一種集超聲造影與熱療于一體的診療制劑的制備方法
【專利摘要】一種集超聲造影與熱療于一體的診療制劑的制備方法，其步驟是：1）將1?50mg有機—無機復合脂質和0.1?10mg聚乙二醇溶于0.1?1mL無水乙醇中；2）將1?25mg薄荷醇溶于1?20mL超純水中，水浴加熱至45℃，再與1?10mL吲哚菁綠的水溶液混合；3）將步驟1）中得到的有機—無機復合脂質和聚乙二醇的乙醇溶液在水浴超聲的條件下快速注入步驟2）得到的混合液中；4）探頭超聲后，得到內腔包載有吲哚菁綠和薄荷醇及表面覆蓋有納米級厚度且生物相容性好的無機硅酸鹽殼層的有機—無機復合脂質納米顆粒。本發明的復合脂質診療制劑能夠實現在超聲可視化觀察下對腫瘤組織進行光熱治療，且穩定性好，對人體均無明顯毒副作用，制備方法簡單，設備要求較低。
【專利說明】
-種集超聲造影與熱療于一體的診療制劑的制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及生物醫學材料領域，具體是設及一種集超聲造影與熱療于一體的診療 制劑的制備方法。
【背景技術】
[0002] 癌癥是一種具有高度異質性和極強適應性的疾病，需要根據病人的特點和疾病的 進展選擇不同類型的診斷和治療方案。一類將診斷與治療功能一體化的納米診療制劑在腫 瘤治療領域逐漸興起。診療時聯用納米制劑能為患者提供各種個性化的診斷治療方案，從 而改善治療效果。因此，研發新型多功能納米診療制劑具有重要的意義，超聲成像是目前臨 床上廣泛應用的診斷方法。
[0003] 超聲造影劑是一類能夠顯著增強超聲檢測信號的診斷制劑，其主要成分是微氣 泡。超聲造影劑可W增強背向散射信號，從而大大提高超聲診斷效果。目前，國內臨床上用 到的超聲造影劑是聲諾維（SonoVue)，它是由憐脂包裹SF6氣體形成的微泡，粒徑是2~8 μ m。盡管WSonoVue為代表的微米級超聲造影劑，在不同程度上獲得了成功的應用，但是仍然 存在許多問題:一方面是，粒徑大，因此僅局限于血池顯影，不易實現對其血管外疾病的診 斷與治療；另一方面是，聲諾維由于包膜材料為脂質，脂質性質不夠穩定，在體內持續時間 不夠長，造影持續時間短，所W要利用微泡造影劑實現腫瘤的分子成像還存在一定的困難。 因此，尋找小型化、穿透力強的聲學造影劑便成為超聲影像領域重要的研究方向，也成為臨 床診斷和疾病治療的迫切需要。納米級超聲造影劑比商用的微泡造影劑小十倍左右，具有 血管外診斷的潛力。其粒徑小，可通過血管內皮系統，實現血管外顯影。盡管納米級的超聲 造影劑可實現血管外顯影，但僅能用于癌癥的早期診斷。
[0004] 目前，研究較多的液態氣碳類超聲造影，如全氣己燒、全氣戊燒、全氣下燒等，液態 核屯、類造影劑主要通是過聚集的方式實現超聲顯影增強，但運種方式不能達到較好的超聲 顯影效果。因此，科研工作者開發了一種固態核屯、類造影劑一一薄荷醇。薄荷醇是一種能產 生典型薄荷香味的天然的環類單祗化合物，W游離和醋的狀態存在，也稱為薄荷腦。有止 癢、止痛、防腐、刺激、麻醉、清涼、抗炎和抗菌劑等制藥應用，可用于治療頭痛、神經痛、痊癢 及呼吸道炎癥、萎縮性鼻炎、聲啞等。常用作香煙、牙膏、香水、飲料和糖果的添加劑。薄荷醇 的強揮發性極強，可在自然狀態下產生薄荷醇氣體微泡，起到增強超聲造影的效果。通過大 量實驗證明，W薄荷醇為核屯、的超聲造影劑W其緩釋表現良好，包載率高，超聲效果好及超 聲持續時間長的特點而有望成為下一代臨床超聲造影劑。選用烙點較低，且在液態下易大 量揮發產生氣態微泡的固態類超聲造影劑通過靜脈注入機體后，可實現腫瘤組織超聲顯 影。
