一種治療hpv感染的納米粒制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥領域，涉及一種治療人乳頭瘤病毒(HPV)感染的納米粒制劑，尤其 涉及包括聚⑴氨基酯）聚合物和靶向敲除或敲降HPV的重組質粒構成的治療人乳頭瘤病毒 (HPV)感染的納米粒制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 宮頸癌嚴重危害婦女健康，占全世界女性惡性腫瘤疾病的第三位。超過85 %的宮 頸癌新發病例和癌癥致死病例出現在發展中國家（Jemal A，Bray F，Center MM, et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.)〇
[0003]高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要病因，其中的16和18兩種亞型，導 致了70%的宮頸癌。HPV致癌的重要原因是它可以表達E6和E7兩種病毒癌蛋白，促進細胞的 增殖，導致癌癥的發生。HPV導致宮頸癌是一個漫長的過程，會經歷一個宮頸上皮內瘤變 (CIN)時期。HPV通過上皮的微小損傷進入基底層細胞，隨著基底細胞向上不斷分化表達病 毒基因并在表層組裝成新的HPV病毒顆粒，在這個過程中促進上皮細胞的瘤樣增生并逐漸 發展為CINl (輕度上皮內瘤變）、CIN2(中度上皮內瘤變)和CIN3(重度上皮內瘤變和宮頸原 位癌）（Woodman CB,Collins SI ,Young LS.The natural history of cervical HPV infection:unresolved issues.Nat Rev Cancer,2007,7(1): 11-22·)。因此，充分利用現 有醫藥學手段阻斷HPV的感染是防治宮頸癌的重要途徑。
[0004] 目前醫藥界已經研發出多種阻斷HPV的感染的方法，但仍有很多不足。現有的治療 HPV感染的藥物以干擾素為主，原理是提高組織局部的免疫反應來抗病毒，不是針對HPV的 特異性治療，并且療效欠佳。常用的HPV疫苗對HPV亞型的覆蓋能力有限，只能預防兩種或四 種HPV的感染，能夠預防更多種亞型的疫苗還在研發中，但是生產成本也會相應增高。在我 國大陸地區，疫苗迄今為止還沒有通過國家藥監部門的審批，因此沒有投入臨床使用，我國 的大部分女性目前沒有疫苗接種的機會。另外一種預防宮頸癌的方法是女性定期做宮頸細 胞涂片和HPV篩查。由于健康教育宣傳不足和防癌篩查沒有納入醫保等原因，經濟不發達地 區的女性往往不能定期做宮頸細胞涂片和HPV篩查。而且，即使篩查出HPV感染，現有干擾素 療法的原理是提高局部組織的免疫反應，并不是針對HPV的特異性治療，因此效果不佳，也 不能有效地治療HPV進而預防宮頸癌。
[0005] 近年來，隨著基礎醫學的不斷進展，出現了一系列新的具有靶向敲降或敲除HPV的 重組質粒DNA，包括靶向敲降HPV的短發夾RNA( shRNA)重組質粒DNA，靶向敲除HPV的鋅指核 糖核酸酶（ZFN) (Sander JD，Dahlborg EJ，Goodwin MJ, et al. Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly(CoDA).Nat Methods, 2010)，轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN)(rmak T，Doyle EL，Christian M，et al.Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.Nucleic Acids Res，2011,39(12) :e82·)，規律成族的間 隔短回文重復重組質粒DNA(CRISPR)等。但是，由于有組織屏障和細胞屏障的存在，單純的 質粒DNA并不能通過屏障進入細胞發揮作用，因此需要有合適的運載體把質粒DNA帶入細胞 內部。對質粒DNA運載體的研究，總體分為兩大類，即病毒運載體和非病毒運載體，聚(β氨基 酯)聚合物(簡寫為PBAE)是一種非病毒運載體。
[0006]病毒運載體雖然具有較高的轉染效率，但是仍有很多缺點，比如:可能引起強烈的 機體免疫反應和并發癥，載體容量有限，制備要求較高，潛在的致癌性，生物安全性較差等。 因此，研究應用非病毒運載體進行基因靶向治療是近年來發展的趨勢。
[0007]聚（β氨基酯）聚合物是一種分子中含有酯基和可質子化氨基等基團組成的聚合 物，由于聚合條件、聚合物的分子量的不同，表現出的性質也會有所不同。目前已知的聚(β 氨基酯)聚合物家族中大部分聚合物進入細胞的能力較弱、轉染效率不高，還有一些聚合物 表現出較高的細胞毒性。因此，對聚⑴氨基酯)聚合物本身進行適當選擇是很關鍵的。
