專利名稱：一種脫細胞角膜基質及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫療器械領域，具體地說是涉及一種脫細胞角膜基質及其制備方法。
背景技術：
角膜移植是治療因感染、外傷及先天異常等各種病因導致的角膜疾病、缺損、混濁、屈光度異常的重要方法之一，由于供體來源匱乏使許多病人不能得到及時有效地治療。合成材料制作的人工角膜由于生物相容性差，移植后難以和眼周組織融合，易產生脫失、漏水及前后膜等并發癥。
翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，具有術后容易復發的特點，單純的翼狀胬肉切除聯合角膜緣移植可以降低該疾病的術后復發率。但目前供體材料不足。
眼表包括角膜、結膜上皮和淚膜三個部分。針對不同原因引起的眼表疾病的治療即包括對這三個方面健康的有效維持和重建。
角膜屈光力占眼球總屈光力的2/3，以手術方法改變眼的屈光狀態可用于矯正不同類型的屈光不正。
組織工程的支架材料起著為細胞提供營養、為細胞增殖提供場所以及決定所修復組織的形狀大小的作用。天然高分子材料如膠原、透明質酸、甲殼素及其衍生物及多糖類高分子物質其力學性能欠佳，疏水性太強，降解過快，不利于細胞營養物質向材料內擴散。人工合成的高分子材料(如聚乳酸、聚乙醇酸)等也用于作為組織工程角膜的載體，其透明性和穩定性較差，無菌性炎性反應率較高，不適于臨床試驗。羊膜組織雖可提供連續的基底膜，含有膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白及各種整合蛋白，這些成分利于上皮細胞的分化移行，但因材料本身太薄并不適于角膜基質深層病變的修復。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供一種脫細胞角膜基質，該脫細胞角膜基質用于修補眼表組織缺損、重建及塑形眼表組織、治療眼表疾病和用作構建組織工程化生物角膜的載體，以期為臨床眼表手術提供充足的材料來源。
一種脫細胞角膜基質，主要由數百個相互平行的膠原纖維板層構成，膠原纖維板層之間有細胞被脫去后形成的空隙。
所述脫細胞角膜基質，其基本成分包括膠原纖維、角膜基質(包括粘多蛋白及糖蛋白等)以及脫細胞處理后殘留的胞膜和胞漿成分。
所述的脫細胞角膜基質的厚度優選為0.01～5.0mm。
所述的脫細胞角膜基質優選為直徑是1mm～40mm的圓形。
所述脫細胞角膜基質還可以攜帶藥物和/或細胞因子。
上述脫細胞角膜基質的制備方法，采取異種(動物類)或同種異體角膜基質為原料，經過去細胞處理，得到所述脫細胞角膜基質。
去細胞處理可以采用細胞分離法(如過濾、離心、沉降等)，也可以采用細胞破碎法(如機械破碎之高壓勻漿、珠磨、超聲破碎等、化學和生物化學滲透之酸堿處理、化學試劑處理、酶溶等、物理滲透之滲透壓沖擊、凍結-融化法等)。
優選地，去細胞處理為化學滲透法，具體步驟如下以濃度為0.05～5％的陰離子表面活性劑SDS溶液在4～50℃的條件下處理異種角膜基質4～24小時。該方法在完全去除角膜組織細胞的同時，未構成對角膜三維立體結構及其基質成分的破壞，使角膜最重要的特性-透明性和韌性得以充分保留。
去細胞處理還可以為另一種化學滲透法，步驟如下以濃度為0.01～5％的去垢劑TritonX-100溶液在4～50℃的條件下處理異種角膜基質24～48小時，后以胰酶消化2-12小時。
所述脫細胞角膜基質還可以采取去除異種抗原處理，去除異種抗原處理的方法可以采用初級的生物分離技術(如膜分離、萃取、沉淀分級和泡沫分離等)，也可以采用其他生物分離技術(如吸附、色譜、電泳以及電色譜等)。
制備本發明所述的脫細胞角膜基質可以采用異種(動物類)或同種異體的部分角膜，也可以是全部角膜，甚至包括部分與之相連的鞏膜、結膜。可以是新鮮組織，也可以是經過保存的組織。在一定作用條件下(如經酶處理、破膜劑處理)，完全脫去材料內的細胞成分，最大限度地去除組織內的病原微生物，降低或消除組織的抗原性，但保留其正常的基質纖維排列的三維結構。
