專利名稱：：魚用浸泡疫苗免疫佐劑及其應用和使用方法
技術領域：
：本發明涉及海洋生物疾病免疫防治技術，具體涉及魚用浸泡疫苗免疫佐劑及其應用和使用方法。
背景技術：
：我國養殖魚類產量據世界首位，但魚類的疾病防治技術研發速度較慢，開發的漁用疾病防治產品不能滿足生產的需求，特別在漁用疫苗開發與應用方面，目前可供漁業生產上選擇使用的產品不多。因此養殖中魚類細菌性疾病治療過多依靠投喂抗生素，其結果是長期的應用抗生素不僅會降低水產品的質量，還會導致細菌的耐藥性增強，給以后的疾病控制增加難度。國外在魚類疾病控制方面已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、浸泡用疫苗及口服疫苗等。國內的魚用疫苗產品制劑種類不多，在魚類疫苗研究方面多側重于注射用疫苗。魚類注射用疫苗對疾病預防效果明顯，但注射免疫工作量大、工作效率低，且會對魚體造成傷害。而魚類浸泡用疫苗不存在上述缺點，但單純的使用疫苗浸泡效果不佳。目前，有關魚類浸泡免疫用疫苗產品因受浸泡免疫效果較差的限制，開發的產品不多。國內已開發的魚類浸泡疫苗佐劑有莨菪堿、葡聚糖、MS1312，試驗證實，使用后免疫保護率均不理想。而國外的魚類浸泡免疫佐劑多為保密配方。基于以上現狀，我國的魚類浸泡疫苗研發速度處于緩慢發展狀態，限制阻礙了產業的發展。因此提供魚類浸泡疫苗佐劑，提高魚類浸泡疫苗效果，對推動水產養殖用疫苗制劑產業的快速發展是非常必要的。
發明內容本發明的目的是為魚類浸泡用疫苗提供一種高效的免疫佐劑即二硫蘇糖酶魚用浸泡免疫佐劑及其使用方法。研究發現，魚類選用浸泡疫苗免疫，不僅操作方便節省時間，而且相對于注射免疫對魚的損傷小，因此魚類選用浸泡疫苗免疫是一種最佳的免疫方案。但選用浸泡疫苗免疫時，在通常不加浸泡疫苗佐劑情況下，魚體僅僅通過鰓部接觸疫苗抗原，身體表面其他的可以激發免疫反應的部位多被體表的粘液所覆蓋，導致可呈遞疫苗抗原的細胞不能有效接觸到疫苗抗原，因此使用能夠去除魚體粘液的佐劑成分，可以提高魚類浸泡疫苗免疫的效果。研究發現二硫蘇糖醇(簡稱DTT)，即分子式為C4H1002S2，分子量為154.25道爾頓的化合物，能對魚體表粘液進行溶解，反復試驗證實，二硫蘇糖醇能夠有效提高魚類浸泡疫苗免疫效果，具備佐劑的功能，且該化合物在使用濃度范圍內對魚類及環境安全。最終確定二硫蘇糖醇作為魚類浸泡疫苗免疫佐劑。本發明的浸泡疫苗免疫佐劑，其特征在于上述的佐劑是二硫蘇糖醇，且二硫蘇糖醇溶解在海水及淡水中的使用濃度范圍為_50mg/L。本發明的濃度在l-50mg/L范圍內的二硫蘇糖醇免疫佐劑，應用于包括海水和淡水魚類的浸泡疫苗中協同作用達到高效的免疫效果。3本發明的使用方法如下首先選用體表完好健康的待免疫魚類，體重應在每尾2g以上；再用養殖用水將二硫蘇糖醇配制成使用濃度在l-50mg/L范圍內的溶液，將待免疫魚置于其中預浸泡2-30min;再將待用的疫苗加入其中，浸泡2-30min即完成浸泡免疫。本發明的積極效果在于用二硫蘇糖醇作為疫苗佐劑后可以顯著提高疫苗的免疫效果；使用方法簡便，成本較低，使用安全，對魚的存活率與生長速度沒有影響，而且不需要額外的設施與工序，對環境及操作人員同樣無害。具體實施例方式本發明的浸泡疫苗免疫佐劑，其特征在于上述的佐劑是二硫蘇糖醇，且二硫蘇糖醇溶解在海水及淡水中的使用濃度范圍為l-50mg/L。