處理豬角膜以脫細胞的方法

專利名稱：處理豬角膜以脫細胞的方法
技術領域：
本發明涉及處理豬角膜的方法，更具體而言，涉及處理豬角膜以脫細胞的方法。
背景技術：
角膜是折射光線的器官，其占眼球最外層膜的六分之一。角膜總共由五個層構成， 即，角膜上皮層、鮑曼氏膜(Bowman' s membrane)、角膜基質層(也稱作固有質層)、戴氏膜 (Descemet' s membrane)和角膜內皮層。角膜上皮由5至6層細胞構成。角膜上皮的基 底細胞來自邊緣的干細胞，向角膜的中心遷移并在7日內脫落。鮑曼氏膜由非細胞的膠原 纖維構成，并且是無色透明的。然而，鮑曼氏膜不能再生，在外科手術或外傷傷害時通常會 出現疤痕。角膜基質占角膜厚度的約90%，并具有均勻排列的尺寸一致的細胞。戴氏膜由 3至4層細胞構成，并被認為是角膜內皮細胞的基膜。角膜內皮是單層細胞，由特化的內皮 細胞構成，在再生方面被嚴格限制，并且其細胞數量隨年齡減少。當細胞數量減少時，細胞 尺寸增加以填補空隙。同時，因角膜透明性喪失而導致的角膜盲是僅次于白內障的引起視力喪失的主要 原因。眼外傷和角膜潰瘍每年使150萬 200萬的人們失明。對于這種失明唯一有效的治 療是移植人類供體角膜(也稱作“角膜移植術”)。供體角膜的短缺使得需要異體移植的替 代方式。關于角膜置換已經進行了大量研究。合成置換材料包括人工角膜和天然角膜等材 料，這些材料使用培養的細胞和細胞外基質(ECM)進行組織工程化。然而，目前，這些材料因與生物相容性和光學及機械性質有關的問題而沒有得到 廣泛應用，而利用其它動物角膜代替人類角膜的異種移植是發展最快的方法。豬角膜是最具前景的人類角膜置換物，因為它們具有與人類角膜相當的折射率和 尺寸，將豬用于移植被認為是倫理學可接受的，并且基因修飾的豬(例如，α_1，3-半乳糖 基轉移酶敲除豬和hDAF轉基因豬)已被開發并最終進入了臨床實踐。然而，傳統研究報道了角膜全厚度異種移植會引發嚴重的免疫排斥。另外， 本發明人報道的研究顯示，即使在不存在角膜內皮的情況下，板層角膜異種移植也 會遭遇免疫排斥
0這意味著角膜細胞(角膜基質細胞)也可以引起免疫排斥。因此，本發明的發明人考慮到，對于具有正常內皮細胞但患有基質渾濁的患者，無 細胞的豬角膜基質(已經脫去細胞)可用作板層角膜異種移植的供體組織。此外，角膜移 植的新近范式已經由置換整個區域的全厚度角膜移植改變為僅置換病變區域的部分厚度 的角膜移植。所述方法被認為在臨床實踐中更為有用。有大量無細胞生物材料被用于修復各種器官中的缺陷，并且研究了各種脫細胞方法。然而，關于對角膜基質脫細胞的方法還沒有進行深入研究，特別是關于有效處理 角膜同時減小移植后的免疫反應及致病性并保持角膜透明的方法還沒有進行研究。

發明內容
因此，鑒于上述問題進行了本發明，本發明的一個目的是提供有效處理角膜同時 減小角膜移植術后的免疫反應及致病性并保持角膜透明的方法。根據本發明，上述和其它目的可以通過提供處理豬角膜的方法而實現，所述方法 包括將摘出的豬角膜浸入NaCl水溶液中；將該豬角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和 洗滌該豬角膜。NaCl水溶液和胰蛋白酶/EDTA水溶液的使用能夠較少免疫反應和炎癥，有助于脫 細胞。NaCl水溶液可以含有1. OM 2. OM NaCl。將豬角膜浸入NaCl水溶液中的步驟可以在35°C 39°C的溫度進行12小時 36 小時。胰蛋白酶/EDTA水溶液可以含有0.01% 0. 10% (w/v)的胰蛋白酶和0.01% 0. 05% (w/v)的 EDTA。將豬角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中的步驟可以在35°C 39°C的溫度進行36 小時 60小時。洗滌可以使用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為洗滌液來進行。


