一種新型水溶性免疫佐劑棘球蚴疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于疫苗開發技術領域。本發明涉及羊包蟲疫苗的研制及免疫佐劑的篩選 和配制。
【背景技術】
[0002] 棘球蝴病（Echinococosis granulosis)又名包蟲病（hydatidosis)，是一種由 寄生于犬、狼、狐貍等動物小腸的棘球絳蟲（Echinococcus)中絳期一棘球蝴感染中間宿主 而引起的非常嚴重的慢性人獸共患病，棘球蝴寄生于羊、牛、豬、駱駝和馬等家畜及多種野 生動物和人的肝臟、肺臟及其它器官，引起嚴重的公共衛生問題，給畜牧業生產帶來巨大損 失。現已被世界動物衛生組織（OIE)列為法定報告動物疫病，農業部則將其列為多種動物 共患的二類動物疫病，衛生部將其列為丙類人間傳染病及規劃防治的五大寄生蟲病之一。 2009年農業部、衛生部將其列入人畜共患病防控名錄。2010年，由衛生部、發改委、農業部 等十四個部委聯合印發了《防治包蟲病行動計劃（2010-2015年）》。2012年國家中長期動 物疫病防治規劃（2012-2020年）中，將其列為優先防治的國內二類動物疫病之一。
[0003] 該病呈世界性分布，我國是人畜棘球蝴病高發國家之一，主要由細粒棘球絳蟲引 起，自1905年我國青島首次報道人體棘球蝴病以來，現已在23省、自治區和直轄市發現 原發的人和動物棘球蝴病，其中新疆、青海、甘肅、四川、寧夏、內蒙古和西藏呈嚴重的地方 性流行，為我國棘球蝴病高發區。2004年調查顯示我國包蟲病流行區人群平均患病率為 1. 08%，囊型包蟲病病灶出現突然破裂，可致過敏性休克而死亡。據農業部門流行病學調查 數據推算，全國每年患包蟲病的家畜在5000萬頭以上，因家畜死亡和臟器廢棄造成的直接 經濟損失逾30億元。包蟲病給患者及其家庭帶來極大痛苦和沉重經濟負擔，給畜牧業生產 帶來巨大損失，是導致我國西部農牧區群眾因病致貧、因病返貧的主要原因之一。疫苗是切 斷該病傳播的最有效手段，因此研制一種羊包蟲疫苗用于中間宿主的免疫對控制該病至關 重要。
[0004] 近年來，隨著分子生物學技術的迅速發展及在醫學中的廣泛應用，利用基因工程 技術對病原體進行新型疫苗的研制引起了人們的廣泛關注。Lightowlers等發現Eg95為 一種24. 5kDa的天然六鉤蝴抗原，其編碼基因全長715bp，其中的462bp基因可編碼153個 氨基酸的蛋白質，分子量為16. 5kDa。氨基酸序列分析發現Eg95蛋白含纖連蛋白III型 結構域，與免疫球蛋白超家族、細胞粘附分子、細胞表面受體及糖結合蛋白有部分同源性， 在Eg六鉤蝴入侵小腸絨毛上皮的過程中起重要作用。目前細胞粒棘球蝴蟲EG95重組疫 苗在人工感染的牛和羊群獲得了較好的免疫保護水平（Lightowlers麗，etc，Parasite Immunol. 1996, 18(9) :457-462)，但該疫苗表達產物在大腸桿菌中絕大部分仍以不可溶的 包涵體形式存在。在制備疫苗時，由于重復的蛋白變性復性，導致其抗原性降低而且也大大 增加了抗原的生產成本，且抗原純度較低。此外，為了提高其免疫源性，需添加 Quil-A作 為佐劑，但該佐劑具有溶血等副作用，大大限制了該疫苗在人類的推廣應用（Lightowlers， Parasit〇l〇gy，2006, S27-S42)。因此，急需一種用于人和家畜等包蟲病中間宿主預防用的 新型棘球蝴疫苗。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種截短的羊包蟲EG95可溶性抗 原及其制備方法。
[0006] 本發明的發明原理為：Eg95為一種24. 5kDa的天然六鉤蝴抗原，在六鉤蝴入侵小 腸絨毛上皮的過程中起重要作用。目前細胞粒棘球蝴蟲EG95重組疫苗在人工感染的牛和 羊群獲得了較好的免疫保護水平，但該疫苗表達產物在大腸桿菌中絕大部分仍以不可溶的 包涵體形式存在，在制備疫苗時，由于變性、復性的操作導致其抗原性降低而且也大大增加 了抗原的生產成，且抗原純度較低。本發明嘗試將其5-信號肽序列和3-疏水區域去除，保 留中間的親水區域，將Eg95進行可溶性表達，并用其免疫，比較其免疫效果差異。此外，為 了提高其免疫源性，需添加 Quil-A作為佐劑，但該佐劑具有溶血等副作用，大大限制了該 疫苗在人類的推廣應用，鋁佐劑是目前普遍被批準用于人類疫苗的主要佐劑，不僅能減少 抗原用量，還能增強機體的免疫應答。本發明將可溶的棘球蝴Eg95抗原亞單位疫苗與氫氧 化鋁佐劑進行組合，這項發明為包蟲病中間宿主提供免疫用新型棘球蝴疫苗。
[0007] 本發明提供了一種用于人和家畜等包蟲病中間宿主預防用的新型棘球蝴疫苗，該 新型棘球蝴疫苗包括可溶性表達的Eg95重組蛋白及氫氧化鋁免疫佐劑混合物，能夠有效 刺激機體產生良好的細胞免疫及體液免疫。
[0008] 在本發明的一個實施方案中，所述新型棘球蝴疫苗包括可溶性表達的Eg95重組 蛋白及氫氧化鋁免疫佐劑混合物。
[0009] 在本發明的優選實施方案中，所述新型棘球蝴疫苗包括可溶性表達的Eg95重組 蛋白。
[0010] 新型棘球蝴疫苗中可溶性表達的Eg95重組蛋白及氫氧化鋁免疫佐劑按體積比5 : 1進行混合。
