專利名稱：普洱茶免疫佐劑及其在流感疫苗中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種普洱茶免疫佐劑，尤其涉及普洱茶提取物在制備免疫佐劑，特別是流感疫苗免疫佐劑中的應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
普洱茶原產于我國云南思茅及西雙版納一帶，是一種歷史名茶，其以云南大葉種茶樹的鮮葉為原料進行加工，按發酵方法不同分為生茶和熟茶，即將云南大葉種茶樹的鮮茶葉采摘后，經曬青得到毛茶，再經緩慢的自然發酵而成的生茶，或者經人工促成發酵的熟茶。普洱茶有散茶以及壓制的成型茶，并具有下列獨特的品質特點:熟茶色澤為褐紅，湯色褐紅、清亮,并有獨特的陳香氣味,葉底為褐紅色；生茶為灰白色,茶湯帶褐色,并有清香氣味，醇厚回甜，普洱茶迄今已有1700多年的歷史。對于普洱茶的功效，歷史上也多有記載，如公元1765年，趙學敏《本草綱目拾遺》中說:普洱茶膏，黑如漆，醒酒第一，消食化痰，清胃生津，功力尤大也；《木部》中記載:普洱茶膏能治百病，如肚脹、受寒，用姜湯發散，出汗即可愈，口破喉燥，受熱疼痛，用五分噙口過夜即愈。公元1768年，清王昶撰《滇行目錄》中有“普洱茶味沉刻，可療疾”的說法。公元1897年，陳宗海撰《思茅廳采訪》記載:普洱茶能幫助消化，驅散寒冷，有解毒作用。長期的飲用實踐證明，普洱茶具有消食解毒，理氣去脹，清熱化痰，驅風醒酒，治痢抑菌等功效。現代醫學研究證實:普洱茶確有降血脂、降血糖、降血壓、健齒護牙、提高機體免疫力、抗癌及防治心血管疾病的功效。此外，普洱茶減肥瘦身的功效也引起了人們的廣泛關注。張冬英等利用高通量篩選法研究發現:普洱茶乙醇提取物有潛在的降血脂、降血糖的可能性。近年來的研究表明，普洱茶提取物表現了很強的生物活性，普洱茶水提物表現出了明顯的抗氧化活性，能有效抑制脂質體和非脂質體的氧化損傷。普洱茶提取物還表現出良好的抗基因毒性、抗病毒以及抗菌活性。流感是由流感病毒引起的一種可造成大規模流行的急性呼吸道傳染病，它的特點是短期內爆發，然后迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴發流行及散發，發病率高并伴有一定的死亡率，一 旦流感疫情爆發，將會對人類的生命健康帶來巨大的威脅。預防流感疫情爆發的最主要也是最有效的手段就是接種流感疫苗。目前被批準的流感疫苗主要有兩大類:滅活流感疫苗和減毒流感活疫苗，滅活流感疫苗又分為:全病毒滅活疫苗、滅活病毒裂解產物疫苗和亞單位疫苗，目前被廣泛使用的是三價的無佐劑滅活裂解疫苗。由于流感病毒變異很快，通常每年的流行類型都有所不同，生產企業一般都在世界衛生組織(WHO)指導下選擇流感病毒毒株進行疫苗生產，每年接種最新的流感疫苗才能達到預防的效果。一旦流感病毒變異造成大規模流行或者是世界性流行，疫苗需求量必將猛增，但目前由于受流感疫苗生產工藝的限制，短時間內難于提供大規模流行所需的足量疫苗，因此，應用免疫佐劑，減少疫苗用量并提高免疫效果，是應對大規模流行期間疫苗量不足的途徑之一。
