針對hpv的疫苗的制作方法

專利名稱：針對hpv的疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗。
背景技術：
Gardasil (Merck&Co Inc)是一種 HPV 疫苗，其包含由 HPV 6L1 蛋白組成的 HPV 6 病毒樣顆粒(VLP)、由HPV IlLl蛋白組成的HPV 11VLP、由HPV16L1蛋白組成的HPV 16VLP, 和由HPV 18L1蛋白組成的HPV 18VLP，和鋁佐劑。VLP以每劑分別20 μ g、40 μ g、40 μ g、和 20 μ g的量存在。疫苗以依照0、2、6個月日程表的3劑方案施用。Cervarix (GlaxoSmithKline)是一種 HPV 疫苗，其包含由 HPV 16L1 蛋白組成的 HPV 16VLP、和由HPV 18L1蛋白組成的HPV 18VLP，和含有氫氧化鋁和3-脫酰基-4，-單磷酰基脂質A (又稱為3D-MPL)的佐劑。VLP以每劑各20 μ g的量存在。3D-MPL以每劑50 μ g 的量存在。此疫苗也以依照0、1、6個月日程表的3劑方案施用。發明概述本發明是一種改良的HPV疫苗，其在以2劑方案施用時是有效的。因而，本發明涉及HPV 16和HPV 18病毒樣顆粒(VLP)與藥學可接受佐劑一起在制造用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的疫苗中的用途，其中配制所述疫苗以依照由第一劑和第二劑組成的兩劑方案施用。本發明進一步涉及HPV 16和HPV 18病毒樣顆粒(VLP)與藥學可接受佐劑一起在用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的疫苗中的用途，其中配制所述疫苗以依照由第一劑和第二劑組成的兩劑方案施用。本發明進一步涉及一種用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的方法，該方法包括對有所需要的個體投遞包含與藥學可接受佐劑一起的HPV 16和HPV 18病毒樣顆粒 (VLP)的疫苗，其中以由第一劑和第二劑組成的連續兩劑投遞所述疫苗。本發明進一步涉及一種用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的疫苗，其中每個人劑量的疫苗包含濃度大于20 μ g每種的HPV 16VLP和HPV 18VLP。每個人劑量的疫苗可以含有例如與佐劑一起的30 μ g每種VLP、或40 μ g每種VLP、或60 μ g每種VLP。本發明還涉及一種用于制造疫苗的方法，所述方法包括a)組合HPV 16VLP, HPV 18VLP和佐劑以形成疫苗，并b)給貯存或投遞容器填充含有大于20 μ g的HPV 16VLP和大于20 μ g的HPV 18VLP的人劑量的疫苗。本發明進一步提供了一種用于制造疫苗的方法，所述方法包括a)組合HPV 16VLP, HPV 18VLP和佐劑以形成疫苗，并b)給貯存或投遞容器填充含有30 μ g HPV 16VLP 禾口 30 μ g HPV 18VLP的人劑量的疫苗。本發明進一步提供了一種用于制造疫苗的方法，所述方法包括a)組合HPV 16VLP, HPV 18VLP和佐劑以形成疫苗，并b)給貯存或投遞容器填充含有40 μ g HPV 16VLP 禾口 40 μ g HPV 18VLP的人劑量的疫苗。本發明進一步提供了一種用于制造疫苗的方法，所述方法包括a)組合HPV 16VLP, HPV 18VLP和佐劑以形成疫苗，并b)給貯存或投遞容器填充含有60 μ g HPV 16VLP禾口 60 μ g HPV 18VLP的人劑量的疫苗。附圖簡述

