C 30 sec，共30個循環；72 °C, 10 min,獲得GADIII (1)基因 片段。最后使用GADIII (1)基因片段作為模板，引物1和引物6作為上下游模板，94 'C 1 min, 59 °C 1 min, 72 °C 30 see,共30個循環；72 °C ， 10 min。最終獲得GADIII基因片 段。
_將擴增所得PCR產物經PCR純化試劑盒純化后用限制性內切酶NheI和Hindin消化，與 用NheI和HindIII消化的pET28a-CTB質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21,所獲得的轉 化子中含CTB-GADIII融合蛋白基因的重組質粒pET28a-CTB-GADin。結構框架見圖1, C端 部分基因序列見圖2。
實施例2: CTB-GADIII基因在大腸桿菌中的表達
' 將重組質粒pET28a-CTB-GADIII轉化大腸桿菌BL21。從生長有不同轉化子平板上挑取單 菌落接種含有50ng/ml卡那霉素LB液體培養基，于37 。C培養4小時后，加入終濃度為5mmol/L的ot -乳糖誘導大腸桿菌表達T7RNA聚合酶，繼續培養從而表達融合蛋白CTB-GADI11 。 誘導后每隔l小時取少量菌液，離心回收菌體，SDS-PAGE電泳再經薄層掃描顯示已經實現了 CTB-GADIII多肽基因的融合表達。融合蛋白在誘導6小時達到穩定的最大表達量，融合蛋白 占細菌總蛋白的50%以上，結果見圖3. 實施例3:重組蛋白CTB-GADIII的分離純化
使用含1% Triton的PBS緩沖液將包涵體洗滌3次。將初步純化的融合蛋白CTB-GADIII 溶解于含有8 mol/L尿素的0. lmol/L Tris緩沖溶液中(pH 8. 9 )。使用CM52陽離子交換樹 脂分離純化變性蛋白。用含有8mol/L尿素的Tris/NaCl梯度洗脫，分段收集進行SDS-PAGE 電泳檢測，CTB-GADIII在120-150隨olNaCl處的洗脫峰中。將得到的純化蛋白溶解在含有0.1 mol/L Tris-HC1, pH 8.9， 0.4 mol/L NaCl和2 mmol/1 EDTA的復性緩沖液中，37 'C過夜 孵育復性。復性蛋白進一步通過分子篩分離單體和五聚體。用SDS-PAGE電泳檢查其純度，見 圖4。
實施例4: CTB-GADIII重組蛋白的藥效學研究
選用8周齡雌性N0D小鼠，隨機分為3組，每組10只，分別是CTB-GADIII鼻腔粘膜免疫 組、CTB蛋白對照組和PBS空白對照組。小鼠分別在8、 10、 12周齡滴鼻給予PBS稀釋的蛋 白，每次每只小鼠的給藥劑量為O.OOlnmol。三次免疫結束后，每月從小鼠眼眶后靜脈叢取 血一次，4000 rpra, lOmin離心，取血清，5小時內用全自動生化分析儀(Hitachi, mode卜7150) 測定血糖的濃度。兩次連續測定血糖濃度>11. 1 mrnol/L視為發生糖尿病。結果顯示 CTB-GADIII蛋白鼻腔粘膜免疫組可顯著降低NOD小鼠糖尿病發病率。各組發病率見圖5。 實施例5:抗GADIII抗體的ELISA檢測
使用本實驗室制備的rhVEGF-GADI II蛋白作為包被抗原包被9 6孔酶標板。r hVEGF-G AD 111 溶于包被稀釋液(0. 05mmmol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，PH 9. 6 ), 1 |ag/nl,每孔加入IOO pi, 4 。C包被過夜。棄去包被液，加入5。/。BSA (pH 7.4 PBS配制)封閉液，4 'C滿孔封閉過 夜。棄去封閉液，每孔加入1:100 5% BSA封閉液稀釋的小鼠血清100 |_U, 37 。C孵育1 h。 棄去血清，每孔用PBST和自來水間隔洗滌，每次3min,共洗滌6次。洗滌后，每孔加入用 5%BSA封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG 二抗100 pi,稀釋倍數為1: 20000, 37 'C孵育lh。棄去酶標二抗液，每孔用PBST和自來水間隔洗滌，每次3min,共洗滌6次。 洗滌后，每孔加入IOO |al底物液(過氧化氫脲和3，3\,5,5、-四甲基聯苯胺(TMB)溶液)。 37 。C反應30 min后，加入2 mol/L 1^04終止反應，用酶標儀在450 nm波長下測定每孔的 光密度值。結果顯示CTB-GADIII給藥組小鼠在給藥后13周齡開始，抗GADIII抗體滴度顯著
9降低于PBS組和CTB對照組，并且持續至觀測結東。所得結果見圖6。
除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技 術方案，均落在本發明要求的保護范圍。SEQUENCE LISTING <110>中國藥科大學
<120> —種免佐劑具有防治I型糖尿病作用的免疫調節劑 <130>免疫調節劑 <160〉 7
<170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 160 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> CTB-GADIII <400> 1
Met Thr Pro Gin Asn lie Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr 15 10 15
Gin lie Tyr Thr Leu Asn Asp Lys lie Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu 20 25 30Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala lie lie Thr Phe Lys Asn Gly Ala lie 35 40 45