通過以下詳細描述并結合附圖，本發明的上述和其它目的、特征及其它優點將會 得到更加清楚的理解，附圖中圖1是下述各組的豬角膜的圖像未處理的對照組(A)、3次凍融組(B)、高滲鹽水 (hypertonic saline) (C)(hyperosmolar glycerol) (D)、月夷胃白
散酶(Dispase)/SDS組(E)和DNase/RNase組(F)。3次凍融組、高滲鹽水組和高滲透甘油 組的角膜保持光學透明性，而胰蛋白酶/分散酶/SDS組和DNase/RNase組的角膜失去了光 學透明性；圖2顯示了來自下述各組的蘇木精_曙紅染色的豬角膜對照組(A)、3次凍融組 (B)、高滲鹽水組(C)、高滲透甘油組(D)、胰蛋白酶/分散酶/SDS組(E)和DNase/RNase組 (F)。3次凍融組、高滲鹽水組、高滲透甘油組和胰蛋白酶/分散酶/SDS組幾乎不具有細胞， 而DNase/RNase組具有嚴重變形的膠原，且不具任何細胞結構；圖3顯示了下述各組的豬角膜的TUNEL測試結果對照組(A)、冷凍組(B)、3次 凍融組(C)、高滲鹽水組(D)、高滲透甘油組(E)、胰蛋白酶/分散酶/SDS組(F)和DNase/ RNase組(G)。對照組和冷凍組不具有凋亡細胞。另一方面，高滲透甘油組和胰蛋白酶/分 散酶/SDS組具有許多凋亡細胞；圖4是下述各組的豬角膜的透射電子顯微鏡(TEM)圖像對照組(A，B)、3次凍融 組(C，D)、高滲鹽水組(E，F)、高滲透甘油組(G，H)、胰蛋白酶/分散酶/SDS組(I，J)和DNase/RNase組(K，L)。對照組具有在結構良好的膠原束之間的正常角膜細胞。另一方面， 其它組的角膜具有嚴重受損的細胞。胰蛋白酶/分散酶/SDS組和DNase/RNase組具有過 于破碎的膠原纖維且沒有細胞結構；圖5顯示了由正常角膜培養的豬角膜細胞(A，B，C)的形態和由凍融三次的角膜培 養的豬角膜細胞(D，E，F)的形態。與正常角膜相比，3次凍融的豬角膜在術后1周(A，D)、 2周(B，E)和3周(C，F)生長了較少的細胞；圖6是兔角膜的圖像，在所述兔角膜中板層移植了豬角膜。新鮮的豬角膜(對照 組)至術后2周㈧仍保持透明性，但是在術后4周⑶顯示排斥反應。冷凍的豬角膜(冷 凍組)在術后1個月(C)也顯示了排斥反應，并且高滲透甘油處理的角膜(高滲透甘油組) 較早開始發炎且變得不透明(D)。移植后，胰蛋白酶/分散酶/SDS組和DNase/RNase組(分 別為E，F)發生了融合。(G)和(H)分別顯示移植后1個月(G)和移植后2個月(H)的3次 凍融組的豬角膜。此外，高滲鹽水組的角膜即使在2個月(L)和6個月(I)后還保持透明 性；圖7顯示了由豬至兔的板層移植1個月后的蘇木精-曙紅的染色結果。對照組具 有炎性細胞向供體移植連接處的嚴重的浸潤(A)。在冷凍組(B)、3次凍融組(C)和高滲透 甘油組(D)中也觀察到許多炎性細胞。另一方面，高滲鹽水組的移植物沒有炎性細胞，并且 在移植后1個月(E)和移植后6個月(F)中被再細胞化(recellularized)；圖8顯示了⑶3+和Hoechst 33342免疫組織化學染色。在術后一個月顯示排斥 反應的對照組的移植物中觀察到許多⑶3+細胞(A)，而高滲鹽水組的豬角膜移植物不具有 ⑶3+細胞(B)。