圖1顯示了最后一劑HPV疫苗后一個月，接受2劑HPV疫苗接種的受試者中的抗 HPV-16抗體滴度的幾何平均滴度，如實施例2中所描述的。圖2顯示了最后一劑HPV疫苗后一個月，接受2劑HPV疫苗接種的受試者中的抗 HPV-18抗體滴度的幾何平均滴度，如實施例2中所描述的。發明詳述本發明第一次描述了一種兩劑HPV疫苗和一種通過施用兩劑HPV疫苗來預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的方法。所述方法包括對有所需要的個體投遞包含與藥學可接受佐劑一起的HPV 16和HPV 18病毒樣顆粒(VLP)的疫苗，其中以由第一劑和第二劑組成的連續兩劑投遞所述疫苗。與三劑方案比較，兩劑方案的使用提供改善患者順從性的可能性和HPV疫苗接種與其它青春期疫苗日程表更相容的可能性。兩次訪問內科醫生而不是三次還向健康護理系統提供益處。在一個實施方案中，以兩劑施用疫苗，其中每劑疫苗包含濃度大于20 μ g每種的 HPV 16VLP和HPV 18VLP0每劑疫苗可以含有例如與佐劑一起的30 μ g每種VLP、或40 μ g 每種VLP、或60 μ g每種VLP。在另一個實施方案中，以兩劑施用疫苗，其中每劑疫苗包含濃度為20 μ g每種的 HPV 16VLP 禾Π HPV 18VLP。在另一個實施方案中，以兩劑施用疫苗，其中每劑疫苗包含濃度分別為40yg和 20 μ g 的 HPV 16VLP 禾口 HPV 18VLP。疫苗的施用可以遵循任何2劑日程表，例如0，1個月日程表、0，2個月日程表、0， 3個月日程表、0，4個月日程表、0，5個月日程表或0，6個月日程表。例如，第二劑在施用第一劑后2周和8個月之間，例如第一劑后1和6個月之間或第一劑后3和8個月之間施用。 如此，可以例如在第一劑后1個月或2個月或3個月或4個月或5個月或6個月施用第二劑。在一個實施方案中，在第一劑后超過2個月，例如第一劑后3或更多個月、或4或更多個月、或5或更多個月、或6或更多個月施用疫苗的第二劑，其中在每種情況中，可以有第一劑后8個月的上限。疫苗、用途或方法可以采用每種的量大于每人劑量20 μ g，例如每劑30 μ g或每劑大于30 μ g,例如每劑40 μ g或每劑60 μ g或每劑80 μ g的HPV 16和HPV 18VLPO每劑HPV 16和18VLP的量可以是相同的或不同的。HPV 16和18VLP的量可以各自獨立地在每劑25 至85 μ g、每劑30至50 μ g、或合適地每劑35至45 μ g的范圍中。如本文中所使用的，術語“疫苗”指包含能夠在個體諸如人中引起免疫應答的免疫原性成分的組合物，其中所述組合物任選地含有佐劑。合適地，針對HPV的疫苗引發針對由一種或多種HPV類型引起的偶發感染(incidentinfection)、或持續感染、或細胞學異常諸如ASCUS、CINU CIN2, CIN3、或宮頸癌的保護性免疫應答。術語“人劑量”指按適合于人使用的體積計的劑量。一般而言，這是體積在0. 3和 1.5ml之間的液體。在一個實施方案中，人劑量是0.5ml。在又一個實施方案中，人劑量高于0. 5ml，例如0. 6,0. 7,0. 8,0. 9或1ml。在又一個實施方案中，人劑量在Iml和1. 5ml之間。疫苗、用途和方法可以進一步包含來自HPV 16和HPV 18以外的HPV類型的VLP。 特別地，疫苗、用途和方法中可以包含的來自其它HPV類型的其它VLP包括來自一種或多種致癌性HPV類型諸如HPV 31、33、35、39、45、51、56、58、59、66和68的VLP。本文中所描述的疫苗、用途或方法中可以包含的來自其它HPV類型的其它VLP包括來自非致癌性HPV類型諸如 HPV 6 和 HPV 11 的 VLP。在一個實施方案中，疫苗、用途或方法僅使用HPV 16和HPV 18VLP。在另一個實施方案中，疫苗、用途或方法使用單獨的或與一種或多種其它致癌性 HPV 類型的 VLP 組合的 HPV 16、HPV 18、HPV 6 和 HPV 11VLP。在另一個實施方案中，僅使用HPV 16,HPV 18,HPV 6和HPV 11VLP，而且每劑疫苗包含濃度分別為 40μ g、20y g、20y g、40y g 的 HPV 16、HPV 18、HPV 6 和 HPV IlVLP0HPV VLP和用于生成VLP的方法是本領域中公知的。