人角膜上皮片的制造法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種移植用人角膜上皮片，詳細地，涉及一種人角膜上皮片的制造法， 其使用了將人角膜上皮細胞培養而得到的來自人角膜上皮的細胞。
【背景技術】
[0002] 角膜是透明組織，其從外側向內側由角膜上皮、前彈力層、角膜基質層、后彈力層、 角膜內皮5層細胞層構成，其沒有血管但有神經分布。角膜上皮是厚度約50μm的非角化 復層扁平上皮，其構成眼表面的一部分，并且限制物質的透過，而且作為防止細菌、真菌等 向角膜內部侵入的屏障起作用。對于角膜上皮的屏障功能的維持，在最表層的細胞間存在 的緊密連接起著重要的作用。
[0003]角膜上皮有再生能力，即使上皮受傷，也能從角膜上皮干細胞供給用于修復損傷 的角膜上皮細胞，進一步細胞間的緊密連接也再生，從而恢復并維持屏障功能。
[0004] 對于角膜上皮的屏障功能受到不可逆地損害的角膜疾病，角膜移植作為有效的治 方療法正在普及。角膜移植主要分為移植角膜全層的全層角膜移植和移植角膜組織的一部 分的角膜移植。由于全層角膜移植存在因角膜全層切開而引起的眼球的脆弱性等問題，因 此近年來，正在普及移植角膜組織的一部分的方法。作為這種移植角膜組織的一部分的方 法，有同時移植角膜基質的一部分和角膜上皮的表層角膜移植、及僅移植及角膜上皮的角 膜上皮移植，這些方法以復發性角膜營養不良患者等為對象，已在臨床情況中確立。
[0005] 在角膜緣組織的基底部存在具有分化為角膜上皮細胞的能力的角膜上皮干細胞。 因此，若角膜緣組織受到損害，則不能供給用于修復角膜上皮細胞的角膜上皮干細胞。此 外，在角膜上皮大范圍地受到損害的情況下，直到從角膜上皮干細胞供給用于修復損傷的 必要量的角膜上皮細胞為止，需要花費時間。另外在作為角膜上皮細胞的細胞外基質的前 彈力膜受到損害的情況下，角膜上皮細胞發生粘著不良，從而不能夠給角膜上皮供給足夠 的細胞。這樣，角膜上皮在數周以上的期間內未修復，若其屏障功能受損的狀態繼續，則眼 表面容易被細菌感染。一旦在眼表面發生感染，則結膜上皮隨著血管新生會覆蓋眼表面，此 外，由于免疫細胞的游走，會產生炎癥。另外，還有細菌分泌的酶導致角膜組織破壞，從而達 到失明的情況。這樣，因角膜上皮干細胞的供給的不能或降低而產生的疾病稱為角膜上皮 干細胞缺陷癥。對于因角膜上皮干細胞缺陷癥而產生炎癥的角膜，角膜上皮移植因排斥反 應而成活率低。
[0006] 此外，角膜上皮移植還存在無法獲得滿足需要的移植用角膜上皮的捐贈者不足的 問題。對于該捐贈者不足，考慮在體外培養角膜上皮細胞，制作細胞片，然后將該片移植到 角膜上皮的損傷部位的方法。在這種將人角膜上皮片移植到損傷部位的情況下，移植部位 的炎癥也成為問題。因此，作為抑制炎癥并移植人角膜上皮片的方法，正在嘗試使人角膜上 皮片在羊膜上形成，從而制作具有羊膜層的人角膜上皮片，然后將其移植的方法。
[0007] 作為使細胞片在羊膜上形成的方法，報告了在人基質羊膜（剝離除去了羊膜上皮 細胞的羊膜）上接種健康正常的白色家兔的角膜上皮緣片，與支持細胞（NIH-3T3細胞）一 起培養的方法（非專利文獻1)。確認這里所得的人角膜上皮片在形態學上也具有與生物角 膜上皮類似的層結構。顯示進行用健康正常的人角膜上皮緣片通過同樣的方法制作人角膜 上皮片，然后將其移植給難治性眼表面疾病患者的臨床試驗，通過該方法得到的人角膜上 皮片的移植作為眼功能恢復手段是有效的（非專利文獻2、非專利文獻3)。
[0008] 此外，作為使細胞片在羊膜上形成的方法，報告了將健康正常的白色家兔或人的 角膜上皮緣片進行酶處理并使角膜上皮細胞懸濁，將其接種到人基質羊膜（剝離除去了羊 膜上皮細胞的羊膜）上，與支持細胞（NIH-3T3細胞）一起培養的方法（專利文獻1，非專 利文獻4)。確認這里所得的人角膜上皮片在形態學上也具有與生物角膜上皮類似的層結 構。此外，確認在人角膜上皮片的培養過程中，通過將培養細胞的表面暴露于氣相并進行培 養（air-lifting)，誘導緊密連接關聯蛋白質的表達。
[0009] 現有技術文獻：
[0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻1 :W02004/078225
[0012] 非專利文獻