術后1個月在整個高滲鹽水處理的移植物中觀察到Hoechst 33342染色的 角膜細胞(D)。在此情況中，所述角膜細胞的數量與正常的兔角膜基質相當；圖9是術后1個月㈧、3個月⑶和6個月(C)的兔角膜的體內片段的圖像，所 述兔角膜中移植了高滲鹽水處理的豬角膜。觀察移植物-宿主連接處(箭頭)，其意味著豬 移植物適當地結合到了受體的角膜中。在移植后6個月時，移植的角膜完全結合到基體角 膜中，并且連接處已不容易看到；并且圖10是比較總角膜厚度與所移植角膜的移植物厚度的圖(A)，和比較所移植角膜 與對側的未移植的眼球的角膜之間的總角膜厚度的圖(B)。
具體實施例方式下面將詳細闡釋本發明。用于板層移植或覆蓋移植的最適宜的角膜置換物必須表現出與人類角膜相似的 機械和光學性質、不會引起免疫反應、對于鄰近的眼組織無毒并且具有功能活性的細胞外基質。角膜細胞外基質重要的兩個原因如下。首先，細胞外基質起到生物支架的作用，所述生物支架提供了角膜恢復和再生所 需的最適宜的微環境。其次，由膠原形成的占角膜干重的70%以上的細胞外基質具有薄膠原纖維的板層 形態，因而對于角膜的透明性是不可或缺的。因此，盡管為開發角膜置換物付出了艱巨的努力，但是尚未獲得可臨床應用的置
5換物。此外，本發明人認為，豬角膜具有用于人類角膜的細胞外基質的潛力，因為它們具 有與人類角膜相似的物理和折射性質。根據本發明人以前的研究，盡管是前板層移植，豬角 膜還是顯示了術后4周的排斥反應
因此，本發明人決定通過利用物理處理(冷凍、重復凍融過程)、化學處理(高滲 (hypertonic)、高滲透(hyperosmolar))或酶處理破壞細胞來減少豬角膜的免疫反應。其 原因在于，膠原具有低抗原性，而細胞具有高抗原性[Dufrane，D.，Cornu, 0.，Delloye, C. , Schneider, Y.J. Physical and chemicalprocessing for a human dura mater substitute. Biomaterials 23,2979, 2002 ；Minami, A. , Usui, Μ. , Ishii, S. , Kobayashi, H. The in vivo effects of variousimmunoreactive treatments on allogeneic tendon grafts. J Hand Surg[Am]8，888，19，1983.]。作為本發明的測試結果，“1. 5mol NaCl，0· 05%胰蛋白酶和0. 02% EDTA”的實驗 組減少了免疫反應，最有效地保存了膠原結構，適宜結合在宿主角膜中，并且保持了角膜透 明性，在部分移植至兔中之后6個月中沒有引起發炎或排斥反應。此外，一個比較實驗組(S卩“冷凍組”)沒有從豬角膜中充分地除去細胞，并且與對 照組(即新鮮豬角膜組)同時經歷了排斥反應。此外，另一比較實驗組(即“3次凍融組”)因處理后留下的細胞殘留物而在移植 后2個月引發了排斥反應。此外，又一比較實驗組(即“高滲透甘油組”或“胰蛋白酶/分散酶/SDS組”)引 發了嚴重的細胞凋亡從而得到了死亡細胞碎片，觸發了兔眼球的免疫反應，并經歷了較早 的排斥反應。此外，其它比較實驗組(即“胰蛋白酶/分散酶/SDS組”和“Dnase/Rnase組”)嚴 重地破壞了膠原結構，導致豬角膜的所有膠原纖維被除去和斷裂。另外，所處理的豬角膜失 去了透明性并且被融合。此外，本發明的值得注意的問題在于，比較實驗組(即高滲鹽水組)的脫細胞化的 豬角膜基質在移植后與宿主角膜干細胞(sternal cell) 一起被再細胞化。