一種白蛋白-阿霉素納米制劑及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：：一種白蛋白-阿霉素納米制劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于醫藥
技術領域：
，具體涉及一種阿霉素納米制劑及其制備方法和應用。
背景技術：
：腫瘤是直接威脅人類健康的重大疾病。許多有效的化療藥物因為對癌細胞、癌組織缺乏選擇性或靶向性，容易損害正常的組織和細胞，因而嚴重限制了這些藥物在腫瘤治療中的應用。阿霉素是一個廣譜抗腫瘤藥物，但是在有效劑量下顯示了嚴重的不良反應[J.M.Llovet，JournalofGastroenterology40(2005)225-235]，其毒害效應主要產生在心臟、骨髓和腸道[G.Mazueetal.,InternationalJournalofOncology7(1995)713—726]。研究表明腫瘤組織有直徑在100nm到1000nm的微孔，而在絕大多數正常的健康組織中，細胞間的連接縫隙小于lOnm。因此，通過制備介于這兩種尺寸之間的載藥納米粒子，就可能把治療藥物選擇性地輸送到腫瘤組織中，納米藥物在腫瘤組織中的這種增強的滲透和滯留效應被稱為EPR效應[H.Maedaetal"JournalofControlledRelease65(2000)271—284]。通常，利用大分子制備的納米粒子具有體內穩定，藥物不容易滲漏，易于修飾，化學組成易于調控等優點。而在納米粒子的表面修飾多糖，如茁霉多糖(pullulan)、殼聚糖、葡聚糖等可以增加納米粒子在體內的循環時間，使納米藥物避免被巨噬細胞吞噬而成功地輸送到耙向病灶[Z.Liuetal.,JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA,83(2007)806—812;C.Lemarchandetal.,EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics58(2004)327-341;C.Passiranietal.,PharmaceuticalResearch15(1998)1046—1050]。此外，殼聚糖及其衍生物具有抗腫瘤的作用，其抗腫瘤機制既可直接作用于腫瘤細胞，干擾細胞代謝，抑制細胞生長，誘導細胞凋亡，又可以通過增強機體免疫功能，發揮抗腫瘤作用[曹俊等，中國生化藥物雜志，26(2005)126-127]。而利用白蛋白制備的納米粒子除了利用EPR效應以外，還利用細胞膜上的白蛋白受體Gp60及細胞膜穴樣內凹(caveolae),以及腫瘤組織中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)的作用，促進藥物進入腫瘤細胞內，增加化療療效[M.J.Hawkinsetal.,AdvancedDrugDeliveryReviews60(2008)876—885]。目前已經有一些關于白蛋白和阿霉素納米粒子的專利申請。在這些有關的專利中，有的是通過水包油或者油包水的方法制備白蛋白-阿霉素納米粒子[中國專利申請號02114356.0];有的是通過共價鍵連接阿霉素到白蛋白上[中國專利申請號200680034375.3];也有的是通過超聲波、微流化以及高壓均質技術將白蛋白結合到阿霉素脂質囊泡上[中國專利申請號200810147342.0]，或者將白蛋白水溶液和阿霉素有機溶液進行乳化制備的[200810147344.乂]。另外，還有利用白蛋白和小分子糖一半乳糖復合物制備阿霉素納米粒子的專利[中國專利申請號200410046650.6，200410046676.0,200680034375.3]。這種納米粒子具有較好的腫瘤靶向作用，但是不具有在體內長循環的性質。到目前為止，我們還沒有發現關于以葡聚糖和殼聚糖為殼，白蛋白和阿霉素為核的納米粒子的報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種可增強腫瘤靶向作用，提高阿霉素療效，顯著降低阿霉素毒副作用的阿霉素納米制劑及其制備方法和應用。本發明提供阿霉素納米制劑是一種利用白蛋白-葡聚糖共價復合物、殼聚糖和阿霉素制備得到的以殼聚糖和葡聚糖為殼，白蛋白和阿霉素為核的納米粒子溶液。