通常自病毒的HPVLl和任選地 L2 結構蛋白構建 VLP。參見例如 W09420137、US5985610、W09611272、US6599508B1、 US6361778B1、EP595935。可以使用任何合適的HPV VLP，諸如僅有Ll的VLP或包含Ll和 L2蛋白的VLP。VLP可以僅由Ll蛋白或其免疫原性片段或者由Ll或其免疫原性片段和L2或其免疫原性片段二者構成。在本文中所描述的任何實施方案中，HPV VLP可以包含HPV Ll蛋白或其免疫原性片段。VLP可以進一步包含來自另一種HPV蛋白的肽。VLP可以是僅有Ll的VLP，其由Ll或其免疫原性片段構成。在使用Ll的免疫原性片段的情況中，則HPV Ll的合適的免疫原性片段包括Ll的截短、刪除、替代、或插入突變體。此類免疫原性片段可以能夠引起免疫應答，所述免疫應答能夠識別來自衍生Ll蛋白的HPV類型的Ll蛋白諸如病毒顆粒或VLP形式的Li。可以使用的免疫原性Ll片段包括截短的Ll蛋白。在一個方面，截短除去核定位信號，而且任選地還除去LlC端區中的DNA結合樣式。在另一個方面，截短是C端截短。在又一個方面，C端截短除去少于50個氨基酸諸如少于40個氨基酸。在Ll來自HPV 16的情況中，則在另一個方面，C端截短自HPV 16L1的羧基端除去34個氨基酸。在Ll來自HPV 18的情況中，則在又一個方面，C端截短自HPV 18L1的羧基端除去35個氨基酸。如此，截短的Ll蛋白可以是與野生型Ll相比在C端截短的，以便除去核定位信號，而且任選地還有 DNA結合樣式，這可以通過例如從蛋白質的C端末端除去少于50或少于40個氨基酸來進行。來自HPV 16和HPV 18的Ll的此類截短的蛋白質的例子在下文以SEQ ID No:l和2 給出。截短的Ll蛋白還記載于US 6，060，324、US6，361，778、和US 6，599，508，通過提及而將它們收入本文。在一個方面，HPV 16L1氨基酸序列是以下序列(SEQ ID NO 1)MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKI 60
LVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGH 120PLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAV 180NP⑶CPPLELINTVIQD⑶MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSE 240
PYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMV 300TSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTWDTTRST 匪 SLCAAISTSETITKNTNF 360KEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRF 420VTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQ471HPV 16L1序列也可以是W094/05792或US 6，649，167中披露的，例如適當截短的。 合適的截短物在與上文所顯示的位置等同的位置處截短，如通過序列比對所評估的，及使用本文中所公開的標準。在一個方面，HPV 18L1氨基酸序列是以下序列(SEQ ID NO 2)MALWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSS RLLTVGNPYFRVPAGGGNKQ 60
DIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNSIYNPETQRLVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGH 120PFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPL 180SQGDCPPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSAD 240PYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPPSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIV 300TSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATK 360FKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYR 420FVQSVAITCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQ472W096/29413中披露了備選的HPV 18L1序列，其可以適當地截短。合適的截短物在與上文所顯示的位置等同的位置處截短，如通過序列比對所評估的，及使用本文中所公開的標準。其它HPV 16和HPV 18L1序列是本領域中公知的，并且可以適合于在本發明中使用。疫苗、用途和方法可以進一步包含HPV早期抗原，例如選自下組的抗原HPV EU E2、E3、E4、E5、E6、E7、或 E8。在一個實施方案中，HPV VLP和/或抗原的組合和數量沒有顯著地影響任何一種 HPV VLP或抗原，特別是HPV 16和HPV 18VLP的免疫原性。在一個實施方案中，組合中使用的HPV VLP與抗原之間沒有生物學相關干擾，使得來自不同HPV類型的VLP和抗原的組合的使用能夠誘導合適的免疫應答，而且提供針對由疫苗中代表的每種HPV基因型引起的感染或疾病的有效保護。在一個實施方案中，針對組合中的給定HPV類型的免疫應答是單獨測量時此相同 HPV類型的免疫應答的至少50%，或100%或基本上100%。對于對HPV 16和HPV 18的應答，本發明的組合疫苗優選刺激如下的免疫應答，其是由組合的HPV 16/HPV 18疫苗提供的免疫應答的至少50%。在一個實施方案中，由疫苗所產生的免疫應答處于如下的水平，即仍看到每種HPV類型的保護效果。可以例如通過臨床前或人實驗中的抗體應答來測量免疫應答。抗體應答的測量是本領域中公知的，并且披露于(例如)W003/077942。可以在任何合適的細胞底物諸如酵母細胞或昆蟲細胞中生成VLP，例如在昆蟲細胞中使用桿狀病毒系統來進行，而且用于制備VLP的技術是本領域中公知的，諸如 W09913056、US 6416945B1、US 6^1765B1和US6245568及其中的參考文獻，在此通過提及而收錄其完整的內容。可以通過解裝配和再裝配技術來生成VLP。例如，McCarthy等，1998“QuantitativeDisassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type IlVirus like Particles in Vitro”J. Virology 72(1) :33-41描述了自昆蟲細胞純化的重組LlHPV IlVLP的解裝配和再裝配以獲得VLP的同質制備物。W099/13056和US6M5568也描述了用于生成HPV VLP
的解裝配/再裝配方法。在一個實施方案中，如W099/13056或US6M5568所描述的那樣生成HPVVLP。或者，可以如下生成VLP，即表達Ll蛋白或免疫原性片段，將其自生成系統或細胞底物提取，并純化所述蛋白質，雖然它主要為Ll單體或五聚體(殼粒)形式，然后自純化的蛋白質形成VLP。在一個實施方案中，在存在還原劑諸如β-巰基乙醇(BME)的情況中實施提取和/或純化步驟以阻止VLP形成。在一個實施方案中，方法包括除去還原劑諸如BME 以容許VLP自發形成的步驟。可以通過標準的技術諸如例如電子顯微術和動態激光光散射來評估VLP形成。任選地，還可以與其它非HPV抗原一起配制或共施用所述疫苗。