專利名稱：短葶山麥冬總皂苷及其制備方法
技術領域：
本發明提供一種短葶山麥冬總皂苷及其制備方法，尤其是含有留體皂苷類成分的 短葶山麥冬總皂苷，以及該總皂苷的制備提純方法，該方法提取精制得到的短葶山麥冬總 皂苷具有抗腫瘤作用。
背景技術：
短葶山麥冬(Liriope musacarli (Decne. )Bailey)屬于百合科山麥冬屬植物，其 塊根歷來一直作為麥冬藥材的替代品使用；《中國藥典(一部)》收載短葶山麥冬作為山麥 冬的藥材來源之一。短葶山麥冬皂苷C是從短葶山麥冬中提取的一種單體化合物，已有研究表明，其 具有良好的抗S180實體瘤和艾氏腹水癌的活性。短葶山麥冬皂苷C的提取方法是將短葶山麥冬藥材粗粉先用甲醇提取，再依次經 乙醚、正丁醇萃取，正丁醇萃取物經s印hadex LH-20和硅膠柱層析后得到的單體化合物。本領域技術人員發現，短葶山麥冬皂苷C的出率低，制備成本高，應用到醫藥領域 的市場直接導致患者的治療成本大幅增加，因此降低應用成本是藥品進入市場流通的必 然。但是最可行的降低成本的有效路徑就是不提純單體，將其改為提取有效部位是業內公 知的并且通用的技術手段。有效部位，主要指的是總皂苷相對于單體皂苷出率高，制備成本 低，適合臨床使用，并能有效降低治療成本，患者順應性也很好。但是醫藥用途的有效部位 并非簡單的有效成分等的混合，而是必須針對特定的目的(治療效果)經過特殊工藝手段 去蕪存菁的、精制后的混合物，這是需要大量的工作以及嫻熟的技藝才能勝任的。目前，醫學發現并研究的腫瘤是人體中正在發育的或成熟的正常細胞，在某些不 良因素的長期作用下，某部的細胞群，出現的過度增生或異常分化而生成的新生物，在局部 形成腫塊。但它與正常的組織和細胞不同，不按正常細胞的新陳代謝規律生長，而變得不受 約束和控制，導致了細胞呈現異常的形態、功能和代謝，以致可以破壞正常的組織器官的結 構并影響其功能。惡性腫瘤細胞還能向周圍浸潤蔓延，甚至擴散轉移到其他器官組織，繼續 成倍增生，造成對人體或生命極大的威脅。人體在生長的過程中雖常有腫塊形成，但腫塊不 一定都是腫瘤。因此，必須鑒別腫塊的性質，才能做到正確診斷、正確治療。腫瘤在臨床上 有實體瘤和非實體瘤之分，實體瘤及有形瘤可通過臨床檢查如X線攝片、CT掃描、B超或觸 診捫及到的有形腫塊稱實體瘤。而X線、CT掃描、B超及觸診無法看到或捫及到的腫瘤如血 液病中的白血病就屬于非實體瘤。癌癥的分類血癌(白血病)、骨癌、淋巴癌(包括淋巴細胞瘤)、腸癌、肝癌、胃癌、 盆腔癌(包括子宮癌，宮頸癌)、肺癌(包括縱隔癌)、腦癌、神經癌、乳腺癌、食道癌、腎癌。由此可見，簡單地用S180的實驗結果不能在臨床上定位于人體的任何準確位置 的癌癥/腫瘤，況且單體對某種腫瘤的瘤株有效并不能證明有效部位同樣有效，本發明將 用詳實的數據證明這一論點，而醫學治療癌癥/腫瘤是嚴格按照腫瘤在人體的生長部位或 器官進行醫治的，因此，現有技術中關于短葶山麥冬皂苷C以及關于短葶山麥冬的文獻對癌癥治療的臨床研究僅僅起到引路的作用，而很難認為其作為臨床依據或者起到教導的作用。因此，本領域急需發明一種可以分離出包括短葶山麥冬皂苷C單體在內(但不一 定是主要的有效成分)的總皂苷及其制備提純方法，目的是可以得到具有確實成分的、治 療效果明確的短葶山麥冬中總皂苷，使得到的總皂苷可以直接用于醫藥領域的治療目的明 確的各種制劑，明確規范該植物提取物的醫學用途，降低含有短葶山麥冬總皂苷的產品的 副作用以及降低其醫藥用途風險。