本發明的制備步驟如下將殼聚糖與白蛋白-葡聚糖共價復合物以一定質量比混合，殼聚糖的分子量在20500kDa之間，殼聚糖與白蛋白的質量比在0.05-5之間；調節pH到4.56.5范圍內，使殼聚糖與白蛋白形成靜電復合物。然后將上述溶液加熱至60。C100。C，維持11000分鐘，優選10-100分鐘，使白蛋白變性并發生分子間交聯，形成以白蛋白為核，葡聚糖和殼聚糖為殼的穩定的納米粒子溶液。再在酸性條件下混合上述納米粒子溶液和鹽酸阿霉素溶液，殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子溶液中，白蛋白的最終濃度為0.1~50mg/mL，阿霉素與白蛋白的質量比為10:1~1:IO之間；將混合溶液的pH調到6.28.2范圍內，利用白蛋白與阿霉素之間的靜電和疏水作用，通過擴散的方法將阿霉素包埋在納米粒子的內部，即得到以白蛋白和阿霉素為核，殼聚糖和葡聚糖為殼的納米粒子溶液。本發明中，白蛋白-葡聚糖共價復合物是通過Maillard反應制備獲得[中國專利申請號2007100400288]。白蛋白可以是人血清白蛋白，也可以是動物白蛋白，如牛血清白蛋白。本發明制備的阿霉素納米粒子在pH7.4條件下保持長期穩定，說明葡聚糖存在于納米粒子的殼層。原子力顯微鏡結果表明阿霉素納米粒子具有球型外貌(附圖1)，圖中納米粒子的平均粒徑為163納米。；-電位的結果表明納米粒子的表面帶有正電荷(附圖2)，說明殼聚糖和葡聚糖共同組成了納米粒子的外殼。通過調節pH值的方法可以將阿霉素高效地包埋在納米粒子的內部。與自由阿霉素相比，包埋在納米粒子內部的阿霉素具有明顯的緩釋性質(附圖3)。納米粒子在pH7.4條件下釋放阿霉素的速率很小，降低pH值可以顯著增加阿霉素的釋放速率。由于腫瘤細胞的pH值低于正常細胞，納米粒子的這個性質有利于其進入腫瘤細胞后釋放阿霉素。此外，白蛋白的腫瘤靶向性質可以提高阿霉素的療效并降低阿霉素的毒副作用。納米粒子表面的殼聚糖也具有抗腫瘤的作用并且可以增強免疫力，葡聚糖可以使納米粒子避免被巨噬細胞快速清除而增加其到達腫瘤的機會。本發明制備的納米制劑可以顯著地降低阿霉素的毒副作用，延長荷瘤小鼠的生命達46.8%。在本發明中，除了pH調節所使用的酸和堿以外，不使用其他的化學試劑，因而是一種綠色的阿霉素納米制劑的制備方法。圖1為阿霉素納米粒子的原子力顯微鏡照片。圖2為白蛋白(BSA)、白蛋白-葡聚糖共價復合物(Conjugates)、殼聚糖(Chitosan),以及納米粒子(Nanoparticles)在不同pH條件下的；-電位。圖3為自由阿霉素(DOX)和阿霉素納米粒子(DOX-nanoparticles)在體外釋放阿霉素的累計釋放曲線。釋放介質是0.01mol/LpH7.4磷酸緩沖液和0.2mol/LpH5.0醋酸緩沖液。具體實施例方式實施例l.將牛血清白蛋白(BSA)與葡聚糖(62kDa)用去離子水溶解，其摩爾投料比為2:1，待溶液混合均勻以后調節其pH值到7.1，然后將溶液冷凍干燥。將凍干后的固體粉末稱重，然后放入燒杯中置于裝有KBr飽和溶液的密閉容器中(容器內相對濕度為79%)，在6(TC下進行Maillard反應24小時后得到白蛋白-葡聚糖共價復合物。將白蛋白-葡聚糖共價復合物用去離子水溶解，配制白蛋白濃度為lmg/mL的溶液，與殼聚糖(分子量50kDa)的醋酸溶液混合，使得殼聚糖與白蛋白的質量比為1:10，白蛋白的終濃度為0.5mg/mL。調節混合溶液的pH值以后在80。C加熱1小時，即可制得殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。納米粒子的粒徑和多分散系數通過動態光散射分析得到，測量時溶液被稀釋到白蛋白濃度為0.17mg/mL。表1的結果表明在很寬的pH條件下加熱殼聚糖與白蛋白-葡聚糖共價復合物都可以得到殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。表l.在不同pH值下加熱殼聚糖與白蛋白-葡聚糖共價復合物溶液對納米粒子形成的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2.