通過在本發明制作的脫細胞角膜基質的表面負載相應細胞，可以構建出組織工程化生物角膜。由于脫細胞角膜基質具有一定的硬度和韌性，因此具有可加工性，能形成三維立體結構；可以加工成各種形狀，如圓形、月牙形等。可以是具有一定弧度，也可以呈平面狀。也可以制作成與待修復的受體眼表缺損厚度相一致的厚度，加工為等厚度的，則脫細胞角膜基質不具有屈光度，若加工為不等厚度，就可以具有相應的屈光度。
本發明所述的脫細胞角膜基質移植后可以長期存在或逐步降解，并呈高度透明狀態，具有受體的神經可以長入、受體細胞可以在其表面長期附著生長、免疫原性低和組織相容性佳的特點；還可以在制作加工或使用復水時，使其攜帶相關藥物和/或細胞因子，起到抑制新生血管長入和/或治療原發疾病的作用；在移植后神經可以長入基質內，受體的上皮細胞可以在基質表面附著生長；所述的脫細胞角膜基質還具有與受體眼表組織相似的熱穩定性。
本發明所述的脫細胞角膜基質制備方法簡單，易操作，所制備的脫細胞角膜基質具有以下優點1.源于生物材料，具有良好的支架作用，可作為安全、有效的生物學材料長期植入眼內。
2.可以用于修復因病變切除的角膜緣，緩解供體材料不足的矛盾。
3.帶結膜的脫細胞角結膜基質，即可作為纖維膠原支架，提供上皮生長的、健康的基質和基底膜，可用于重建眼表。
4.改變眼的屈光狀態時，可以通過改變基質的厚度，使其具有不同的屈光度數，借助角膜鏡片術等手術方法用于治療屈光不正。
另外，本發明涉及的脫細胞角膜基質通過體內及體外毒性試驗、刺激致敏試驗及免疫學等相關檢測，符合生物學評價標準，證實材料對受體安全可靠，不會構成對受體局部及全身的生物學危害。
具體實施例方式
本發明所述的一種脫細胞角膜基質及其制備方法，通過以下實施例進一步闡述。
實施例1一種脫細胞角膜基質，主要由數百個(100-250個左右)相互平行的膠原纖維板層構成，膠原纖維板層之間有細胞被脫去后形成的空隙。膠原纖維板層相互平行，大小一致，間隔相等，在膠原纖維板層之間的空隙中還含有角膜基質(包括粘多蛋白及糖蛋白等)以及脫細胞處理后殘留的胞膜和胞漿成分。所述的脫細胞角膜基質形狀規則，其厚度為0.1-0.5mm左右(具體形狀及規格視臨床病例之情況而定)。
脫細胞角膜基質的制備方法，采取異種動物角膜基質為原料，經過化學滲透法去細胞處理可得到，步驟如下化學滲透法制作脫細胞基角膜質以濃度為0.1％的陰離子表面活性劑SDS溶液在37℃的條件下處理異種角膜基質7小時，制作石蠟切片行病理組織學觀察，結果顯示基質內細胞成分可被脫去。
將上述制備的脫細胞基角膜質用于下述試驗1.將所述脫細胞基角膜質用于板層角膜移植角膜混濁、潰瘍或角膜基質缺損病人，用環鉆或角膜切削刀去除病變部分的角膜后，用縫線或生物膠將相應規格的脫細胞角膜基質植片固定于植床，包眼，待表面上皮化后，按板層角膜移植術處理。術后可不同程度恢復角膜的透明度及其完整性。亦可同時將此脫細胞角膜基質通過不同載體(如脂質體、乳劑、毫微球等)攜帶不同作用的藥物或細胞因子，如抗新生血管的VEGF、促進上皮黏附的ICAM-1以及抗生素等，以改善板層角移術后新生血管形成、上皮生長緩慢以及繼發感染等并發癥。
2.將所述脫細胞基角膜質用于翼狀胬肉手術按常規翼狀胬肉切除手術規定切除翼狀胬肉后，清理創面，取與缺損角膜緣相吻合的含角膜緣帶部分鞏膜的脫細胞角膜基質(周邊緣菲薄)用縫線或生物膠固定，牽拉切開的結膜，覆蓋脫細胞角膜基質的鞏膜部分，加壓包扎術眼。按翼狀胬肉聯合羊膜移植手術后常規處理。
3.將所述脫細胞基角膜質用于修復鞏膜缺損清理角鞏膜葡萄腫患者的病變表面后，將與缺損鞏膜相吻合的脫細胞鞏膜基質(周邊緣菲薄)用縫線或生物膠固定，縫合結膜，加壓包扎術眼。