[0005] 近年來，光熱治療(Pho to therma 1 therapy )作為一種腫瘤治療新興的方法，因具 有定位治療、微創傷等優點，已逐漸成為該領域的研究熱點。光熱治療依賴于光熱轉換劑將 近紅外光(NIR)能轉換為熱能，利用正常組織和腫瘤細胞對溫度耐受能力的差異，達到既能 使腫瘤細胞調亡、又不損傷正常組織的治療目的。光熱治療已成為繼手術、放療、化療和免 疫療法之后的又一新的療法，是治療腫瘤的一種新的有效手段。目前，常見的光熱轉換劑包 括金納米棒、納米金殼、嗎I噪菁綠、聚化咯、石墨締、碳納米管等材料，其中嗎I噪菁綠是唯一 一種被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的用于人類醫學成像和診斷的試劑，其卓越的 光熱轉換效能和良好的安全性等優勢，被人們廣泛研究應用于生物醫學診斷及治療領域。 但是，游離的嗎I噪菁綠在極性溶劑中易迅速聚集，穩定性較差，其在血漿中易被快速清除， 在體內循環時間短，運些缺陷大大限制了嗎I噪菁綠的應用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于針對上述存在問題和不足，提供一種包載嗎I噪菁綠與薄荷醇， 且穩定性好的集超聲造影與熱療于一體的有機一無機復合脂質診療制劑的制備方法。
[0007] 本發明的技術方案是運樣實現的： 本發明所述的集超聲造影與熱療于一體的診療制劑的制備方法，其特點是包括W下步 驟： 1) 將l-50mg有機一無機復合脂質和0.1-lOmg聚乙二醇溶于0.1-1血無水乙醇中； 2) 將l-25mg薄荷醇溶于l-20mL超純水中，水浴加熱至45°C，再與1-lOmL嗎I噪菁綠的水 溶液混合； 3) 將步驟1)中得到的有機一無機復合脂質和聚乙二醇的乙醇溶液在水浴超聲的條件 下快速注入步驟2)得到的混合液中； 4) 探頭超聲后，得到內腔包載有嗎I噪菁綠和薄荷醇及表面覆蓋有納米級厚度且生物相 容性好的無機娃酸鹽殼層的有機一無機復合脂質納米顆粒。
[0008] 其中，所述步驟1)中的有機一無機復合脂質的結構既可W為：
[0009] 有機一無機復合脂質是由一個分子連接兩個疏水性碳鏈和一個親水性的有機娃 燒分子組成的新型脂質分子，運種分子在水中能夠通過溶膠-凝膠和自組裝過程形成類脂 質體，從而實現在類脂質體的內腔里包載有薄荷醇小液滴和嗎I噪菁綠溶液，在其表面覆蓋 有納米級厚度的生物相容性好的無機娃酸鹽殼層。
[0010] 所述步驟4)中的超聲時間為0.5-5min，超聲功率為30W，且工作3s停3s。
[0011] 本發明與現有技術相比，具有如下效果： (1) 本發明的復合脂質診療制劑不僅能達到腫瘤部位和血管造影，而且可在造影的同 時對腫瘤局部進行加熱，達到熱療殺死腫瘤細胞和組織的效果，從而實現在超聲可視化觀 察下對腫瘤組織進行光熱治療的目的； (2) 本發明的復合脂質診療制劑的造影效果持續長，由于納米顆粒表面覆蓋有納米級 厚度的無機娃酸鹽殼層，所W與傳統的脂質超聲造影劑相比，硅氧烷網絡顯著增加了復合 脂質的穩定性，由于薄荷醇具有固-液-汽Ξ相轉變，因此能W溫和的方式連續不斷地產生 氣體微泡而非傳統的猛烈的相轉變，從而延長了復合脂質診療制劑在體內的血液循環時 間，為診斷提供了更多的時間； (3)本發明的復合脂質診療制劑具有優良的生物相容性和可降解性，所用原料嗎I噪菁 綠、薄荷醇等對人體均無明顯毒副作用，且制備方法簡單，設備要求較低。