高滲鹽水組的總 角膜厚度和移植物厚度增加，與對側的未移植的眼睛相似。這表明，豬角膜基質中所再次 增殖的角膜細胞在功能上是活性的，并且產生細胞外基質。脫細胞化的移植物的再細胞化 非常重要，因為角膜細胞在角膜基質的維持和代謝中扮演了必不可少的角色[McLaughlin， C. R.，Fagerholm，P.，Muzakare，L，Lagali，N.，Forrester，J. V.，Kuffova，L，Rafat，Μ. Α.， Liu, Y.，Shinozaki，N· , Vascotto, S. G.，Munger，R· ,Griffith,Μ. Regeneration of corneal cells and nerves in an implanted collagencorneal substitute. Cornea 27,580, 2008 ；Salvalaio，G.，Fasolo，A.，Bruni，Α.，Frigo，A. C.，Favaro, Ε.，Ponzin，D. Improved preparation and preservation ofhuman keratoplasty lenticules.Ophthalmic Res 35，313，2003 ；Muller, L. J. , Pels, Ε. , Vrensen, G. F. J. M. The effects of organ-culture
6on the density ofkeratocytes and collagen fibers in human corneas. Cornea 20,80, 2004]。下面將提供實例以便進一步理解本發明。以下實例僅處于說明性目的，因而不用 于限制本發明的范圍。實施例和比較例本發明的實施例(實驗組)和比較例(比較實驗組)的樣品制 備豬角膜獲自剛死的兄妹交配的小型成年豬(12月齡)。使用乙醇處理上皮并隨后 將其剝下。然后，在攪拌下每隔30分鐘使用磷酸鹽緩沖液(PBS)和抗生素處理角膜3次。 使用直徑為 8. Omm 的環鉆(Tr印hine) (Kaiindustries Cp. Ltd, Seki city，東京)由豬角 膜獲得250 μ m厚的前板層。如下表1中所示，將角膜分為7組，并按照以下程序進行處理。每組包括5只眼睛 (η = 5)(1)未處理的新鮮角膜(對照組)，(2)在_20°C冷凍1周4然后在室溫解凍的角 膜(冷凍組)，(3)通過在含有液氮的50ml的試管中冷凍15分鐘，迅速在37°C解凍，并重 復該凍融過程3次而獲得的角膜(3次凍融組)，(4)通過浸入1. 5M NaCl溶液，在37°C保 持24小時，浸入37°C的0. 05%胰蛋白酶/0. 02% EDTA水溶液48小時，并使用PBS洗滌3 次而獲得的角膜(高滲鹽水組)，(5)通過在4°C的98%甘油溶液中儲存21天，使用PBS洗 滌，在37°C的0. 05%胰蛋白酶/0. 02% EDTA溶液中保持48小時，并使用PBS洗滌3次而獲 得的角膜(高滲透甘油組)，(6)通過浸入4°C的0. 25%胰蛋白酶溶液24小時，浸入室溫的 0. 十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液6小時，使用4°C的560單位/1的分散酶溶液處理12小 時，使用室溫的0. 1% SDS溶液處理6小時，并使用PBS洗滌三次而獲得的角膜(胰蛋白酶 /分散酶/SDS組)，(7)通過浸入25°C的0. IM NaOH溶液2小時，在攪拌下使用40U/mL的 Dnase和RNase處理并使用PBS徹底洗滌而獲得的角膜(Dnase/RNase組)。在用于各組之前，將角膜在4°C儲存。表 1