合適地，這些非 HPV抗原可以提供針對其它疾病諸如性傳播疾病諸如單純皰疹病毒的保護。例如，疫苗可以包含來自HSV的gD或其截短物。因此，疫苗提供針對HPV和HSV兩者的保護。在一個實施方案中，以液體疫苗配制劑提供疫苗，雖然可以將疫苗凍干并在施用前重建。本文中所描述的疫苗、用途和方法可以包含與VLP組合的佐劑或佐劑的混合物。 VLP可以與鋁組合使用，而且可以吸附或部分吸附至鋁佐劑上。可以使用的其它佐劑是刺激Thl型應答的佐劑諸如脂多糖，例如脂質A的無毒性衍生物諸如單磷酰基脂質A或更特別地3-0-脫酰基-4’-單磷酰基脂質A(3D-MPL)。合適地，佐劑是鋁鹽，優選地與脂多糖諸如3D-MPL組合的鋁鹽。在一個實施方案中，佐劑是氫氧化鋁，或氫氧化鋁與3D-MPL的組合。在將VLP吸附至含有鋁的佐劑上時，可以將VLP吸附至鋁佐劑，之后混合VLP以形成最終的疫苗產品。3D-MPL 由 GlaxoSmithKline Biologicals N. A.以名稱 MPL 出售，并且遍及整個文件稱為MPL或3D-MPL。參見例如美國專利號4，436，727 ；4，877，611 ；4，866，034和 4，912，094。3D-MPL主要促進具有IFN-g (Thl)表型的CD4+T細胞應答。依照GB 222021IA 或US 4，912，094中披露的方法來生成3D-MPL。在化學上，它是具有3、4、5或6個酰基化鏈的3-脫酰基化單磷酰基脂質A的混合物。在一個實施方案中，使用小顆粒3D-MPL。小顆粒 3D-MPL具有如下的顆粒大小，使得它可以無菌過濾通過0. 22 μ m濾器。此類制備物記載于 W09V2U92。合適地，每劑疫苗中的3D-MPL量能夠在人中增強對抗原的免疫應答。特別地，合適的3D-MPL量是與不加佐劑的組合物相比或與用另一 MPL量加佐劑的組合物相比改善組合物的免疫學潛力，同時自反應原性序型(profile)可接受的量。每劑疫苗中的3D-MPL量可以例如在l_200yg之間，或在10-100 μ g之間，或在 20-80 μ g之間，例如每劑25 μ g，或在40-60 μ g之間，例如每劑50 μ go可以自細菌來源純化并加工要在本文中所描述的組合物中配制的細菌脂多糖衍生的佐劑，或者備選地它們可以是合成的。例如，純化的單磷酰基脂質A記載于Ribi 等1986(見上文)，而自沙門氏菌(Salmonella sp.)衍生的3_0_脫酰基化單磷酰基或二磷酰基脂質A記載于GB 2220211和US 4912094。已經描述了其它純化的和合成的脂多糖(Hilgers 等，1986，Int. Arch. Allergy. Immunol. , 79 (4) :392-6 ；Hilgers 等，1987， Immunology, 60(1) :141-6;及 EP 0 549074 Bi)。疫苗還可以包含鋁或鋁化合物作為穩定劑。可以通過多種路徑之任一種，諸如口服、表面、皮下、粘膜(通常為陰道內)、靜脈內、肌內、鼻內、舌下、皮內和經由栓劑來施用本文中所描述的疫苗。肌內和皮內投遞是優選的。可以使用標準的技術例如在標準的臨床前模型中測試本文中所描述的疫苗以確認疫苗是免疫原性的。對于本文中所描述的所有疫苗，在一個實施方案中，使用疫苗來接種年齡為9歲和更大，例如10-15歲諸如10-13歲的青春期女孩。然而，也可以接種15歲齡以上的年長女孩和成年女性。類似的，可以對更小年齡組諸如2-12歲齡施用疫苗。然而，也可以對異常乳頭涂片后的或除去由HPV引起的損傷后的手術后的或對于HPV癌癥類型呈血清陰性和 DNA陰性的女性施用疫苗。在一個實施方案中，本文中所描述的疫苗和方法用于在下列一個或多個年齡組中的女性中使用年齡為9至25歲、年齡為10至25歲、年齡為9至19歲、年齡為10至19歲、 年齡為9至14歲、年齡為10至14歲、年齡為15至19歲、年齡為20至25歲、年齡為14歲或以下、年齡為19歲或以下、年齡為25歲或以下。可以在男性或男孩中使用本文中所描述的疫苗和方法。通過提及而將本申請中的所有參考文獻(包括專利申請和授權專利)的教導完整收入本文。