發明內容
本發明經過大量的實驗，研制出一種短葶山麥冬總皂苷及其提取和精制的方法， 該方法簡單、高效，分離度高，使得總皂苷的活性更加有效、準確和針對性強，單體純度高。本發明目的在于提供一種短葶山麥冬中總皂苷的制備方法，其在現有的常規技術 得到的短葶山麥冬提取物(短葶山麥冬總皂苷粗提物)，進一步經過精制，從而提純了活性 成分，使其有益的活性效果更加明確。本發明目的在于提供一種短葶山麥冬中總皂苷，該總皂苷具有抗腫瘤、抗癌方面 的活性，該效果更正了現有技術中公認的短葶山麥冬皂苷具有治療實體瘤的醫學療效方面 的偏差和誤區，顛覆了現有的部分理論，對短葶山麥冬的進一步研究以及短葶山麥冬總皂 苷對腫瘤的治療具有可貴的指導意義。本發明的目的還在于提供上述短葶山麥冬總皂苷抗腫瘤，如肺癌、肝癌和宮頸癌 等惡性腫瘤方面的治療作用。本發明提供了一種短葶山麥冬中總皂苷的制備方法，該方法包括以短葶山麥冬 根(塊根或須根)為原料，以乙醇提取，提取液用正丁醇萃取，得粗總皂苷(也稱短葶山麥 冬總皂苷粗提物)；取粗總皂苷加水溶解，使該粗總皂苷溶液通過非極性大孔樹脂柱(如 ab-8型，d-101型等大孔樹脂柱)，以水洗脫，至洗脫液無色，棄去該水洗脫液，目的是去除 糖類成分，再以乙醇的水溶液洗脫，收集洗脫液至洗脫液無色，優選再回收溶劑，得到總皂 苷。該總皂苷為精制后的短葶山麥冬總皂苷，也為本發明上述的短葶山麥冬中總皂苷。上述洗脫用乙醇溶液的濃度很重要，本發明優選50-95% wt的乙醇進行洗脫。需要說明的是在本文中，本發明為了規范技術術語，消除歧義，將短葶山麥冬的 常規提取方法得到的提取物稱之為短葶山麥冬總皂苷粗提物。上述提取得到粗總皂苷所采用的提取溶劑是乙醇，該乙醇是藥學意義上的相對于 稀乙醇而言的濃度彡51% wt的乙醇，一般指的是51% 95% wt的乙醇。本發明上述的稀 乙醇指的是乙醇的質量濃度< 50. 5%的乙醇溶液。對稀乙醇的界定參見中國藥典附錄“試 液”，95%的乙醇529ml加水1000毫升得到的乙醇的濃度即為稀乙醇的濃度的上限，經過測 算，乙醇濃度20度時就是稀乙醇，即，稀乙醇的最大濃度是49. 5-50. 5% wt。所述的短葶山麥冬根以乙醇提取，提取液用正丁醇萃取，該正丁醇的量為短葶山 麥冬根重量的0. 5 5倍，更優選與短葶山麥冬根的重量相等。上述在上柱之前還包括將粗總皂苷加水溶解，再過濾，棄去不溶物，濾液、上柱，以 乙醇的水溶液洗脫的步驟，洗脫時收集洗脫液一般為收集至少4倍柱體積的洗脫液，例如 收集4 40倍柱體積的洗脫液，在本發明的優選實施例中，可以收集8 15倍柱體積的洗脫液即可達到本發明的目的和效果。上述柱體積指的是非極性大孔樹脂柱的填料填充的體 積。目前也有技術披露提取短葶山麥冬總皂苷粗提物的方法采用稀乙醇提取，再采用 正丁醇或者樹脂吸附的方法進行初步除雜。本發明人按照常規方法重復再現提取得到的 粗提物經過檢測證明純度不高，含有大量的糖類成分等對腫瘤細胞沒有或者少有活性的成 分，且呈現出一定抑制活性的目標瘤株所針對的腫瘤部位不明確，缺乏對臨床的實際指導 意義等缺陷。本發明的目的在于在現有對短葶山麥冬研究的基礎上進一步精制，得到基本上去 除糖類成分等雜質的、對有明確分類的瘤株有強活性的短葶山麥冬總皂苷。本發明所述的短葶山麥冬總皂苷粗提物優選通過下述方法制得以短葶山麥冬根 為原料，以相對短葶山麥冬原料重量的至少4倍量的濃度> 51% wt的乙醇提取，提取液濃 縮至稠膏，再用水分散，然后再用正丁醇萃取，取正丁醇層萃取液，回收溶劑，得到即為所述 的粗總皂苷，也稱為短葶山麥冬總皂苷粗提物。