本發明的使用方法如下(1)首先選用體表完好健康的待免疫魚類，體重應在每尾2g以上；(2)應用養殖用水將二硫蘇糖醇配制成使用濃度在l-50mg/L范圍內的溶液，將待免疫魚小心置于其中預浸泡l-30min;再將待用的疫苗加入其中，浸泡2-30min即完成浸泡免疫。為了保證免疫效果，浸泡時水中溶解氧保持7mg/L以上，溫度變化控制在士2t:內。完成浸泡免疫后，小心將魚移入養殖池進行養殖即可。以下通過實施例對本發明作進一步說明。實施例1:應用本發明的濃度為lmg/L的佐劑和滅活鰻弧菌(Vibrio.Anguillarum)疫苗對牙鉀浸泡免疫。1材料(1)試驗用魚及養殖管理選用體重5g的健康牙鲆，試驗前暫養1周，試驗用海水穩定20-23°C，pH8.1-8.2，鹽度30，試驗期間投喂配合佴料，日投喂2次，24小時連續充氣，流水養殖。(2)疫苗制備將V.anguilla進接種至2216E液體培養基，28°C培養24h;4t:下4000rpm離心20min，收集菌體；將收集的菌體置于滅菌的PBS，pH7.2中，制成1.0X108cells/mL的弧菌懸液，0.5X甲醛28t:下滅活48h后為試驗用疫苗，4t:儲存；同時將滅活后的菌體接種于TSB固體平板，置2『C下恒溫培養24h、48h，確定無菌落長出。(3)浸泡免疫佐劑二硫蘇糖醇，使用濃度lmg/L。2試驗方法(1)試驗分組試驗設注射免疫組、浸泡免疫組、使用佐劑浸泡免疫組、注射空白對照組，浸泡空白對照組，每組設三個平行，每組3X30尾魚。(2)免疫方法試驗魚暫養1周后，注射免疫組每尾魚腹腔注射濃度為1.OX108cells/mL的V.angilla進疫苗0.lmL;浸泡免疫組用海水配制疫苗達到濃度1.OX107cells/mL后浸泡20min;使用佐劑浸泡免疫組用濃度5mg/1的二硫蘇糖醇海水溶液浸泡30min，之后用添加疫苗達到濃度1.0X107cells/mL，維持20min;注射空白對照組與浸泡空白對照分別用PBS溶液腹腔注射和海水浸泡，方法相同。(3)免疫后攻毒免疫30天后各組用Vibrio,anguillarum攻毒，攻毒采用注射感染，劑量為5.0X106ce/尾。3試驗結果攻毒15天后，統計個組的存活率，根據相對保護率公式RPS=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)X100X。計算免疫相對保護率。結果見表l表1應用二硫蘇糖醇為佐劑浸泡免疫牙鲆的免疫相對保護率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>浸泡免疫魚成活率免疫30天后，各組魚的成活率均為100%，生長速度正常。結果可以看出單純用V.anguillarum滅活疫苗浸泡免疫牙鲆，免疫相對保護率低僅為27%，使用本發明后，浸泡免疫相對保護率提高到86%，接近注射免疫效果，證明本發明佐劑對海水魚疫苗效果明顯。實施例2:應用本發明的濃度為50mg/L的佐劑和滅活點狀氣單胞菌疫苗對羅非魚浸泡免疫1禾才茅斗(1)試驗用魚及養殖管理選用體重3g的健康羅非魚，試驗前暫養10天，試驗用淡水溫度27-28°C，pH7.1-7.2，試驗期間投喂配合餌料，日投喂2次，日換水30%，24小時連續充氣。(2)疫苗制備將點狀氣單胞菌接種到LB液體培養基，28t:培養24h;4t:下4000rpm離心20min，收集菌體；將收集的菌體置于滅菌的生理鹽水中，pH7.2中，制成1.0X109cells/mL的菌懸液，0.5X甲醛28t:下滅活48h后為試驗用疫苗，4t:儲存；同時將滅活后的菌體接種于LB固體平板，置2『C下恒溫培養24h、48h，確定無菌落長出。