實施例實施例1 :HPV 16/18L1VLP 的制備使用標準的方案(例如參見W09913056)來實施HPV 16、HPV 18、HPV33和HPV 58L1VLP的生成。在其3’端刪除編碼每種Ll蛋白的HPV Ll基因，之后進行其在桿狀病毒表達載體中的克隆以除去最初存在于每種Ll蛋白的C端的核定位和DNA結合樣式。標準的遺傳操作導致C端截短的基因(對于HPV 16和18而言分別為34和35個氨基酸的C端末端刪除) 的克隆。如本文中所使用的HPV 16和18L1截短物的氨基酸序列在說明書中給出(分別為 SEQ ID NO 1和 2)。在用編碼感興趣的HPV 16/18L1基因的重組桿狀病毒(Μ0Ι為0. 5)感染的粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) (High Five )細胞(以約2000000個細胞/ml的密度)中表達HPV 16和18截短的Ll蛋白。感染后約72至96小時收獲細胞。細胞收獲/抗原提取在濃縮、提取、澄清的三步驟過程中自Hi5細胞提取抗原(L1-16/18)。濃縮步驟除去多至90%的培養液，并通過離心來實施。用低滲緩沖液(Tris 20mM, pH 8.5)來實施提取步驟。使用等于培養物體積的體積來實施提取。使用平穩攪拌下最少半小時的接觸時間。通過切向流過濾來實施澄清。
純化于室溫實施純化過程。將β -巰基乙醇(BME) (4% w/w)添加至提取物以阻止VLP 形成。將所使用的所有緩沖液在0. 22 μ m濾器上過濾。每次純化運行前，將凝膠基質消毒并用合適的緩沖液平衡，之后進行樣品加載。為自HPV 16和HPV 18分開純化Ll給出了純化方案。這些方案是廣泛相似的，并且包括下列步驟陰離子交換層析(二甲基氨乙基-DMAE)，陰離子交換層析(三甲基氨乙基-TMAE)，羥磷灰石層析，納米級過濾(Nanometric filtration) (Planova),超濾對于HPV 18的疏水相互作用層析(使用辛基kpharose)或對于HPV 16的陰離子交換層析(DEAE)；和無菌過濾。L1-18抗原的純化陰離子交換層析DMAE將澄清的提取物(約lmg/ml濃度的蛋白質，具有約150μ g/ml的Ll蛋白)應用至陰離子交換柱(二甲基氨乙基)。用(Tris 20mM NaCl 200mM|4% β-巰基乙醇81^)緩沖液，ρΗ 7. 9士0. 2來實施洗脫。在約5個柱體積中洗脫抗原，并在280nm處監測洗脫譜。陰離子交換層析TMAE用1個體積&Η20/ΒΜΕ 4%來稀釋第一步的洗脫物。然后，將稀釋的洗脫物應用至第二陰離子交換柱(三甲基氨乙基)。用(20mMTris | NaCl 200mM|4% BME)緩沖液，ρΗ 7. 9士0. 2 來實施洗脫。在約 4 個柱體積中洗脫抗原，并在^Onm處監測洗脫譜。羥磷灰石層析將TMAE步驟的洗脫物應用至羥磷灰石(HA)柱。樣品應用后，用約2. 5個柱體積的(NaH2PO4 IOOmM | NaCl 30mM | 4% Biffi)緩沖液， PH 6.0 士 0.2來洗脫凝膠。納米級過濾(Planova)將HA洗脫物稀釋以達到以下條件(NaH2P0425mM|NaCl IOmM | 4% BME)緩沖液，ρΗ 7. 5 士 0. 2。然后將其在0. 2 μ m預濾器上和在0. 12m2的Planova 15N濾器上連續過濾。以恒定壓強200mbar 士 20mbar實施過濾。超濾用裝備有聚醚砜膜(Centramate盒0. Im2, IOOkD)的切向流超濾系統來實施超濾。處理Planova 洗脫物以達到以下條件(NaH2PO4 IOOmM| NaCl 30mM|4% BME), ρΗ 6. 0士0. 2 ；然后將其在系統中加載，濃縮5倍，并用約10個起始體積的(NaH2PO4 20mM|NaCl 500mM)緩沖液，pH 6. 0士0. 2的連續注射來滲濾。