佐劑是一種加入疫苗后能顯著增強抗原的免疫原性，而本身無免疫原性的物質，將其應用于流感疫苗，能顯著增強疫苗的免疫效果，減少抗原的用量，從而有利于流感疫苗的生產效率的提高與生產成本的降低，更好的保護易感人群，以應對突然爆發的流感疫情，佐劑在新型流感疫苗的研究與開發中具有極為重要的作用。目前被批準應用于流感疫苗的佐劑主要有鋁佐劑和MF59等。但事實上鋁佐劑對蛋白亞單位疫苗誘導抗體產生的能力較弱，不能有效地誘導免疫應答，其不能誘導產生Thl型反應，干擾細胞免疫，并阻斷CD8+CTL的激活，使得疫苗的免疫保護作用不全面，不持久，在某些情況下還會產生與過敏反應有關的IgE，使機體產生不良反應。MF59雖然是一種較為有效地流感疫苗佐劑，但是其在增加免疫原性的同時也增加了反應原性，在成年人中出現了局部疼痛、發熱、紅斑、硬結、肌痛等癥狀的增加。另外，一些新型佐劑正處于研發中，像多聚脫氧核苷酸類、抗菌肽類、細胞因子類、多糖類佐劑，但進展都比較緩慢。隨著禽流感疫情在世界各地的爆發，并產生了較高的死亡率，研究出一種新型的疫苗佐劑，從而有效的提高疫苗的安全性和免疫原性，提高疫苗的生產效率，已成為更好的保護人類生命健康的一種需要。經系統查閱文獻和專利，目前未發現關于普洱茶提取物應用于免疫佐劑研究的報道。
發明內容
為解決目前免疫佐劑單一，副作用難以避免，疫苗生產供應量有限，難以滿足疫情爆發時急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效時間慢等諸多問題，本發明旨在提供一種能有效提高疫苗免疫效果，降低疫苗抗原用量的普洱茶免疫佐劑。本發明的另一個目的在于提供普洱茶提取物在制備免疫佐劑中的應用。本發明的又一個目的在于提供一種普洱茶免疫佐劑在制備流感疫苗中的應用。
本發明提供的一種普洱茶免疫佐劑由下列質量比的組分組成:
普洱茶提取物0.05 100%
載體O 99.95%。所述載體由下列質量比的組分組成:
乳化劑I 50%
助乳化劑I 50%
油相I 50%
水相10 97%。所述乳化劑為常規的Tween20或聚氧乙烯蓖麻油中的一種，或者為質量混合比為3: 2 2: 3的常規Tween20與Span80的混合物，或者為質量混合比為3: 2 2: 3的常規聚氧乙烯蓖麻油與Span80的混合物。所述助乳化劑為常規的1，2_丙二醇或聚乙二醇400或無水乙醇中的一種。所述油相為常規的液體石蠟或白油或注射用大豆油中的一種。所述水相為注射用水或者含有藥物或疫苗成分的注射用水溶液。本發明提供的普洱茶免疫佐劑，優選下列質量比:
普洱茶提取物0.1 100%載體O 99.9%。本發明所述的普洱茶免疫佐劑在制備流感疫苗中的應用，其特征在于:普洱茶免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為300:1 150000:1，其中，所述普洱茶免疫佐劑由下列質量比的組分組成:
普洱茶提取物0.05 100%
載體O 99.95%。
所述普洱茶提取物為市購產品。所述普洱茶提取物為普洱茶乙醇提取物，或者為普洱茶水提取物，分別經以下方法提取:
普洱茶乙醇提取物的制備:取粉碎的普洱茶粉，置于容器內，用乙醇冷浸或溫浸提取，或者加熱回流提取，過濾，取濾液，對濾液進行減壓回收乙醇，余下濾液經濃縮干燥，得浸膏；其中，每次提取時，乙醇的質量濃度為75 99.7%，乙醇加入量是普洱茶粉質量的5 50倍，冷浸是在室溫下浸泡I 10天，溫浸是在40 60°C溫度下浸泡I 2小時，提取次數為I 3次；加熱回流提取是在30 75°C溫度下，回流提取I 3次，每次30 150分鐘。普洱茶水提取物的制備:取粉碎的普洱茶粉，置于容器內，用蒸餾水冷浸或溫浸提取，或用加熱煎煮的方法提取，過濾，取濾液，進行常規濃縮干燥，得浸膏。其中，每次提取時，蒸餾水的加入量是普洱茶粉質量的5 100倍，冷浸是在室溫下浸泡I 10天，溫浸是在40 60°C溫度下浸泡I 2小時，提取次數為I 3次；加熱煎煮是按常規方法進行，提取次數I 3次，每次煎煮60 300分鐘。本發明提供 的普洱茶佐劑與傳統的氫氧化鋁佐劑相比，具有以下一些優點:
I)普洱茶是一種日常飲用品，在以往的研究中展現出了多種保健功效，將其作為流感疫苗佐劑應用，安全性高、副作用低。在研究中發現，用含普洱茶提取物的流感疫苗注射小鼠，小鼠未見全身不良反應，活動及飲水進食未見明顯影響，而用含氫氧化鋁佐劑的流感疫苗注射小鼠，則偶見注射局部出現紅斑、腫脹結節的現象。2)用普洱茶提取物制備的佐劑用在流感疫苗上，不僅佐劑效果明顯，而且疫苗質量容易控制；而以氫氧化鋁為佐劑制備的流感疫苗，在制備和存儲過程中，影響因素較多，對疫苗的質量較難控制。3)用普洱茶提取物作為流感疫苗佐劑，展現出了良好的有效性，能夠更好的提高抗原的免疫原性，增強免疫效果。4)普洱茶提取物制備方法簡便，其材料來源廣泛，較為經濟、環保。
圖1為不同接種組在56天內的血凝抑制抗體效價變化；
圖2為不同接種組在56天內的血凝抑制抗體效價變化；
圖3為不同接種組在接種后7天內的體重增長情況。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明，但并不以此來限定本發明。
本發明實施例所用的流感病毒疫苗原液為市購產品，并且是按照《中國藥典》三部2010版中所述流感病毒裂解疫苗制造方法制備的，按照《中國藥典》三部2010版所述各項檢定標準檢驗合格的流感病毒疫苗原液。本發明實施例中未特別指明的組分均為市購產品，所用設備或儀器均是常規的。實施例1
普洱茶乙醇提取物的制備:取普洱茶50g，粉碎成粉，置于容器中，加入500ml質量濃度為95%的乙醇,按常規進行加熱回流提取，其中，每次加熱溫度為50 °C,回流時間為60分鐘，提取次數為2次，過濾后，對濾液進行減壓回收乙醇后，余下濾液經常規濃縮干燥后，得浸膏。實施例2
普洱茶水提取物的制備:取普洱茶100g，粉碎成粉，置于容器中，加入2000ml蒸餾水按常規進行加熱煎煮 提取，其中，每次煎煮時間為4小時，提取次數為3次，過濾，合并濾液后，對濾液進行常規濃縮干燥，得浸膏。實施例3 納米乳載體的制備:
1)按下列質量比備料:Ig的聚氧乙烯蓖麻油，Ig的司盤80，1.5g的1，2-丙二醇，
0.5g的注射用大豆油，0.6g的注射用水；
2)向混合攪拌瓶內加入Ig聚氧乙烯蓖麻油，Ig司盤80,1.5g 1,2-丙二醇，0.5g注射用大豆油，室溫條件下，持續攪拌2分鐘，混合均勻得混合物；
3)在上述2)的混合物中緩慢滴入0.6g注射用水，同時在轉速為400轉/分鐘，室溫下，攪拌混合物至液體為透明，得到納米乳載體；
4)對3)制得的納米乳劑進行如下檢測:1.經馬爾文粒徑檢測儀檢測，平均粒徑
31.83nm,合格；2.經IOOOOrpm, 30min離心分離，納米乳劑體系不分層,合格；3.經4°C,室溫，37°C放置6個月，納米乳劑體系無變化，合格。實施例4 納米乳載體的制備:
1)按下列質量比備料:0.8g Tween20, 0.8g司盤80,L6g 1,2-丙二醇，0.8g液體石蠟，30g注射用水；
2)向混合攪拌瓶內加入0.8g Tween20,0.8g司盤80,1.6g I, 2-丙二醇，0.8g液體石蠟，室溫條件下，持續攪拌2分鐘，混合均勻得混合物；
3)在上述2)的混合物中緩慢滴入30g注射用水，同時在轉速為400轉/分鐘，室溫下，攪拌混合物至液體為透明，得到納米乳劑；
4)對3)制得的納米乳劑進行如下檢測:1.經馬爾文粒徑檢測儀檢測，平均粒徑24.15nm,合格；2.經IOOOOrpm, 30min離心分離，納米乳劑體系不分層,合格；3.經4°C,室溫，37°C放置6個月，納米乳劑體系無變化，合格。實施例5
普洱茶免疫佐劑的制備 按下列質量比備料:
市購的普洱茶提取物0.05g實施例3的納米乳載體99.95g