[0008] 在整個轉染的過程中，受到影響因素條件的影響較多，例如:細胞外、細胞內的環 境因素，例如ΡΗ、還原性、酶、外界刺激(例如光照、溫度）引起的分子結構、表面電荷或是親 疏水性等變化，聚(β氨基酯）聚合物與質粒組合后的復合物的粒徑、電位等。上述列舉的部 分影響轉染的因素均可以影響或改變聚⑴氨基酯)聚合物與基因的相互作用。
[0009] 聚(β氨基酯)聚合物與質粒需要保持合適的結合能力，如果結合力過低，轉染效率 會受到影響;如果結合的太緊密會阻礙DNA在細胞質的釋放，對靶向功能的有效發揮產生影 響。因此，并非所有的質粒都可以用于與聚(β氨基酯)組合后進行轉染。并不是所有的聚(β 氨基酯)聚合物都適合用于陰道上皮細胞的轉染。
[0010]目前還尚未有存在針對HPV感染的由聚(β氨基酯）聚合物和重組質粒構成的納米 粒制劑。
【發明內容】
[0011] 鑒于現有技術所存在的問題，本發明提供一種治療HPV感染的納米粒制劑，聚(β氨 基酯)聚合物、靶向敲除或敲降HPV的重組質粒DNA以及酸性溶劑作為主要原料，具有特異性 好、轉染效率高、毒副作用較低等優點。
[0012] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0013] -種治療HPV感染的納米粒制劑，包括聚(β氨基酯）聚合物和靶向敲除或敲降HPV 的重組質粒DNA。
[0014] 優選地，所述聚(β氨基酯）聚合物為由1，4-丁二醇二丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇、ΙΟ-氨丙基 )_4_ 甲基哌嗪三種化合物聚合生成的聚 (β 氨基酯) 聚合物。
[0015] 本發明的有益效果：
[0016]目前尚未有聚(β氨基酯）聚合物與靶向HPV的重組質粒DNA組合的治療HPV感染的 納米粒制劑，本發明首次提供了該制劑。聚⑴氨基酯)聚合物作為體內轉染劑，是該制劑的 重要組成部分，有利于將靶向敲除或敲降HPV的重組質粒DNA轉染到上皮細胞中去。如果只 有靶向敲除或敲降HPV的重組質粒DNA的話，轉染效果幾乎為零，是不能起治療作用的。
[0017]靶向敲除或敲降HPV的重組質粒DNA和聚(β氨基酯）聚合物共同構成基因靶向治療 的主要組成部分。聚(β氨基酯)聚合物能夠有效地把DNA轉運至細胞內并釋放，它能保護DNA 不被組織和細胞內各種酶降解，它對宿主細胞沒有毒性，不會引起較強的免疫反應、制備價 格較低、載體容量多、不具備潛在的致癌性等優點，有利于臨床應用轉化。帶正電荷的聚(β 氨基酯）和帶負電荷的靶向敲除或敲降HPV的重組質粒DNA作用形成納米顆粒，通過胞吞作 用進入細胞，再通過內涵體逃逸作用把質粒DNA釋放入細胞發揮作用。
[0018] 本發明所述的治療HPV感染的納米粒制劑具有較好的HPV靶向性、皮膚黏膜細胞吸 收性，達到對HPV感染的針對性治療，這是目前臨床上主要使用的以干擾素為基礎的調節機 體免疫功能的非特異性治療所做不到的。
[0019] 本發明所述的治療HPV感染的納米粒制劑不僅可以清除HPV的感染，而且可以清除 整合的HPV，現有的以干擾素為基礎的治療方法不能清除整合的HPV，因此這是本發明的一 個重要突破。
[0020] 人乳頭瘤病毒(HPV)既可以感染女性又可以感染男性，感染女性可以導致宮頸炎、 宮頸上皮內瘤變、宮頸癌，感染男性可以導致尖銳濕疣、口腔癌等。本發明所述的治療HPV感 染的納米粒制劑可以制成清潔噴劑供男士和女士使用，分別清除男性和女性的HPV感染，切 斷HPV通過性接觸等途徑傳染，這也是本發明的新穎性。
[0021] 本發明所述的治療HPV感染的納米粒制劑專一性地清除HPV病原體，對陰道菌群生 態平衡并無影響。既可以用于平時對HPV感染的預防，也可以用于已受HPV感染的感染者的 治療。目前醫藥界還沒有開發出針對HPV的特異性抗病毒藥物，已有的干擾素治療特異性不 好，療效欠佳;HPV疫苗只對未感染的患者有遠期預防作用，對已感染的HPV不能治療。本發 明的相關組合制劑，能夠解決目前HPV防治工作中的不足，進而降低HPV相關的宮頸癌等疾 病的發病率，具有很好的社會價值。
[0022] 在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。
[0023]進一步，所述聚⑴氨基酯）聚合物與靶向敲除或敲降HPV的重組質粒DNA的質量比 為 20:1 至80:1。
[0024]采取上述進一步技術方案的有益效果為:采用該比例，有利于提高轉染的效果。 [0025]進一步，所述靶向敲除或敲降HPV的重組質粒DNA選自靶向敲降或敲除HPV的短發 夾RNA重組質粒DNA(shRNA)、靶向敲除或敲降HPV的鋅指核糖核酸酶的重組質粒DNA(ZFN)、 靶向敲除或敲降HPV的轉錄激活因子樣效應物核酸酶的重組質粒DNA(TALEN)以及靶向敲除 或敲降HPV的規律成簇的間隔短回文重復的重組質粒DNA(CRISPR)中任一種或幾種的混合。
[0026]采取上述進一步技術方案的有益效果為：通過把聚（β氨基酯）聚合物和shRNA、 TALEN、