將進行了24小時Maillard反應后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共價復合物用去離子水溶解，加入不同比例的殼聚糖(分子量50kDa)醋酸溶液，然后調節溶液pH至5.6，在80。C加熱l小時制備殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。表2的結果表明在一定的殼聚糖與白蛋白質量比的范圍內都可以制備殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。表2.在不同殼聚糖和白蛋白質量比條件下制備的殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例3.將進行了24小時Maillard反應后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共價復合物用去離子水溶解，加入殼聚糖(分子量50190kDa)醋酸溶液，殼聚糖與白蛋白的質量比為1:10，然后調節溶液pH至5.6，在80。C加熱l小時制備殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。通過這種方法制備的納米粒子非常穩定，在pH7.4PBS溶液中經過長時間的放置粒徑幾乎不發生變化，說明葡聚糖存在于納米粒子的外殼，阻止了殼聚糖由于氫鍵交聯而發生的聚集。；-電位分析表明(附圖2)，所制備的納米粒子在pH較低時其;-電位與單獨的殼聚糖相似，說明殼聚糖與葡聚糖共同組成納米粒子的外殼，而納米粒子的核由白蛋白組成。表3.由不同分子量的殼聚糖制備的殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子在PBS緩沖液中的長期穩定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4.將進行了24小時Maillard反應后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共價復合物用去離子水溶解，加入殼聚糖醋酸溶液，殼聚糖與白蛋白的質量比為1:10，白蛋白的終濃度為5mg/mL。調節溶液pH至5.6，在80。C加熱1小時制備殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。然后將納米粒子溶液與鹽酸阿霉素溶液混合，白蛋白與阿霉素的質量比為1:1，二者的終濃度分別為4mg/mL。攪拌過夜后，用NaOH調節溶液的pH值并繼續攪拌24小時，即可得到包埋阿霉素的納米粒子。在納米粒子溶液中的自由阿霉素通過超濾與納米粒子分離(超濾膜截留分子量30kDa)，超濾液中的阿霉素濃度利用紫外-可見光譜在480nm的吸收測定。阿霉素在納米粒子中的包埋效率(LE)和包埋量(LA)通過以下公式計算TC/0/,、初始阿霉素量-自由阿霉素量謹0/LE(%，w/w)=-一"^吊主目-x100%初始阿霉素量…o//、初始阿霉素量-自由阿霉素量謹0/LA(%，w/w)=-4,八^人仏曰-x100%共價復合物量表4.不同pH條件對殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子包埋阿霉素的影響。pH包埋效率(％)mil切7.462%42%7.970%48%8.277%52%表4的結果顯示增加pH可以增加納米粒子對阿霉素的包埋，阿霉素的最高包埋效率和包埋量分別可以達到77%和52%。納米粒子在體外釋放阿霉素按照以下方法測定取一定量的阿霉素納米粒子溶液置于透析袋中(截留分子量為14kDa)，然后將透析袋浸入不同釋放介質溶液中，在37。C下以100rpm的速度磁力攪拌，每隔一定時間從介質溶液中取出3mL樣品，同時加入相同體積的新鮮釋放介質。樣品中阿霉素的含量通過紫外-可見光譜在480nm的吸收測定。體外釋放的結果見附圖3。附圖3的結果表明，阿霉素納米粒子與自由阿霉素相比表現出明顯的緩釋性質，并且其在pH5.0條件下的釋放速率明顯大于在pH7.4條件下的釋放速率，這個性質將有利于納米粒子進入腫瘤細胞以后釋放阿霉素以達到有效降低阿霉素毒副作用的目的。實施例5.