本發明所述的“稠膏”為本領域公知，其相對密度大約應在1.35或以上。上述以短葶山麥冬根為原料的乙醇提取的過程中，乙醇的濃度為51 95 % wt，乙 醇的量一般優選為短葶山麥冬根原料重量的10-20倍，更優選12 18倍，例如用15倍量 的51% wt以上濃度(優選大約85% )的乙醇提取；提取的方法可以任何可行的方法，例如 是浸漬、回流等都可以，為了更好地得到總皂苷，本發明優選采用回流的方法。上述乙醇提取液回收溶劑后，加水分散的過程中，加水量為短葶山麥冬根原料重 量的0. 1 10倍，優選0. 5 5倍，在本發明的優選實施例中，加等倍量(短葶山麥冬根重 量的等倍量)的水分散，再用正丁醇萃取，正丁醇的量為上述加水分散中的水量的0. 5 5 倍，更優選加入的正丁醇和加入的水大約等量，萃取液回收溶劑，得粗總皂苷；該粗提物為 短葶山麥冬總皂苷粗提物，也稱粗總皂苷。本發明的原料可為短葶山麥冬或其中間產物短葶山麥冬總皂苷粗提物，后者可通 過市售購得或按《天然藥物化學》(第4版，人民衛生出版社)記載的方法得到。經過反復的、精確的測試實驗，上述方法所收集的含短葶山麥冬中總皂苷的流份， 即短葶山麥冬總皂苷中，屬于單體化合物的短葶山麥冬皂苷A含量為所得到的該短葶山麥 冬總皂苷的量的3-25% wt，優選5 20%。本發明還提供了一種短葶山麥冬中總皂苷，其為采用上述的制備方法得到的短葶 山麥冬中總皂苷，其中，短葶山麥冬皂苷A含量3-25% wt，優選5 20%，以上述方法得到 的短葶山麥冬總皂苷的重量為100%作為基準進行計算。本發明的短葶山麥冬總皂苷中，標識性成分為短葶山麥冬皂苷A，其為單體化合 物，在收集含短葶山麥冬總皂苷流份的精制除雜步驟中，該單體的色譜峰的保留時間為 10 55分鐘。經過進一步的驗證，本發明所述的短葶山麥冬中總皂苷中還含有短葶山麥 冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C等同樣屬于皂苷類的成分，短葶山麥冬皂苷B在收集含山麥冬 中總皂苷的流份的步驟中的保留時間為12 60分鐘。短葶山麥冬皂苷A β-sitosterol β -D-glucopyranoside (簡稱 Lm-1)、短葶山麥冬阜苷 B :ruscogenin 1-0- β -D-glucop yranosyl (1 — 2) - β—D—fucopyranoside (簡稱 Lm_2)禾口短寧山麥冬阜昔 C :ruscogenin 1-0-[β -D-glucopyranosyl(1 — 2)] [ β -D~xylopyranosyl(1 — 3)]- β -D-fucopyranoside (簡稱 Lm-3)等的結構和分析具體參見 YuB Y, Hirai Y, Shoji J, et al. Comparative studies on the constituents of ophiopogonis tuber and its congeners. VI. Studies on the constituents of the subterranean part of Liriope spicata var. prolifera and L. muscari. (1). Chem Pharm Bull. 1990 ；38 (7) : 1931—1935。