[0011] 在本發明的一個具體實施方案中，所述可溶性表達的Eg95重組蛋白的編碼基因 具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。可溶性表達的Eg95重組蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0012] 本發明對所述新型棘球蝴疫苗進行了免疫試驗，實驗結果證明：（1)本發明所述 新型棘球蝴疫苗時，免疫后6周（二免后2周），可有效刺激機體產生較高水平的抗體，抗 體能產生足夠的免疫保護，且保護效果持續到免疫后40周；(2)本發明所述新型棘球蝴疫 苗免疫后3天誘導機體產生了較高水平的TNF-α，優于單一 Eg95重組蛋白和商品化疫苗； (3)本發明所述新型棘球蝴疫苗免疫時，其免疫效果優于單一 Eg95重組蛋白；(4)本發明所 述新型棘球蝴疫苗免疫時，其免疫效果優于商品化疫苗。（5)本發明所述新型棘球蝴疫苗免 疫時無不良反應。
[0013] 另一方面，本發明提供了用于制備截短的羊包蟲EG95可溶性抗原的引物，其中包 括1對引物，引物對的核苷酸序列為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0014] 另一方面，本發明提供了所述引物在制備截短的羊包蟲EG95可溶性抗原中的用 途。
[0015] 另一方面，本發明提供了一種制備截短的羊包蟲EG95可溶性抗原的方法，該方法 包括：（a) PCR擴增獲得截短的羊包蟲EG95編碼基因；(b)重組表達步驟（a)獲得的編碼基 因得到重組蛋白；（c)將步驟（b)獲得的重組蛋白進行純化得到羊包蟲EG95可溶性重組抗 原。
[0016] 在一個實施方案中，PCR擴增所用引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4〇
[0017] 在一個實施方案中，PCR擴增的截短的羊包蟲EG95編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1〇
[0018] 在一個實施方案中，其中步驟（b)中的重組表達的具體操作為：將含SEQ ID NO: 1、的重組質粒PET分別轉化至E. coli BL21(DE3)感受態細胞中，挑取單菌落接種至 IOmL含終濃度25 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37°C 200r/min震蕩培養過夜，將Iml 培養物接種于100mL含終濃度25 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37°C 200r/min震蕩培 養至0D_nm = (λ 6時，加入終濃度為ImM的IPTG，22°C，160rpm震蕩培養10h。6000r/min 離心10min收集菌體，用40mL PBS (pH 7. 4)洗滌兩次，IOml PBS (pH 7. 4)重懸后，冰浴超聲 破碎菌體，破碎后混合物經12000rpm，4°C離心30min后取上清。
[0019] 在一個實施方案中，其中步驟（c)中重組蛋白的純化具體操作為：將蛋白上清液 經q)0.22,um濾膜過濾，用金屬鎳親和層析柱按操作手冊在蛋白純化儀進行純化，并用脫鹽 層析柱進行脫鹽，將重組蛋白置換到PBS (ρΗ7. 4)緩沖溶液中。
[0020] 在一個實施方案中，其中新型棘球蝴疫苗中可溶性表達的Eg95重組蛋白及氫氧 化鋁免疫佐劑按體積比5:1混合。
[0021] 另一方面，本發明提供了一種用于檢測EG95抗體的ELISA方法，該方法包括下述 步驟：
[0022] (1)用碳酸鹽緩沖液（包被液）稀釋EG95包被抗原，包被ELISA板子過夜；（2)用 PBS-吐溫20洗液，洗滌酶標板3次，每次3分鐘；（3)每孔加入200 μ 1封閉液，37°C 1小 時，進行封閉；(4)重復（2)進行洗版；(5)將待檢血清應進行1:200倍稀釋，每孔加入經過 稀釋的被檢血清100 μ 1，37°C 45分鐘，同時設陽性血清和陰性血清對照；（6)重復（2)進 行洗版；（7)將兔抗羊IgG HPR按使用說明書進行稀釋，每孔100 μ 1，37°C 45分鐘；（8)重 復⑵進行洗版；（9)每孔加入100 μ I OPD底物溶液，37°C 15分鐘；（10)每孔加入IM硫酸 50 μ 1終止反應；（11)在492nm處用酶標讀數儀測定OD值。
[0023] 該方法判定標準為：當10只注射被檢疫苗二免后2周試驗羊血清有8只以上血清 OD值彡I. 0時，且10只注射被檢疫苗二免后2周試驗羊血清P/N值均彡2. 0,視為疫苗免 疫后已產生有效抗體，被檢疫苗判為合格，否則，為不合格。當任何試驗羊在首免前采集的 血清ELISA OD值多0. 4,則應重復ELISA試驗，如果ELISA重復試驗結果仍然不符合要求， 則應另用新的試驗羊進行重復檢驗。
【附圖說明】：
[0024] 圖1.免疫后不同時間EG95抗體檢測結果。
[0025] 圖2.免疫后抗體變化動態監測。
[0026] 圖3.羊免疫后細胞因子檢測結果。
[0027] 本發明的優點
[0028] 本發明的新型棘球蝴疫苗具有免疫原性高、純度高、成本低廉、副作用小等優點， 因此可用于人和家畜的包蟲病的預防免疫。
[0029] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0030] 本領域技術人員應理解，這些實施例僅用于說明本發明而絕不對本發明的范圍構 成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術 人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參 考。下列實施例中未注明