將進行了24小時Maillard反應后得到的牛血清白蛋白-葡聚糖共價復合物用去離子水溶解，加入殼聚糖醋酸溶液，殼聚糖與白蛋白的質量比為1:10，白蛋白的終濃度為5mg/mL。調節溶液pH至5.6，在80。C加熱1小時制備殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。然后將納米粒子溶液與不同比例的鹽酸阿霉素溶液混合，混合后白蛋白的終濃度為4mg/mL。攪拌過夜后，用NaOH調節溶液的pH值到7.4并繼續攪拌24小時，即可得到包埋阿霉素的納米粒子。表5的結果表明增加阿霉素的比值可以增加阿霉素的包埋量但是降低其包埋效率。表5.不同阿霉素與白蛋白質量比對殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子包埋阿霉素的影響。阿霉素與白蛋白質量比包埋效率(％)頃1:475131:257181:16242實施例6.將人血清白蛋白(HSA)用去離子水溶解，配制成10mg/mL的白蛋白溶液。然后將分子量為62kDa的葡聚糖加入到白蛋白溶液中，葡聚糖與白蛋白的摩爾投料比為81:2。待溶液混合均勻以后調節其pH值到7.10，然后將溶液冷凍干燥。將凍干后的固體粉末稱重，然后放入燒杯中置于裝有KBr飽和溶液的密閉容器中(容器內相對濕度為79%)，在60。C下進行Maillard反應48小時以后得到白蛋白-葡聚糖共價復合物。將得到的人血清白蛋白-葡聚糖共價復合物用去離子水溶解，加入殼聚糖醋酸溶液，殼聚糖與白蛋白的質量比為1:10，白蛋白的終濃度為5mg/mL。調節溶液pH至5.6，在80。C加熱1小時制備殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子。然后將納米粒子溶液與鹽酸阿霉素溶液混合，控制白蛋白與阿霉素的質量比為1:1，混合后白蛋白和阿霉素的終濃度分別為4mg/mL。攪拌過夜后，用NaOH調節溶液的pH值到7.4并繼續攪拌24小時，即可得到包埋阿霉素的納米粒子。用人血清白蛋白制備的阿霉素納米粒子，其阿霉素的包埋效率為58%，包埋量為40%。實施例7.用透析的方法將阿霉素納米粒子溶液中的自由阿霉素除去。取生長良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理鹽水以1:4稀釋(細胞濃度約為12x1(^個/mL)，每只小鼠右腋皮下接種0.2mL，隨機分組，每組10只，設空白對照組，阿霉素原料(3mg/kg)組，阿霉素原料(5mg/kg)組，阿霉素納米粒子(阿霉素3mg/kg)組，阿霉素納米粒子(阿霉素5mg/kg)組，阿霉素納米粒子(阿霉素8mg/kg)組。接種后第3日開始尾靜脈注射給藥，每次給藥前稱量體重，按實際體重給藥，共給藥5次。接種后第10日稱體重后脫臼處死小鼠，解剖取瘤塊，稱瘤重，計算各組平均瘤重。實體瘤的療效評價以瘤重抑制百分率(inhibitionrate,IR)表示，將給藥組的平均瘤重與對照組的平均瘤重按下列公式計算抑瘤率-抑瘤率IR(%)=(l-WT/WC)x100%其中WT為給藥組的平均瘤重，WC為生理鹽水對照組的平均瘤重。按公式計算求出腫瘤抑制率并進行t檢驗。經統計學檢驗P<0.05為有效。9表6.阿霉素納米粒子對荷H22瘤小鼠瘤重抑制的結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與空白對照組:匕較Ap〈0.01，"P<0.001，*P<0.01，**P<0.001,***P<0.001。表6的結果表明，和阿霉素原料組相比，阿霉素納米粒子組在更高的給藥劑量下，小鼠的體重不僅沒有降低還有所增加，證明了阿霉素納米粒子有較小的毒副作用并且有一定的腫瘤抑制效果。實施例8.用透析的方法將阿霉素納米粒子溶液中的自由阿霉素除去。取生長良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理鹽水以1:3(生理鹽水H22細胞液)稀釋，每只小鼠腹腔接種0.2mL，隨機分組，每組10只，設空白對照1組，空白對照2組，阿霉素原料(5mg/kg)組，阿霉素納米粒子(阿霉素12mg/kg)組。接種后第5日開始尾靜脈注射給藥，每次給藥前稱量體重，按實際體重給藥，共給藥5次。