為證明上述提取物屬于總皂苷，本發明采用薄層層析的方法(TCL)和高效液相色 譜的方法(HPLC)進行檢測(紫外檢測波長約203nm)，一般采用C18色譜柱，洗脫相為甲醇 (10-60% wt)-水(90-40% wt)或乙腈(5-50% )-水(95-50% wt)的混合溶液，更優選甲 醇-水梯度洗脫，經DAD (紫外檢測器，檢測波長190-300nm)和qtof (兩級質譜)檢測器檢 測，確定本發明提取物屬于總皂苷類。綜上所述，可以看出，采用傳統的短葶山麥冬中總皂苷的制備方法，一般制備產物 為皂苷和糖類及少量其他小分子化合物的混合物，雜質較多。本發明制備得到的產物為精制的短葶山麥冬總皂苷，盡可能去除糖類和小分子及 低極性化合物等雜質，得到純度較高的總皂苷提取物，包括對在肝臟、肺、胃腸、宮頸等部位 的腫瘤和癌癥具治療效果的幾乎所有的活性成分。本發明還提供了上述短葶山麥冬中總皂苷在抗腫瘤方面的作用，尤其是短葶山麥 冬總皂苷在制備治療癌癥的藥物中的用途。本發明所述的腫瘤包括良性腫瘤和惡性腫瘤， 后者尤其包括肝癌、肺癌、胃癌、宮頸癌。1、山麥冬精致總皂苷對H22(肝癌)移植小鼠的作用實驗動物KM小鼠；瘤原H22 (肝癌)；劑量設計以200mg/kg為高劑量組劑量，100mg/kg為低劑量組劑量。方法和結果60只KM小鼠分6組——空白對照組、環磷酰胺對照組、丙酮提取物高劑量組、丙酮 提取物低劑量組。常規接種H22。與接種后24h給藥，每天1次，連續給7天，于最末次給藥 24h，處死小鼠，取出瘤塊，稱重，組間做t檢驗，并計算抑瘤率。試驗重復1次。結果見附表 2、山麥冬精致總皂苷對U-14宮頸癌移植小鼠的作用樣品山麥冬精致總皂苷；瘤原U14 ；動物昆明鼠，II級，北京大學醫學部實驗 動物科學部提供，許可證號SCXK (京)2006-0008 3、山麥冬精致總皂苷對Lewis肺癌移植小鼠的作用樣品山麥冬精致總皂苷瘤原Lewi s肺癌動物C57，II級，北京大學醫學部實驗動物科學部提供，許可證號 SCXK (京)2006-0008 4、山麥冬精致總皂苷對S-180肉瘤移植小鼠的作用樣品山麥冬精致總皂苷；瘤原S180 ；小鼠，昆明鼠，雌性，體重18 22g。
7 上述經過藥理藥效實驗驗證，通過建立小鼠移植腫瘤的動物模型，結果驗證，本發 明制得的短葶山麥冬中總皂苷單體的抗肺癌、肝癌和宮頸癌的效果與文獻記載不盡相同， 現有文獻記載的是短葶山麥冬皂苷c具有抗腹水癌和S-180肉瘤的作用，本發明經過反復 實驗，驗證了經過本發明進精制的短葶山麥冬總皂苷具有lewis肺癌、H-22肝癌和U-14宮 頸癌的效果，但抗S-180肉瘤的作用不明顯，為研究和應用短葶山麥冬總皂苷糾正了現有 理論可能存在的偏差，提供了準確可信的依據。經急性毒性實驗及長期毒性實驗證實，短葶山麥冬總皂苷安全范圍廣；急性毒性 實驗顯示，總皂苷部位的LD5tl可達1600mg/kg，治療指數高，臨床應用于治療腫瘤或作為腫 瘤治療輔助用藥，在具有有效活性的同時還具有安全性。
圖1 本發明的制備方法得到的短葶山麥冬總皂苷的色譜圖，其中橫坐標是時間 (分鐘)，縱坐標是吸收度。