經過下列方法制備:先用適量醫用注射用水溶解市購的普洱茶提取物0.05g,再混合入實施例3的納米乳載體99.95g，得普洱茶免疫佐劑。實施例6
普洱茶免疫佐劑的制備 按下列質量比備料:
實施例1的普洱茶提取物 50g 實施例3的納米乳載體50g
經過下列方法制備:先用適量醫用注射用水溶解市購的普洱茶提取物50g，再混合入實施例3的納米乳載體50g，得普洱茶免疫佐劑。實施例7
普洱茶免疫佐劑的制備 按下列質量比備料:
實施例2的普洱茶提取物 80g 實施例4的納米乳載體20g
經過下列方法制備:先用適量醫用注射用水溶解市購的普洱茶提取物80g，再混合入實施例4的納米乳載體20g，得普洱茶免疫佐劑。實施例8
含有普洱茶提取物免疫佐劑的流感疫苗的制備
1)稱取實施例2的普洱茶提取物34mg，溶于30mlH3N2流感病毒抗原稀釋液中，備用；
2)取實施例4的未加水的乳劑混合物，在攪拌狀態下緩慢滴入I)的含普洱茶提取物的流感疫苗30ml，同時維持轉速在400轉/分鐘，攪拌至溶液為透明褐色液體，得到以普洱茶提取物、納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗(血凝素含量為6.0ug/ml)，其中:普洱茶提取物質量比為0.84%，載體質量比為99.16% ;普洱茶提取物納米乳劑免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為:19775:1。實施例9
動物實驗用樣品的制備及免疫 O制備下列不同的佐劑或溶液:
a)取濃度為16.31 mg/ml的氫氧化鋁0.472ml，加入生理鹽水至6.22ml，備用；
b)6.692ml生理鹽水，備用；
c)IOml生理鹽水,備用；
2)制備下列不同的疫苗:
A)取H3N2流感病毒抗原稀釋液Iml與a)溶液混合，得到含有氫氧化鋁佐劑的流感病毒疫苗樣品A。B)取H3N2流感病毒抗原稀釋液Iml與b)溶液混合，得到無佐劑的流感疫苗樣品B0C)為不加疫苗抗原的生理鹽水對照組C。所配置的上述A、B疫苗中血凝素含量均為6ug/ml。3)免疫接種及檢測:用實施例8的含有普洱茶提取物免疫佐劑的流感疫苗及上述步驟2)所配的樣品A、B、C分別免疫標準體重雌性昆明種小鼠，每組5只，每只肌肉注射200ul，第I天接種一針，第21天補種一針。于首次免疫后7天、14天、21天、28天、35天、42天、56天取尾血,分離血清測定血凝抑制效價，結果見附圖1。實施例10
含普洱茶提取物佐劑的流感疫苗的制備
O稱取實施例2的普洱茶提取物4.6mg,溶于0.6mlH3N2流感病毒抗原稀釋液中，備
用；
2)取實施例3的納米乳載體，在攪拌狀態下緩慢滴入I)的含普洱茶提取物的流感疫苗
0.6ml,同時維持轉速在400轉/分鐘，攪拌至溶液為透明褐色液體，得到以普洱茶提取物、納米乳載體為佐劑的流感病毒疫苗(血凝素含量為6.0ug/ml)，其中:普洱茶提取物質量比為0.11%，載體質量比為99.89% ;普洱茶提取物納米乳劑免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為:145094:1。實施例11
動物實驗用品的制備及免疫 O制備下列不同的佐劑或溶液:
a)取實施例2的普洱茶提取物15.38 mg，溶于6.69ml生理鹽水，備用；
b)取濃度為16.31 mg/ml的氫氧化鋁0.472ml，加入生理鹽水至6.22ml，備用；
c)6.692ml生理鹽水，備用；
d)IOml生理鹽水，備用；
2)制備下列不同的疫苗:
A)取H3N2流感病毒抗原稀釋液Iml與a)溶液混合，得到含普洱茶提取物的流感疫苗樣品A ；
B)取H3N2流感病毒抗原稀釋液Iml與b)溶液混合，得到含有氫氧化鋁佐劑的流感病毒疫苗樣品B ；
C)取H3N2流感病毒抗原稀釋液Iml與c)溶液混合，得到無佐劑的流感疫苗樣品C； C)為不加疫苗抗原的生理鹽水對照組D。所配置的上述A、B、C疫苗中血凝素含量均為6ug/ml，其中普洱茶提取物佐劑流感疫苗樣品A中:普洱茶提取物的質量比為100%，普洱茶提取物免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為333:1。3)免疫接種及檢測:
用上述2)所配的A、B、C、D四個不同的樣品分別免疫標準體重雌性昆明種小鼠，每組5只，每只肌肉注射200ul，第I天接種一針，第21天補種一針。于首次免疫后7天、14天、21天、28天、35天、42天、56天取尾血,分離血清測定血凝抑制效價，結果見附圖2。
于初免之日起7d內對各組小鼠進行體重測量，并對7天內各組平均增長的體重進行計算，所測結果顯示普洱茶提取物免疫佐劑組小鼠體重增長正常，與其他組相比，體重增長無顯著性差異，具體結果見附圖3。
權利要求
1.種普洱茶免疫佐劑，其特征在于由下列質量比的組分組成: 普洱茶提取物0.05 100% 載體O 99.95%。
2.權利要求1所述的普洱茶免疫佐劑，其特征在于所述載體由下列質量比的組分組成: 乳化劑I 50% 助乳化劑I 50%油相I 50% 水相10 97%。
3.權利要求2所述的普洱茶免疫佐劑，其特征在于所述乳化劑為常規的TWeen20或聚氧乙烯蓖麻油中的一種，或者為質量混合比為3: 2 2: 3的常規Tween20與Span80的混合物，或者為質量混合比為3: 2 2: 3的常規聚氧乙烯蓖麻油與Span80的混合物。
4.權利要求1所述的普洱茶免疫佐劑，其特征在于所述助乳化劑為常規的1，2_丙二醇或聚乙二醇400或無水乙醇中的一種。
5.權利要求1所述的普洱茶免疫佐劑，其特征在于所述油相為常規的液體石蠟或白油或注射用大豆油中的一種。
6.權利要求1所述的普洱茶免疫佐劑，其特征在于所述水相為注射用水或者含有藥物或疫苗成分的注射用水溶液。
7.種如權利要求1所述普洱茶免疫佐劑在制備流感疫苗中的應用，其特征在于:普洱茶免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為300:1 150000:1，其中，所述普洱茶免疫佐劑由下列質量比的組分組成: 普洱茶提取物0.05 100% 載體O 99.95%。
全文摘要
本發明提供一種普洱茶免疫佐劑，其特征在于由下列質量比的組分組成普洱茶提取物0.05～100%，載體0～99.95%。本發明用普洱茶提取物作為流感疫苗佐劑，具有良好的有效性，能提高抗原的免疫原性，增強免疫效果，解決了目前免疫佐劑單一，副作用難以避免，疫苗生產供應量有限，難以滿足疫情爆發時急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效時間慢等諸多問題，而且疫苗質量容易控制。普洱茶提取物制備方法簡便，其材料來源廣泛，較為經濟、環保。
文檔編號A61P37/04GK103083664SQ20131006562
公開日2013年5月8日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者李映波, 劉洪卿, 孫笠雯, 趙蘭華, 楊磊 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所