試驗期間逐日記錄動物死亡的情況。分別記錄對照組和給藥組動物的平均生存時間，按照下列公式計算生命延長率生命延長率(％)=(給藥組平均存活天數/對照組平均存活天數-1)xl00%<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與空白對照組比較+P>0.05，**P<0.01表7的結果表明，阿霉素原料(5mg/kg)由于毒性太大，使小鼠體重迅速下降導致其死亡，而阿霉素納米粒子(阿霉素12mg/kg)組明顯提高了小鼠的存活時間，證明了阿霉素納米粒子能有效地降低阿霉素的毒副作用和提高阿霉素療效。實施例9.使用未除去自由阿霉素的納米粒子溶液(其中含25%自由阿霉素和75%包埋在納米粒子內部的阿霉素)進行小鼠實驗。取生長良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理鹽水以1:3(生理鹽水H22細胞液)稀釋，每只小鼠腹腔接種0.2mL，隨機分組，每組10只，設空白對照l組，空白對照2組，阿霉素原料(5mg/kg)組，阿霉素納米粒子(阿霉素8mg/kg)組。接種后第5日開始尾靜脈注射給藥，每次給藥前稱量體重，按實際體重給藥，共給藥5次。試驗期間逐日記錄動物死亡的情況。分別記錄對照組和給藥組動物的平均生存時間，按照下列公式計算生命延長率生命延長率(％)=(給藥組平均存活天數/對照組平均存活天數-1)xlOO%表8.含25%自由阿霉素的納米粒子溶液治療荷H22瘤小鼠的生命延長效果。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表8的結果表明，阿霉素原料(5mg/kg)由于毒性太大，其小鼠的存活時間反而低于空白對照組，由于阿霉素納米粒子溶液中含有自由阿霉素，在治療初期自由阿霉素快速釋放抑制腫瘤的生長，而被包埋在納米粒子內部的阿霉素的緩釋作用使得病灶繼續得到治療。表8的數據再次證明了阿霉素納米粒子能有效地降低阿霉素的毒副作用和提高阿霉素療效。權利要求1.一種具有雙多糖外殼的白蛋白-阿霉素納米制劑的制備方法，其特征在于具體步驟如下將殼聚糖與白蛋白-葡聚糖共價復合物混合，殼聚糖的分子量在20～500kDa之間，殼聚糖與白蛋白的質量比在0.05～5之間；調節pH到4.5～6.5范圍內，使殼聚糖與白蛋白形成靜電復合物；然后將上述溶液加熱至60℃～100℃，維持1～1000分鐘，使白蛋白變性并發生分子間交聯，形成以白蛋白為核，葡聚糖和殼聚糖為殼的穩定的納米粒子溶液；再在酸性條件下混合上述納米粒子溶液和鹽酸阿霉素溶液，殼聚糖/葡聚糖-白蛋白納米粒子溶液中，白蛋白的最終濃度為0.1～50mg/mL，阿霉素與白蛋白的質量比為10∶1～1∶10之間；將混合溶液的pH調到6.2～8.2范圍內，利用白蛋白與阿霉素之間的靜電和疏水作用，通過擴散的方法將阿霉素包埋在納米粒子的內部，即得到以白蛋白和阿霉素為核，殼聚糖和葡聚糖為殼的納米粒子水溶液。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的白蛋白-葡聚糖共價復合物由Maillard反應制備而獲得。3.—種如權利要求1所述方法制備獲得的具有雙多糖外殼的白蛋白-阿霉素納米制劑。4.一種如權利要求3所述的具有雙多糖外殼的白蛋白-阿霉素納米制劑作為惡性腫瘤治療藥物的應用。全文摘要本發明屬于醫藥
技術領域：
，具體為一種具有雙多糖外殼的白蛋白-阿霉素納米制劑及其制備方法和應用。該納米制劑是以殼聚糖和葡聚糖為外殼，白蛋白和阿霉素為核的納米粒子的溶液。其制備步驟包括將殼聚糖和白蛋白-葡聚糖共價復合物混合，然后加熱，形成以白蛋白為核，葡聚糖和殼聚糖為殼的納米粒子溶液；再在酸性條件下混合上述納米粒子溶液和鹽酸阿霉素溶液，在一定的pH值下，通過擴散將阿霉素包裹在納米粒子內部。本發明中白蛋白的腫瘤靶向性質可以提高阿霉素的療效并降低阿霉素的毒副作用。納米粒子表面的殼聚糖也具有抗腫瘤的作用并且可以增強免疫力，葡聚糖可以使納米粒子避免被巨噬細胞快速清除而增加其到達腫瘤的機會。文檔編號A61K47/48GK101653611SQ20091005523公開日2010年2月24日申請日期2009年7月23日優先權日2009年7月23日發明者萍姚,戚佳寧申請人:復旦大學