疏水相互作用層析(辛基kpharose)將超濾滲透物應用至辛基kpharose柱。用約5個柱體積的(Na3P0420mM|NaCl 500mM)緩沖液，pH 6. 0士0. 2以負模式運行此層析步驟。無菌過濾通過在0. 22 μ m膜上過濾來對純化的L1-18抗原溶液處菌。L1-16抗原的純化陰離子交換層析DMAE將澄清的提取物應用至陰離子交換柱(二甲基氨乙基)。用(Tris20mM|NaCl 180mM|4% BME)緩沖液，pH 7. 9士0. 2 來實施洗脫。在約 4 個柱體積中洗脫抗原，并在^Onm處監測洗脫譜。陰離子交換層析TMAE用1個體積4%來稀釋第一步的洗脫物。然后將稀釋的洗脫物應用至第二陰離子交換柱(三甲基氨乙基)。用(20mMTris | NaCl 180mM|4% BME)緩沖液，pH 7. 9士0. 2 來實施洗脫。在約 5 個柱體積中洗脫抗原，并在^Onm處監測洗脫譜。羥磷灰石層析(HA)將TMAE步驟的洗脫物應用至HA柱。樣品應用后，用約3個柱體積的(NaH2PO4 IOOmM|NaCl 30mM|4% BME)緩沖液，pH 6.0 士 0.2來洗脫凝膠。納米級過濾(Plan0va)將HA洗脫物稀釋以達到以下條件(NaH2PO4 25mM|NaCl IOmM | 4% BME)緩沖液，pH 7. 5 士 0. 2。然后將其在0. 2 μ m預濾器上和在0. 12m2的Planova 15N濾器上連續過濾。以恒定壓強200mbar 士 20mbar實施過濾。超濾用裝備有聚醚砜膜(Centramate盒0. Im2, IOOkD)的切向流超濾系統來實施超濾。處理Planova 洗脫物以達到以下條件(NaH2PO4 IOOmM| NaCl 30mM|4% BME), pH 6. 0士0. 2 ；然后將其在系統中加載，濃縮5倍，并用約10個起始體積的(NaH2PO4 20mM|NaCl 500mM)緩沖液，pH 6. 0士0. 2的連續注射來滲濾。陰離子交換層析DEAE將超濾洗脫物調節至平衡緩沖液(Na3PO4 20mM|NaCl 500mM)，pH6. 0 士0. 2的電導
率，并將其應用至陰離子交換柱(二甲基氨乙基)。用(NaH2PO4 20mM|NaCl 500mM)緩沖液，pH 6.0士0.2實施洗脫。在約3個柱體積中洗脫抗原，并在^Onm處監測洗脫譜。無菌過濾通過在0. 22 μ m膜上過濾來對純化的L1-16抗原溶液除菌。實施例2 在年齡為9-25歲的健康女性中的I/II期、部分盲的、隨機化的、 多中心的、年齡分層的、劑量范圍研究以評估在與GlaxoSmithKline Biologicals的HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的標準的3劑日程表相比時依照2劑日程表(0，2個月或0，6個月)肌內施用的HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的安全性和免疫原性。主要目的(免疫原性)免疫原性·評估與按3劑日程表(0、1、6個月)施用的標準的HPV-16/18L1VLPAS04疫苗相比在以不同劑量OO或40 μ g每種HPV抗原)及按不同日程表(0，2或0，6個月)施用時在最后一劑后一個月的HPV-16/18L1VLPAS04疫苗的免疫原性。次要目的(免疫原性)評估下列三項目的·關于免疫原性的第一次要目的是證明最后一劑疫苗后一個月，與年齡為15-25歲(已經證明了功效的年齡組)的受試者中的標準的3劑日程表相比，以不同劑量OO或40 μ g每種HPV抗原)及按不同日程表(0，2或0，6個月)施用時在9-14歲年齡層中對HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的2劑日程表的抗體應答的非劣效性(non-inferiority)。要用于非劣效性的標準如果年齡為15-25歲的受試者中的HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的標準的3劑日程表與9-14歲年齡層中的2劑日程表之間的幾何平均滴度(GMT)比率的95%置信區間(Cl) 的上限低于2，那么證明非劣效性。