具體實施例方式以下結合附圖詳細說明本發明，但不限定本發明的實施范圍。實施例1 取短葶山麥冬藥材，加大約15倍量85%乙醇回流提取；提取液回收溶劑至稠膏 狀，加等生藥量(重量)水分散，以正丁醇萃取2次，合并萃取液，回收溶劑得粗總皂苷。將 粗總皂苷再加生藥量的等重量倍的水溶解，上ab-8型大孔樹脂柱，先以水洗脫，至洗脫液 molish反應呈陰性，再以8倍柱體積的95% wt的乙醇洗脫，洗脫液回收溶劑，得短葶山麥 冬總皂苷。經過采用高效液相色譜分析的方法(HPLC)進行檢測，色譜柱是C18，洗脫相為甲 醇_水或乙腈_水的混合溶液，更優選為甲醇-水梯度洗脫的溶液，經過DAD和qtof檢測 器檢測，得到的圖譜參見圖1，圖譜確定本實施例得到的提取物屬于總皂苷類，是精制后的 短葶山麥冬總皂苷。在該總皂苷中，除了短葶山麥冬皂苷A、短葶山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C 之外，還含有短葶山麥冬皂苷D (Lm-4) :ruscogenin 1-β-D-fucopyranoside及短葶山麥冬阜昔 E(Lm_5) :pennogenin 3-0-[4‘ -O-rhamnopyranosyl (1 3)-β -D-xylopyranosyl (1 — 4) ] - β-D-fucopyranoside，具體參見 Yu B Y, Hirai Y, Shoji J, etal. Comparative studies on the constituents of ophiopogonis tuber and its congeners. VI. Studies on the constituents of the subterranean part of Liriope spicatavar. prolifera and L. muscari. (1). Chem Pharm Bull. 1990 ；38 (7) : 1931—1935。實施例2 取短葶山麥冬藥材，加大約8倍量75%乙醇浸漬提取2次；提取液回收溶劑至稠 膏狀，加0. 5倍生藥量(重量)水分散，以正丁醇萃取2 5次，合并萃取液，回收溶劑得山 麥冬粗總皂苷。將粗總皂苷再加生藥量的0. 5重量倍的水溶解，上d-101型大孔樹脂柱，先 以水洗脫，至洗脫液molish反應呈陰性，再以10倍柱體積的80% wt的乙醇洗脫，洗脫液回 收溶劑，得短葶山麥冬總皂苷。經過采用高效液相色譜分析的方法(HPLC)進行檢測，色譜柱是C18，洗脫相為甲 醇_水梯度洗脫的溶液，DAD和qtof檢測器檢測，得到的圖譜確定本實施例得到的提取物 屬于總皂苷類，是精制后的短葶山麥冬總皂苷。實施例3 取短葶山麥冬藥材，加大約4倍量80%乙醇加熱提取；提取液回收溶劑至稠膏狀， 加1. 5倍生藥量(重量)水分散，以正丁醇萃取4次，合并萃取液，回收溶劑得山麥冬粗總皂 苷。將粗總皂苷再加生藥量的1. 5重量倍的水溶解，上d-101型大孔樹脂柱，先以水洗脫， 至洗脫液molish反應呈陰性，再以15倍柱體積的50% wt的乙醇洗脫，洗脫液回收溶劑，得 短葶山麥冬總皂苷。實施例4 取短葶山麥冬藥材，加大約20倍量90%乙醇加熱提取；提取液回收溶劑至稠膏 狀，加1. 5倍生藥量(重量)水分散，以正丁醇萃取4次，合并萃取液，回收溶劑得山麥冬粗 總皂苷。將粗總皂苷再加生藥量的1. 5重量倍的水溶解，上d-101型大孔樹脂柱，先以水洗 脫，至洗脫液molish反應呈陰性，再以4倍柱體積的90% wt的乙醇洗脫，洗脫液回收溶劑， 得短葶山麥冬總皂苷。實施例5 取短葶山麥冬藥材，加大約15倍量85%乙醇回流提取；提取液回收溶劑至稠膏 狀，加等生藥量(重量)水分散，以正丁醇萃取2次，合并萃取液，回收溶劑得粗總皂苷；將 粗總皂苷再加生藥量的等重量倍的水溶解，上ab-8型大孔樹脂柱，先以水洗脫，至洗脫液 molish反應呈陰性，再以8倍柱體積的75% wt的乙醇洗脫，洗脫液回收溶劑，得短葶山麥 冬總皂苷。