[0012] 下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明診療制劑的結構示意圖。
[0014] 圖2為本發明診療制劑的動態光散射粒徑分布圖。
[0015] 圖3為本發明診療制劑的透射電子顯微鏡圖片。
[0016] 圖4為本發明診療制劑24h內的穩定性結果檢測圖。
[0017] 圖5為本發明診療制劑與游離的嗎I噪菁綠在紫外一可見分光光度儀中測量的光度 值示意圖。
[0018] 圖6為本發明診療制劑的光熱轉化實驗結果示意圖。
[0019]圖7為本發明診療制劑在808nm激光照射5min后的體夕惦聲顯像圖片。
[0020] 圖8為本發明診療制劑的體外持續超聲顯像圖片。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1: 稱量Img有機一無機復合脂質和0.1 mg聚乙二醇(DS陽-PEG2000)注入0.1血無水乙醇中 分散。取Img薄荷醇粉末加入到盛有ImL超純水的血清瓶中，水浴加熱到45°C，然后再加入 ImL濃度為Img/mL嗎I噪菁綠的水溶液。在水浴超聲條件下，將上述得到的有機一無機復合脂 質和聚乙二醇的乙醇溶液快速注入到嗎I噪菁綠、薄荷醇和水的混合液中，得到預乳液。將預 乳液用超聲細胞破碎儀的探頭超聲0.5min(設置超聲功率為30w，工作3s，停3s)后，得到包 載嗎I噪菁綠和薄荷醇的娃脂質納米乳液。最后透析除去游離的嗎I噪菁綠，即得內腔包載有 嗎I噪菁綠和薄荷醇及表面覆蓋有納米級厚度且生物相容性好的無機娃酸鹽殼層的有機一 無機復合脂質納米顆粒。該復合脂質納米顆粒的結構如圖1所示。
[0022] 實施例2: 稱量50mg有機一無機復合脂質和1 Omg聚乙二醇(DS陽-PEG2000 )注入1血無水乙醇中分 散。取25mg薄荷醇粉末加入到盛有20mL超純水的血清瓶中，水浴加熱到45°C，然后再加入 lOmL濃度為Img/mL嗎I噪菁綠的水溶液。在水浴超聲條件下，將上述得到的有機一無機復合 脂質和聚乙二醇的乙醇溶液快速注入到嗎I噪菁綠、薄荷醇和水的混合液中，得到預乳液。將 預乳液用超聲細胞破碎儀的探頭超聲5min(設置超聲功率為30w，工作3s，停3s)后，得到包 載嗎I噪菁綠和薄荷醇的娃脂質納米乳液。最后透析除去游離的嗎I噪菁綠，即得內腔包載有 嗎I噪菁綠和薄荷醇及表面覆蓋有納米級厚度且生物相容性好的無機娃酸鹽殼層的有機一 無機復合脂質納米顆粒。該復合脂質納米顆粒的結構如圖1所示。
[0023] 實施例3: 稱量25mg有機一無機復合脂質和5mg聚乙二醇(DS陽-PEG2000)注入5mL無水乙醇中分 散。取12mg薄荷醇粉末加入到盛有lOmL超純水的血清瓶中，水浴加熱到45°C，然后再加入 5mL濃度為Img/mL嗎I噪菁綠的水溶液。在水浴超聲條件下，將上述得到的有機一無機復合脂 質和聚乙二醇的乙醇溶液快速注入到嗎I噪菁綠、薄荷醇和水的混合液中，得到預乳液。將預 乳液用超聲細胞破碎儀的探頭超聲2min(設置超聲功率為30w，工作3s，停3s)后，得到包載 嗎I噪菁綠和薄荷醇的娃脂質納米乳液。最后透析除去游離的嗎I噪菁綠，即得內腔包載有嗎I 噪菁綠和薄荷醇及表面覆蓋有納米級厚度且生物相容性好的無機娃酸鹽殼層的有機一無 機復合脂質納米顆粒。該復合脂質納米顆粒的結構如圖1所示。