Phe Gin Val Glu Val Pro Gly Ser Gin His lie Asp Ser Gin Lys Lys 50 55 60
Ala lie Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg lie Ala Tyr Leu Thr Glu 65 70 75 80
Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala 90 95
Met Ala Asn Ala Ser Gly Gly Glu Tyr Val Thr 105 110
Arg Glu lie lie Gly Trp Pro 120
Lys Val Ala Pro Val lie Lys
Ala Lys Val Glu Lys 85
lie Ala Ala lie Ser 100
Leu Lys Lys Met 115
Ser Arg Leu Ser 130
135
Gly Gly Ser Gly Asp 125
Ala Arg Met Met Ala 140
Ala Leu Gly lie Gly Thr Asp Ser Val lie Leu lie Lys Cys Asp Glu 145 150 155 160<210> 2
<211> 55
<212> ■
<213〉 Artificial Sequence
<220>
<223> Pl
<400> 2
aaagctagcg gtggtgaata cgttactctg aaaaaaatgc gtgaaatcat cggtt 55
<210〉 3
<211> 50
<212> 飄
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2
<400> 3
aaaaagctta gtcacctgaa ccacccggcc aaccg"gat ttcacgcatt 50
<210> 4 <211> 52 <212> 醒
<213> Artificial Sequence<220>
<223> P3
<400> 4
gataaccgga gcaactttag acagacgtga gtcacctgaa ccacccggcc aa 52
<210> 5
<211〉 47
<212〉 DNA
<213〉 Artificial Sequence
<220>
<223〉 P4
<400> 5
aaaaagctta catcatacga gctttgataa ccggagcaac tttagac 47
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220〉
<223> P5
<楊> 6
aacggagtca gtaccgatac ccagagcagc catcatacgs gctttgataa 50
14<210〉 7
<211> 51
<212〉 DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223〉 P6
<400〉 7 aaaaagctta ttcgtcgcat ttgattaaga taacggagtc agtaccgata c 5權利要求
1.一種免佐劑具有防治1型糖尿病作用的免疫調節劑，其特征在于該免疫調節劑是將源于人谷氨酸脫羧酶65的抗原多肽p217-236，p524-538，p290-306依次串聯后與霍亂毒素B亞基融合形成的融合蛋白。
2. 按照權利要求1所述的免疫調節劑，其特征在于該免疫調節劑中含有三段源于人谷氨酸脫 羧酶65的抗原多肽，p217-236的氨基酸序列為EYVTLKKMREIIGWPGGSGD, p524-538的氨 基酸序列為SRLSKVAPVIKAR應，p290-306的氨基酸序列為AALGIGTDSVILIKCDE。
3. 按照權利要求1所述的免疫調節劑，其特征在于該免疫調節劑具有SEQ ID NO. 1的氨基酸 序列。
4. 按照權利要求l所述的免疫調節劑，其結構可以表示為CTB-GADIII,其特征在于CTB攜 帶有三個人谷氨酸脫羧酶65的抗原多肽。
5. —種免佐劑具有防治1型糖尿病作用的免疫調節劑的制備方法，包括用化學合成法和PCR 法合成三段源于GAD65的抗原多肽p217-236,p524-538，p290-236和CTB的編碼序列腿, 將這些DNA分步插入表達載體，在大腸桿菌中表達出包涵體蛋白，經多步洗滌、陽離子交 換樹脂CM52和分子篩S印hdex-G100純化，得到防治1型糖尿病的免疫調節劑。
6. 按照權利要求6所述得到的免疫調節劑，其特征在于不需要添加佐劑，也不需要將抗原多 肽與載體化學偶聯，通過粘膜免疫途徑能誘發機體產生特異免疫應答。
7. 按照權利要求6所述得到的免疫調節劑，其特征在于能顯著降低NOD小鼠糖尿病的發生，能夠起到防治1型糖尿病的作用。
8. 根據權利要求6所述得到的免疫調節劑，其特征在于可與藥物載體或藥物活性成分組合制 成藥物組合物。
全文摘要
本發明提供了一種能用于預防和治療1型糖尿病的免疫調節劑。單一抗原多肽難以在機體已經發生自免疫攻擊后重建免疫耐受，阻斷自免疫攻擊。將三個抗原表位多肽基因(源于人谷氨酸脫羧酶65分子)依次串聯后連接到霍亂毒素B亞基基因下游，實現了串聯抗原表位多肽與CTB的融合表達。所得到的融合蛋白不需要添加佐劑，通過粘膜免疫途徑可激發機體產生針對該串聯抗原多肽的體液免疫耐受，顯著降低NOD小鼠糖尿病的發生，能夠用于防治1型糖尿病。
文檔編號A61K39/39GK101574517SQ200910025839
公開日2009年11月11日 申請日期2009年3月11日 優先權日2009年3月11日
發明者劉景晶, 潔 吳, 孫云霄, 曹榮月, 李建平, 李泰明, 潔 楊, 熊琪琰, 王華倩, 亮 金 申請人:中國藥科大學