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權利要求
一種短葶山麥冬總皂苷的制備方法，該方法包括以短葶山麥冬根為原料，以乙醇提取，提取液用正丁醇萃取，得粗總皂苷；取粗總皂苷加水溶解后，使其通過非極性大孔樹脂柱，先以水洗脫至洗脫液無色，再以50 95％wt的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液至洗脫液無色，得短葶山麥冬總皂苷。
2.權利要求1所述的制備方法，其中，所述的粗總皂苷通過下述方法制得以短葶山 麥冬根為原料，以相對于短葶山麥冬的原料重量的至少4倍量的濃度> 51% wt的乙醇提 取，提取液濃縮至相對比度1.35的稠膏，再用水分散，用正丁醇萃取，取正丁醇層萃取液， 干燥，得所述的粗總皂苷。
3.權利要求1所述的制備方法，其中，在乙醇提取短葶山麥冬根的過程中，所述的乙醇 的量為所述短葶山麥冬根重量的10-20倍。
4.權利要求2所述的制備方法，其中，在所述的提取液加水分散再用正丁醇萃取中，水 為短葶山麥冬根重量的0. 1 10倍，正丁醇為水的重量的0. 5 5倍。
5.權利要求1所述的方法，其中，所述的收集洗脫液至洗脫液無色后，得到的短葶山麥 冬總皂苷中短葶山麥冬皂苷A的含量為3-25% Wt0
6.一種短葶山麥冬總皂苷，其為采用權利要求1所述的方法得到。
7.權利要求6所述的短葶山麥冬總皂苷，該短葶山麥冬總皂苷中，短葶山麥冬皂苷A含 量為3-25% wt,以所述的短葶山麥冬總皂苷的重量為100%計。
8.權利要求6所述的短葶山麥冬總皂苷，其中，所述的粗總皂苷通過下述方法制得 以短葶山麥冬根為原料，以至少為短葶山麥冬重量的4倍量的濃度> 51% wt的乙醇提取， 提取液濃縮至稠膏，再加水分散，用正丁醇萃取，得粗總皂苷；取粗總皂苷加水溶解，過濾棄 去不溶物后，濾液通過非極性大孔樹脂柱，先以水洗脫至洗脫液無色，再以乙醇的水溶液洗 脫，收集洗脫液至洗脫液無色，得短葶山麥冬總皂苷。
9.權利要求6所述的短葶山麥冬總皂苷在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
10.權利要求9所述的用途，其中，所述的腫瘤為良性腫瘤和/或包括肝癌、肺癌、宮頸 癌的惡性腫瘤。
全文摘要
本發明提供了一種短葶山麥冬中總皂苷及其制備方法，該方法包括以短葶山麥冬根為原料，以濃度≥51％wt的乙醇提取，提取液用正丁醇萃取得粗總皂苷；取粗總皂苷加水溶解，優選過濾棄去不溶物，使該粗總皂苷溶液通過非極性大孔樹脂柱，先以水洗脫至洗脫液無色，再以乙醇的水溶液洗脫，收集洗脫液至洗脫液無色，得總皂苷；本發明還提供了上述方法得到的短葶山麥冬總皂苷；本發明的方法提取精制得到的短葶山麥冬總皂苷具有明確的抗腫瘤作用。
文檔編號A61P35/00GK101926921SQ200910142488
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月18日 優先權日2009年6月18日
發明者林瑞超, 王鋼力, 聶黎行, 黃權成, 黃鵬騰 申請人:中國藥品生物制品檢定所