7 實驗例1 根據上表1中所示的方法脫細胞化的角膜基質的體外評價1.宏觀分析宏觀分析揭示，對照組、冷凍組、3次凍融組、高滲鹽水處理組和高滲透甘油處理組 的角膜保持透明，而胰蛋白酶/分散酶/SDS處理組和DNase/RNase處理組的角膜變得不透 明(圖1)。2.微觀分析首先，將各組的豬角膜切片并以蘇木精和曙紅(H&E)染色法染色。然后，在光學顯 微鏡(Olympus Optical Co. Ltd.，日本東京)下觀察H&E-染色的切片。H&E染色的3次凍融組、高滲鹽水組、高滲透甘油組和胰蛋白酶/分散酶/SDS組 幾乎沒有細胞。另一方面，對照組和冷凍組具有許多遍布于角膜基質中的細胞核(圖2)。 Dnase/Rnase組不具有細胞并且膠原結構發生了嚴重的變形，這是在宏觀分析中所觀察到 的角膜不透明的內在原因。此外，使用ApOpTag Plus Fluorescein原位細胞凋亡檢測試劑盒(Chemicon international,Billerica,MA,USA)通過TUNEL測試來分析豬角膜的脫細胞化機理。使用 熒光顯微鏡(BX 61，Olympus, Shinjuku，日本東京)觀察凋亡細胞。作為TUNEL測試的結果，高滲透甘油組和胰蛋白酶/分散酶/SDS組具有相當多的 陽性染色細胞核，3次凍融組局部具有陽性染色細胞核，高滲鹽水組幾乎不具有細胞核(圖 3)。作為TUNEL測試的結果，對照組和冷凍組的細胞核沒有被陽性染色。這就是這些 組沒有經歷細胞凋亡的原因。 此外，Dnase/Rnase組經過H&E和TUNEL染色而未染色的原因在于，Dnase和Rnase 是在不存在細胞碎片或細胞核碎片下處理的。
此外，為評價對于角膜細胞和膠原的細微傷害，將角膜在2. 5%的戊二醛PBS(pH 7. 2)中固定，保持4°C過夜，并在四氧化鋨中固定1小時。再次洗滌樣品，并使用連續稀釋的 乙醇對樣品脫水。將樣品安裝在基棒(stub)上，濺射涂覆金，然后通過TEM(JEM-1400JE0L， 日本東京)觀察。從TEM觀察結果可以看出，對照組(即新鮮的角膜)具有位于結構良好的膠原薄 片之間的正常角膜細胞。然而，3次凍融組和高滲透甘油組因凋亡的角膜細胞殘留物而承受 了顯著的細胞損傷(圖4)。特別是，高滲鹽水組的角膜不具有可見的細胞或其殘留物，但是 具有正常保存和排列的膠原束。另一方面，胰蛋白酶/分散酶/SDS組和Dnase/RNase組的 角膜因受到嚴重破壞的細胞質而只有空洞，不具有細胞結構。另外，對于這兩個組，膠原纖 維消失或嚴重片段化，表明了膠原薄片形態的破壞。3.角膜細胞活力的評價為評價角膜細胞活力，將角膜破碎并在用于角膜細胞培養的培養基(DMEM/F-12， 10% FBS和青霉素-鏈霉素(Lonza，BaselJi^i))中溫育。與對照組中的角膜細胞相比，3次凍融組的角膜細胞生長非常緩慢(圖5)。然而， 盡管培養了 21天，但高滲鹽水組、高滲透甘油組、胰蛋白酶/分散酶/SDS組和Dnase/Rnase 組的角膜細胞沒有生長。實驗例2 關于異種移植模型的脫細胞化角膜基質的體內效率的鑒定1.對于角膜異種移植的臨床過程的評價使用2kg 3kg的成年新西蘭白兔(Orient Bio Inc.，Seoungnam，韓國)作為本 實驗例2中的角膜移植術的受體動物。通過肌肉內施用lOmg/kg的唑拉西泮(Zoletil ， Yuhan Corp.，韓國首爾)和6. 8mg/kg的鹽酸賽拉嗪(Rompun ，Bayer,德國法蘭克福) 麻醉所述兔。