(3)浸泡免疫佐劑二硫蘇糖醇，使用濃度50mg/L。2試驗方法(1)試驗分組浸泡免疫組、使用佐劑浸泡免疫組、浸泡空白對照組，每組設三個平行，每組3X40尾魚。(2)免疫方法試驗魚暫養10天后，隨機取魚分組，浸泡免疫組用養殖用水配制疫苗達到濃度1.OX108cells/mL后浸泡20min;使用佐劑浸泡免疫組先用濃度50mg/L的二硫蘇糖醇水溶液浸泡羅非魚2min，之后添加疫苗達到濃度1.OX107cells/mL，維持20min;浸泡空白對照只用淡水浸泡，方法相同，浸泡時各組均充氣。(3)免疫后攻毒免疫30天后各組用點狀氣單胞菌攻毒，攻毒采用注射感染，劑量為5.0X107cells/尾。3試驗結果攻毒15天后，統計各組的存活率，根據公式RPS=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)X100X。計算免疫相對保護率。結果見表2表2應用二硫蘇糖醇為佐劑浸泡免疫羅非魚的免疫相對保護率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>浸泡免疫魚成活率免疫30天后，各組魚的成活率均為100%，生長速度正常。結果表明，單純用狀氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫羅非魚，免疫相對保護率低僅為51.4%，使用佐劑二硫蘇糖醇后，浸泡免疫相對保護率提高到80.7%，效果提高了近30%。證明本發明佐劑對淡水魚疫苗效果明顯。權利要求一種魚用浸泡疫苗免疫佐劑，其特征在于上述的佐劑是二硫蘇糖醇，且二硫蘇糖醇溶解在海水及淡水中的使用濃度范圍為1-50mg/L。2.權利要求1所述的魚用浸泡疫苗免疫佐劑的使用方法，其特征在于(1)首先選用體表完好健康的待免疫魚類，體重在每尾2g以上；(2)應用養殖用水將二硫蘇糖醇配制成使用濃度l-50mg/L的預處理液，將待免魚置于其中進行預浸泡l-30min;再將待用的疫苗加入其中，浸泡2-30min即完成浸泡免疫。3.權利要求1的濃度在l-50mg/L范圍內的二硫蘇糖醇免疫佐劑，應用于包括海水和淡水魚類的浸泡疫苗中協同作用達到高效的免疫效果。全文摘要本發明涉及一種魚用浸泡疫苗免疫佐劑及其應用和使用方法。其特征在于上述的佐劑是二硫蘇糖醇，且二硫蘇糖醇的使用濃度范圍為1-50mg/L。本發明的二硫蘇糖醇魚用浸泡疫苗免疫佐劑廣泛應用于包括海水和淡水魚類的浸泡疫苗中。使用時首先選用體重在每尾2g以上且體表完好的待免疫魚類；再以養殖用水將二硫蘇糖醇配制成使用濃度1-50mg/L的預處理液，將待免魚小心置于其中進行預浸泡1-30min；然后將待用的疫苗加入其中，浸泡2-30min即完成浸泡免疫。本發明顯著提高疫苗的免疫效果，使用方法簡便，成本低，不需要額外的設施與工序，對魚類安全，對環境及操作人員同樣無害，而且不影響魚類的養殖存活率與生長速度。文檔編號A61P31/04GK101791404SQ200910255829公開日2010年8月4日申請日期2009年12月31日優先權日2009年12月31日發明者劉莉,王玉娟,王秀華,趙偉偉,黃倢申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所