[0013] 非專利文獻1 :KoizumiN.et al.，Cornea，19,65-71 (2000)
[0014] 非專利文獻2 :KoizumiN.et al.，Archives of Ophthalmology，119， 298-300(2001)
[0015] 非專利文獻 3:KoizumiN.et al·，The American Academy of Ophthalmology， 108,1569-74(2001)
[0016] 非專利文獻4 :KoizumiN.et al·，Invest Ophthalmol Vis Sci，43， 2114-21(2002)
【發明內容】
[0017] 發明要解決的課題
[0018] 在上述背景下，本發明的目的在于，提供一種高效地制造品質穩定的人角膜上皮 片的方法。
[0019] 解決課題的方法
[0020] 在針對上述目的的研究中，本發明者發現，可用人間充質干細胞作為支持細胞，在 將ROCK抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、MAP激酶抑制劑及TGF- β受體抑制劑進行各種組合而 添加的培養基中培養來自人角膜上皮細胞的細胞，進一步地，通過將在該培養中所得的人 角膜上皮細胞在人羊膜上培養，能夠高效地制造人角膜上皮細胞片，從而完成本發明。即， 本發明提供以下方案。
[0021] (1) -種制造方法，其是來自人角膜上皮細胞的細胞的制造方法，
[0022] 其包括：在由具有細胞不能通過的微細孔的膜隔成第1室和第2室的培養容器的 該第1室中加入支持細胞，在該第2室中加入人角膜上皮細胞，用含有ROCK抑制劑及磷酸 二酯酶抑制劑的第1培養基培養該人角膜上皮細胞，接著，用含有磷酸二酯酶抑制劑、MAP 激酶抑制劑及TGF-β受體抑制劑的第2培養基培養該人角膜上皮細胞。
[0023] (2)上述（1)記載的制造方法，其中，該培養容器由具有該微細孔的膜隔成上下2 室，即上側室和下側室。
[0024] (3)上述（2)記載的制造方法，其中，該下側室為該第1室，該上側室為該第2室， 并且在具有該微細孔的膜上培養該人角膜上皮細胞。
[0025] (4)上述（3)記載的制造方法，其中，使人角膜上皮細胞在具有該細胞不能通過的 微細孔并且在該培養容器內被支持的膜上，不與該支持細胞直接接觸而進行培養。
[0026] (5)上述（1)-⑷中任一項記載的制造方法，其中，在該第1培養基中含有的該 ROCK抑制劑為Y27632,在該第1及該第2培養基中含有的該磷酸二酯酶抑制劑為3-異 丁基-1 -甲基黃嘌呤，在該第2培養基中含有的MAP激酶抑制劑為選自SB203580、或者 SB239063、或其組合的物質，在該第2培養基中含有的TGF-β受體抑制劑為選自SB431542、 LY364947、或者A83-01、或其組合的物質。
[0027] (6)上述（1)-⑷中任一項記載的制造方法，其中，在該第1培養基中含有的該 ROCK抑制劑為Y27632,在該第1及該第2培養基中含有的該磷酸二酯酶抑制劑為3-異丁 基-1-甲基黃嘌呤，在該第2培養基中含有的MAP激酶抑制劑為SB203580,在該第2培養基 中含有的TGF-β受體抑制劑為SB431542。
[0028] (7)上述（6)記載的制造方法，其中，在該第1培養基中含有的Y27632的濃度為 1-20μM，在該第1及該第2培養基中含有的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的濃度為50-150μM， 在該第2培養基中含有的SB203580的濃度為0. 2-2μΜ，SB431542的濃度為0. 2-2μΜ。
[0029] (8)上述（6)記載的制造方法，其中，在該第1培養基中含有的Υ27632的濃度為約 10μΜ，在該第1及該第2培養基中含有的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的濃度為約100μΜ，在 該第2培養基中含有的SB203580的濃度為約1μΜ，SB431542的濃度為約1μΜ。
[0030] (9)上述（1)-⑶中任一項記載的制造方法，其中，該支持細胞為人間充質干細 胞。
[0031] (10) -種制造方法，其包括使通過上述（1)-(9)中任一項記載的制造方法得到的 細胞懸濁于細胞冷凍液中并冷凍，成為冷凍細胞的步驟。