[0024] 實施例4: 稱量5mg有機一無機復合脂質和0.5mg聚乙二醇(DS陽-PEG2000)注入0.5血無水乙醇中 分散。取25mg薄荷醇粉末加入到盛有4mL超純水的血清瓶中，水浴加熱到45°C，然后再加入 ImL濃度為Img/mL嗎I噪菁綠的水溶液。在水浴超聲條件下，將上述得到的有機一無機復合脂 質和聚乙二醇的乙醇溶液快速注入到嗎I噪菁綠、薄荷醇和水的混合液中，得到預乳液。將預 乳液用超聲細胞破碎儀的探頭超聲0.5min(設置超聲功率為30w，工作3s，停3s)后，得到包 載嗎I噪菁綠和薄荷醇的娃脂質納米乳液。最后透析除去游離的嗎I噪菁綠，即得內腔包載有 嗎I噪菁綠和薄荷醇及表面覆蓋有納米級厚度且生物相容性好的無機娃酸鹽殼層的有機一 無機復合脂質納米顆粒。該復合脂質納米顆粒的結構如圖1所示。
[0025] 采用馬爾文(Malvern)激光粒度儀及Zeta電位儀測量上述實施例中獲得的復合脂 質納米顆粒的粒徑為197.4 ± 6.9nm，電位為-12.5 ± 1.8mV，并得到如圖2所示的動態光散射 粒徑分布柱狀圖。由圖2可W看出，烙融乙醇注入法制備得到的復合脂質納米顆粒的納米粒 徑分布范圍較窄，在200皿左右，透射電鏡照片如圖3所示。運種小粒徑的納米顆粒能夠穿透 腫瘤血管壁到達腫瘤組織內部，在腫瘤部位有望實現超聲造影顯像。
[0026] 對有機一無機復合脂質納米顆粒的體外穩定性進行測試： 將上述實施例中制備的有機一無機復合脂質納米顆粒分別分散在PH=7.4的憐酸緩沖 液和含有10%胎牛血清的憐酸緩沖液中，置于37°C的搖床上2地，每隔化用激光粒度儀測定 其粒徑變化，結果如圖4所示。從圖中可W看出該納米顆粒在模擬人體內環境的條件下，粒 徑沒有明顯變化，說明納米顆粒的穩定性良好，有望在體內達到長時間循環。
[0027] 對有機一無機復合脂質納米顆粒的紫外一可見分光光度值進行測定： 將上述實施例中制備的有機一無機復合脂質納米顆粒按照嗎I噪菁綠的濃度配制為化 g/mL，并測量其0D值。作為對照，將游離的嗎I噪菁綠也配制成相同的濃度測定其0D值。如圖5 所示，材料濃度僅為22yg/mL(嗎I噪菁綠濃度為4yg/mL)時，該復合脂質納米顆粒在波長為 808nm附近有明顯的吸收峰。與其對應的同等濃度未包載入納米顆粒的嗎I噪菁綠的0D值大 致相等。從圖中可W看出，該復合脂質納米顆粒在波長為808nm激光照射下有明顯的光吸收 值，有望將吸收的光轉化為熱量。
[0028] 對有機一無機復合脂質納米顆粒的光熱轉化效率進行測定： 使用上述實施例中制備的有機一無機復合脂質納米顆粒進行光熱轉化實驗，如圖6所 示，設置濃度不同的嗎I噪菁綠溶液，分別取上述溶液2mL置于石英比色皿中，比色皿外面用 避光紙包裹，在避光紙上取一面積為1cm2的透光孔，使用波長為808nm，功率為2w的激光儀 照射，照射距離為5cm，照射面積為1 cm2，照射時間為15min。如圖6所示，每個循環為30min， 前15min使用激光照射，后15min將激光儀關閉，每隔30s記錄一次溫度值，得到如圖6所示曲 線。從圖中可W看出，該納米顆粒在較低的濃度時仍然有較高的光熱轉化效率，當濃度僅為 50yg/mL時納米顆粒溶液溫度即可達到65°CW上，可實現熱療殺死腫瘤組織的效果。