為移植豬角膜，使用直徑為8. Omm的環鉆標記豬角膜的250 μ m厚的前板層移植 物，并使用彎月形刀(crescent knife) (Alcon Surgical, Fortfforth, TX, USA)將其手工 分離。使用10-0尼龍縫合線(Ethicon，Somerville, NJ, USA)通過間斷縫合，用8針將豬 角膜的前板層移植物(各組N= 7)縫入兔的受體角膜中。一周時拆除所有縫合線。進行 全部厚度的眼瞼縫合并保持1周。對于手術的兔每日施用兩次左氧氟沙星抗生素眼藥水 (Cravit , Santen Pharmaceutical Co.，Ltd.，Osaka,日本)，并通過肌肉內注射對其施 用全身抗生素(.Gentamicin ，40mg/kg 體重；AbbottLaboratories, North Chicago, IL, USA)。每月使用裂隙燈顯微鏡觀察移植的角膜三次。此處，排斥反應被定義為移植物完 全失去透明性的狀況(即，角膜周邊及虹膜結構被移植物完全遮蔽的狀況)。作為觀察結果，對照組、冷凍組、3次凍融組、高滲鹽水組和高滲透甘油組的角膜被 適當地并入移植的兔角膜中，并且在一周后被宿主上皮完全再上皮化。對照組和冷凍組的 豬角膜基質在移植到兔中2周內都是透明的。然而，之后角膜變得不透明并且在移植后4周中所有移植的角膜完全不透明。3次 凍融組的移植物透明了 1個月，但是在術后2個月顯示了排斥反應。高滲鹽水組的豬角膜 在移植后6個月都保持光學透明，且無排斥反應或炎癥。
9的兔眼發生了炎癥和新生血管形 成，于是變得完全不透明。此外，胰蛋白酶/分散酶/SDS組和Dnase/Rnase組的豬角膜板層在移植到兔中后 馬上融合，移植物失去透明性。各組的移植物的存活時段和角膜圖像分別如下表2和圖6所示。表2
組別數量存活時段(天)對照組720，20，28，28，30，30，34冷凍組720，20，20，24，24，28，283次凍融組743,43,47,47,60,60,60高滲鹽水(NaCl)組7> 30，> 60，> 180，> 180，> 180，> 180，> 180高滲透甘油組716，18，18，18,20,20,20胰蛋白酶/分散酶/SDS組70,0,0,0,0,0,0Dnase/RNase 70,0,0,0,0,0,02.角膜異種移植的組織學觀察在術后1、2和6個月，殺死各組的兔并從其上取出角膜。使用H&E染色或免疫熒光染色來染色角膜片段。在CD3+細胞存在下對角膜進行 免疫熒光染色。將獲得的角膜在10%的中性緩沖甲醛中固定并在4°C溫育過夜。將角膜切 為5 μ m厚，于60°C干燥2小時，并在二甲苯中脫蠟。然后，將獲得的角膜部分順序使用蛋白 Sl K(20 μ g/ml, Sigma, St. Louis, Missouri, USA) ,5% H2O2 和 0. 3% triton X-100 處理，并 補充的血清。使用抗兔CD3+的單克隆抗體作為一抗，并使用PBS作為陰性對照。使用 FITC-偶聯的山羊抗兔 IgG(l 1000, Southernbiotech, Birmingham, AL, USA)作為二抗， 并且使用Hoechst 33342 (Sigma)進行對比染色。然后，使用熒光顯微鏡觀察染色的⑶3+細 胞。觀察結果確認，與臨床檢驗相似，H&E染色顯示出排斥反應和炎性細胞的嚴重浸 潤。除了高滲鹽水組之外的組顯示了在供體-移植物連接處中并向移植物中生長的內源的 角膜新生血管形成(圖7)。然而，高滲鹽水組的豬角膜在術后6個月間沒有發炎和新生血 管形成。此外，經免疫組織化學染色，高滲鹽水組的豬角膜移植物不具有⑶3+陽性細胞，而 對照組的豬角膜移植物具有許多⑶3+陽性淋巴細胞(圖8)。此外，在使用Hoechst 33342 染色并移植到兔中一個月后，高滲鹽水組的脫細胞化的豬角膜移植物再次增殖。這表示移