實施例2一種脫細胞角膜基質，由數百個相互平行的膠原纖維板層構成，膠原纖維板層之間有細胞被脫去后形成的空隙。膠原纖維板層相互平行，大小一致，間隔相等，其基本成分包括膠原纖維、角膜基質(包括粘多蛋白及糖蛋白等)以及脫細胞處理后殘留的胞膜和胞漿成分。所述的脫細胞角膜基質為直徑范圍在1-10mm左右的圓形，其厚度為0.3mm左右。(具體直徑及厚度可根據患眼之屈光狀態及病變情況塑形)脫細胞角膜基質的制備方法，采取同種異體角膜基質為原料，該角膜包括附帶在角膜上的鞏膜和結膜，經過化學滲透法去細胞處理可得到，步驟如下化學滲透法制作脫細胞基角膜質以濃度為1％的去垢劑TritonX-100溶液在37℃的條件下處理異種角膜基質24小時，制作石蠟切片行病理組織學觀察，結果顯示基質內細胞成分可被脫去。
將上述制備的脫細胞基角膜質用于下述試驗1.將所述脫細胞基角膜質用于角膜鏡片術按角膜表面鏡片術的要求，在角膜表面制做鑲嵌槽，將具有適宜屈光度的脫細胞角膜基質片的菲薄周邊緣插入槽內，用縫線或生物膠固定，加壓包扎術眼。按角膜鏡片術手術后常規處理。術后患者的屈光度可有不同程度的改善。
2.將所述脫細胞基角膜質用于角膜基質層間植入術用于矯正屈光不正與治療圓錐角膜。根據病人的屈光度選擇具有適宜屈光度的脫細胞角膜基質片。做板層角膜或角膜基質層間囊袋，將選擇的脫細胞角膜基質片植入角膜層間內，固定后，加壓包扎術眼。按角膜鏡片術手術后常規處理。
3.將所述脫細胞基角膜質用于構建出組織工程化生物角膜角膜組織工程構建時，在脫細胞角膜基質的前表面種植上皮細胞，后表面種植內皮細胞，形成角膜的三維立體結構。
權利要求
1.一種脫細胞角膜基質，其特征是主要由數百個相互平行的纖維板層構成，纖維板層之間有細胞被脫去后形成的空隙。
2.根據權利要求1所述的脫細胞角膜基質，其特征是主要包括膠原纖維、角膜基質以及脫細胞處理后殘留的胞膜和胞漿成分。
3.根據權利要求1所述的脫細胞角膜基質，其特征是所述脫細胞角膜基質的厚度為0.01～5.0mm。
4.根據權利要求1所述的脫細胞角膜基質，其特征是所述的脫細胞角膜基質為直徑是1mm～40mm的圓形。
5.根據權利要求1-4任一所述的脫細胞角膜基質，其特征是所述脫細胞角膜基質中攜帶有藥物和/或細胞因子。
6.一種制備權利要求1所述的脫細胞角膜基質的方法，其特征是采用異種動物類或同種異體角膜基質為原料，經過去細胞處理，得到所述脫細胞角膜基質。
7.根據權利要求6所述的制備權利要求1所述的脫細胞角膜基質的方法，其特征是去細胞處理為化學滲透法，步驟如下以濃度為0.05～5％的陰離子表面活性劑SDS溶液在4～50℃的條件下處理異種角膜基質4～24小時。
8.根據權利要求6所述的制備權利要求1所述的脫細胞角膜基質的方法，其特征是去細胞處理為化學滲透法，步驟如下以濃度為0.01～5％的去垢劑TritonX-100溶液在4～50℃的條件下處理異種角膜基質24～48小時，再以胰酶消化2-12小時。
9.一種制備權利要求1所述的脫細胞角膜基質的方法，其特征是異種動物類或同種異體角膜基質是單獨的角膜、帶有鞏膜的角膜、帶有結膜的角膜、或帶有鞏膜和結膜的角膜。
全文摘要
本發明公開了一種脫細胞角膜基質，該脫細胞角膜基質主要由數百個相互平行的膠原纖維板層構成，膠原纖維板層之間有細胞被脫去后形成的空隙。所述脫細胞角膜基質用于修補眼表組織缺損、重建及塑形眼表組織、治療眼表疾病和用作構建組織工程化生物角膜的載體，移植后可以長期存在或逐步降解，并可呈高度透明狀態，具有受體的神經可以長入、受體細胞可以在其表面長期附著生長、免疫原性低和組織相容性佳的特點。
文檔編號A61F2/14GK101066471SQ200710027698
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月25日 優先權日2007年4月25日
發明者王智崇 申請人:中山大學中山眼科中心