[0029] 對不同頻率下有機一無機復合脂質納米顆粒的體外超聲顯像實驗： 取上述實施例中制得的有機一無機復合脂質納米顆粒ImL加入到盛有3mL脫氣水的滴 管中，同樣使用波長為808nm，功率為2w的激光進行福照，福照時間為5min，福照距離5cm。福 照后置于溫度為37°C的水槽中，用多譜勒超聲診斷儀高頻探頭，機械指數(MI=0.4)，Depth =3.0cm。分別在頻率為f=3.5Hz、6.5Hz和8. OHz下掃查并保存圖片，W等量的生理鹽水作為 對照，比較不同頻率下復合脂質納米顆粒超聲顯影的差別，結果如圖7所示。從中可W看出， 該復合脂質納米顆粒在不同頻率下均有明顯的造影效果，在高頻探頭下造影效果更佳。運 說明經過激光福照后的復合脂質納米顆粒所包裹的薄荷醇由固體變成了液態，然后液體又 揮發變成了大量的氣體微泡，使該納米顆粒實現了 "固-液-氣"Ξ相的轉變，進而實現更好 的造影功能。運種Ξ相轉變型的超聲造影劑既解決了超聲微泡造影劑的尺寸過大，只能進 行血池示蹤顯像的缺點，又做到了微泡超聲造影劑的顯像效果。
[0030] 對有機一無機復合脂質納米顆粒的體外超聲持續顯像試驗： 按照不同頻率下有機一無機復合脂質納米顆粒的體外超聲顯像實驗的方法操作體外 超聲持續顯像實驗，并記錄f=8.0Hz下的不同時間的超聲顯像圖像，如圖8所示。由圖中可 見，該復合脂質納米顆粒有長達25min的持續顯影效果，運說明W有機一無機復合脂質為外 殼材料的造影劑，在超聲聲場中有優越的穩定性和較高的耐聲壓性。
[0031] 本發明是基于嗎I噪菁綠的光熱轉化性質，在波長為808nm紅外光的福照下，復合脂 質體內腔的嗎I噪菁綠溫度升高，可W殺死腫瘤細胞及組織。但是，由于存在薄荷醇的強揮發 性而使其功能喪失的非常快運一難題。因此，本發明合成了有機-無機復合脂質來包載、膽 存并且基于溫度的變化來緩釋放薄荷醇。有機-無機復合脂質內部包裹的薄荷醇受熱可進 行固液氣Ξ相循環轉變，產生氣體微泡可用于超聲造影，從而達到超聲造影和光熱治療的 效果。
[0032] 本發明運種連續可控的診斷治療制劑有望作為靈敏的溫度應答多功能載體，通過 靜脈注射可實現超聲成像監測下的光熱治療，在超聲的臨床應用上有極為廣闊的發展前 景。
[0033] 本發明是通過實施例來描述的，但并不對本發明構成限制，參照本發明的描述，所 公開的實施例的其他變化，如對于本領域的專業人±是容易想到的，運樣的變化應該屬于 本發明權利要求限定的范圍之內。
【主權項】
1. 一種集超聲造影與熱療于一體的診療制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 將l-50mg有機一無機復合脂質和0. l-10mg聚乙二醇溶于0.1-lmL無水乙醇中； 2) 將l-25mg薄荷醇溶于l-20mL超純水中，水浴加熱至45°C，再與Ι-lOmL吲哚菁綠的水 溶液混合； 3) 將步驟1)中得到的有機一無機復合脂質和聚乙二醇的乙醇溶液在水浴超聲的條件 下快速注入步驟2)得到的混合液中； 4) 探頭超聲后，得到內腔包載有吲哚菁綠和薄荷醇及表面覆蓋有納米級厚度且生物相 容性好的無機硅酸鹽殼層的有機一無機復合脂質納米顆粒。2. 根據權利要求1所述的集超聲造影與熱療于一體的診療制劑的制備方法，其特征在 于:所述步驟1)中的有機一無機復合脂質的結構為：3. 根據權利要求1所述的集超聲造影與熱療于一體的診療制劑的制備方法，其特征在 于:所述步驟1)中的有機一無機復合脂質的結構為：4. 根據權利要求1所述的集超聲造影與熱療于一體的診療制劑的制備方法，其特征在 于:所述步驟4)中的超聲時間為0.5-5min，超聲功率為30W，且工作3s停3s。
【文檔編號】A61P35/00GK105920625SQ201610246252
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月19日
【發明人】曹眾, 王春安, 蔣慶
【申請人】中山大學