[0032] (11) -種細胞，其來自通過上述（1)-(10)中任一項記載的制造方法得到的人角 膜上皮細胞。
[0033] (12) -種細胞，其來自通過上述（10)記載的制造方法得到的冷凍后的人角膜上 皮細胞。
[0034] (13) -種制造方法，其是人角膜上皮片的制造方法，
[0035] 其包括：對于上述（11)記載的來自人角膜上皮細胞的細胞，在其解凍后，將上述 (11)或（12)記載的來自人角膜上皮細胞的細胞，在含有支持細胞的培養容器中，在置于具 有該支持細胞不能通過的微細孔并且在該培養容器內被支持的膜上的基質羊膜上，使用含 有ROCK抑制劑的第3培養基進行培養，接著，使用含有MAP激酶抑制劑及TGF-β受體抑制 劑的第4培養基進行培養，在該基質羊膜上形成由來自該人角膜上皮細胞的細胞構成的細 胞層的步驟；以及接著，在該細胞層的表面的全部或一部分沒有被培養基覆蓋的狀態下，使 用該第4培養基進行培養的步驟。
[0036] (14)上述（13)記載的制造方法，其中，該基質羊膜以剝離了羊膜上皮的一側朝上 的方式放置在該培養容器中。
[0037] (15)上述（13)或（14)記載的制造方法，其中，在該第3培養基中含有的該ROCK 抑制劑為Y27632,在該第4培養基中含有的MAP激酶抑制劑為SB203580,在該第4培養基 中含有的TGF-β受體抑制劑為SB431542。
[0038] (16)上述（15)記載的制造方法，其中，在該第3培養基中含有的Y27632的濃度 為1-20μM，在該第4培養基中含有的SB203580的濃度為0. 2-2μM，在該第4培養基中含 有的SB431542的濃度為0. 2-2μΜ。
[0039] (17)上述（15)記載的制造方法，其中，在該第3培養基中含有的Υ27632的濃度 為約ΙΟμΜ，在該第4培養基中含有的SB203580的濃度為約ΙμΜ，SB431542的濃度為約 1μΜ，。
[0040] (18)上述（13)-(17)中任一項記載的制造方法，其中，該支持細胞為人間充質干 細胞。
[0041] (19) 一種人角膜上皮片，其通過上述（13)-(18)中任一項記載的制造方法得到， 并包括該基質羊膜和該來自人角膜上皮細胞的細胞。
[0042] (20)上述（19)記載的人角膜上皮片，其中，剝離了該基質羊膜的羊膜上皮的一側 的面積的95%以上由通過該來自人角膜上皮細胞的細胞形成的細胞層覆蓋。
[0043] (21)上述（20)記載的人角膜上皮片，其中，該細胞層的90%以上具有由二層以上 細胞層構成的復層結構。
[0044] (22)上述（19)-(21)記載的任意一種人角膜上皮片，其中，該來自人角膜上皮細 胞的細胞的98%以上為細胞角蛋白AE1/AE3陽性，并且80%以上為細胞角蛋白12陽性。
[0045] (23)上述（19)-(21)記載的任意一種人角膜上皮片，其中，該來自人角膜上皮細 胞的細胞的99%以上為細胞角蛋白AE1/AE3陽性，85%以上為細胞角蛋白12陽性。
[0046] (24)上述（19)-(23)記載的人角膜上皮片，其用于角膜疾病的治療。
[0047] (25)上述（24)記載的人角膜上皮片，其中，該角膜疾病為角膜上皮的屏障功能受 到不可逆地損害的疾病。
[0048] (26)上述（24)記載的人角膜上皮片，其中，該角膜疾病選自角膜營養不良、 Stevens-Johnson綜合征、化學外傷及角膜上皮干細胞缺陷癥。
[0049] (27) -種人角膜上皮片，其中，基質羊膜表面的99. 5%以上由通過來自膜上皮 細胞的細胞形成的細胞層覆蓋，該細胞的98%以上為細胞角蛋白AE1/AE3陽性，該細胞的 80%以上為細胞角蛋白12陽性，該細胞層的95%以上具有由四層以上的細胞層構成的復 層結構，該細胞層表面的90%以上由扁平的細胞覆蓋，該細胞層內的纖維母細胞的比率不 足 0. 1 %。
[0050] 發明的效果
[0051] 根據本發明，因為能夠穩定地供給可給復發性角膜營養不良等角膜疾病的患者移 植的、品質穩定的人角膜上皮片，所以可以解決角膜上皮移植的捐贈者不足。
【附圖說明】
[0052] 圖1是示出HE染色后的人角膜上皮片的表面的放大圖（觀察倍率100倍）。
[0053] 圖2是示出HE染色后的人角膜上皮片的截面的放大圖（觀察倍率200倍）。A 表示表層的扁平的細胞，B表示