10植物針對宿主角膜細胞的再次增殖(圖8)。3.角膜異種移植的體內片段圖像研究、角膜厚度測量和組織學結果利用前部光學相干斷層成像(opticalcoherence tomography) (OCT ；Visante OCT Model 1000,Carl Zeiss Meditec Inc. ,Dublin,CA,USA)每月獲得全厚度角膜的橫截 面的前部和后部圖像。作為斷層成像的結果，豬角膜被移植到兔角膜中的組織片段完全結合在高滲鹽水 組的移植物中，并成功地重構在兔角膜中(圖9)。此外，對于角膜厚度的測量，在體內使用前部OCT測量總角膜厚度和移植的角膜 基質厚度。通過測量角膜上皮與角膜內皮之間的距離和角膜內皮與移植位點之間的距離來 計算角膜厚度。使用超聲波測厚儀(Pachymeter,Quantel Medical, Clermont-Ferrand, ^ 國)測量總角膜厚度。作為角膜厚度的順序測量的結果，顯示移植的豬角膜板層的厚度隨著總角膜厚度 的增加而增加(圖10A)。另外，移植的兔角膜就像對側的未移植的眼睛那樣正常生長。從上述描述中可以明顯看出，本發明提供了既不引發炎癥又不引發免疫反應的處 理豬角膜的方法。通過所述方法脫細胞化的豬角膜基質可以在移植后與角膜細胞一起再細 胞化。因此，脫細胞化的豬角膜基質可用于通過體外培養和組織工程化人類角膜細胞而制 備的角膜置換物。雖然出于說明性目的公開了本發明的優選實施方式，但是本領域技術人員知道， 可以進行各種修改、添加和替代，而不偏離所附權利要求中公開的本發明的范圍和精神。
1權利要求
一種處理豬角膜的方法，所述方法包括將摘出的豬角膜浸入NaCl水溶液中；將所述豬角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和洗滌所述豬角膜。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述NaCl水溶液含有1.OM 2. OM的NaCl。
3.如權利要求2所述的方法，其中，將所述豬角膜浸入NaCl水溶液中的步驟在35°C 39°C的溫度進行12小時 36小時。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述胰蛋白酶/EDTA水溶液含有0.01% 0. 10% (w/v)胰蛋白酶和 0. 01% 0. 05% (w/v)EDTA0
5.如權利要求4所述的方法，其中，將所述豬角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中的步驟 在35°C 39°C的溫度進行36小時 60小時。
6.如權利要求1所述的方法，其中，洗滌步驟使用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為洗滌液來進行。
全文摘要
本發明公開了一種用于處理豬角膜的方法，所述方法使用NaCl水溶液和胰蛋白酶/EDTA水溶液對摘出的豬角膜脫細胞化。通過所述方法處理的豬角膜既不會引起炎癥也不會引起免疫排斥。通過所述方法脫細胞化的豬角膜基質可以在移植后與宿主角膜細胞一起再細胞化。
文檔編號A61F2/14GK101917932SQ200980100884
公開日2010年12月15日 申請日期2009年4月6日 優先權日2009年3月4日
發明者吳周娟, 金美昑, 魏元良 申請人:首爾大學校產學協力團