·要評估的下一個次要目的證明最后一劑疫苗后一個月，與年齡為15-25歲的受試者中的標準的3劑日程表相比，以不同劑量(20或40 μ g每種HPV抗原)及按不同日程表(0，2或0，6個月)施用時在15-19歲年齡層中對HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的2劑日程表的抗體應答的非劣效性。要用于非劣效性的標準如果年齡為15-25歲的受試者中的HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的標準的3劑日程表與15-19歲年齡層中的2劑日程表之間的GMT比率的95% CI的上限低于2，那么證明非劣效性。·要評估的第三個次要目的證明最后一劑疫苗后一個月，與年齡為15-25歲的受試者中的標準的3劑日程表相比，以不同劑量(20或40 μ g每種HPV抗原)及按不同日程表(0，2或0，6個月)施用時在20-25歲年齡層中對HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的2劑日程表的抗體應答的非劣效性。要用于非劣效性的標準如果年齡為15-25歲的受試者中的HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的標準的3劑日程表與20-25歲年齡層中的2劑日程表之間的GMT比率的95% CI的上限低于2，那么證明非劣效性。·如果關于免疫原性的上述次要目的之任一項沒有得到證明，那么要評估以下目的在每個年齡層內的最后一劑疫苗后一個月，檢查每個2劑日程表組與標準的3劑日程表之間的抗體應答的成對比較。在延長的隨訪期期間(在第12個月、第18個月和第24個月時)評估每個年齡層中對HPV-16/18L1VLP AS04疫苗的所有劑量日程表和劑量的抗體應答。研究設計 實驗設計具有四個平行組的I/II期、部分盲的、有對照的、隨機化的、年齡分層的試驗。將每組分層成三個年齡層年齡為9-14歲、15-19歲和20-25歲。 處理組四個組以不同劑量OO或40 μ g每種HPV抗原)及按不同日程表(0，2 個月、0，6個月或0，1，6個月日程表)接受HPV-16/18L1VLP AS04 表 權利要求
1.HPV16和HPV 18病毒樣顆粒(VLP)與藥學可接受賦形劑一起在用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的疫苗中的用途，其中配制所述疫苗以依照由第一劑和第二劑組成的兩劑方案施用。
2.一種用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的方法，該方法包括對有所需要的個體投遞有效量的包含與藥學可接受賦形劑一起的HPV 16和HPV 18病毒樣顆粒(VLP)的疫苗，其中以由第一劑和第二劑組成的連續兩劑投遞所述疫苗。
3.依照權利要求1或權利要求2的用途或方法，其中所述第二劑在所述第一劑后2或 3個月施用。
4.依照權利要求1或權利要求2的用途或方法，其中所述第二劑在所述第一劑后超過 2個月施用。
5.依照權利要求4的用途或方法，其中所述第二劑在所述第一劑后6個月施用。
6.依照權利要求1至5中任一項的用途或方法，其中所述疫苗進一步包含佐劑。
7.依照權利要求6的用途或方法，其中所述佐劑是鋁鹽。
8.依照權利要求7的用途或方法，其中所述佐劑是氫氧化鋁。
9.依照權利要求6的用途或方法，其中所述佐劑包含脂質A衍生物。
10.依照權利要求9的用途或方法，其中所述佐劑包含3D-MPL。
11.依照權利要求10的用途或方法，其中所述佐劑包含3D-MPL和氫氧化鋁。
12.依照前述權利要求任一項的用途或方法，其中所述2劑各包含20μ g或40 μ g HPV 16VLP 禾口 HPV 18VLP 之每種。
13.依照前述權利要求任一項的用途或方法，其中所述2劑各包含20μ g HPV16VLP和 HPV 18VLP之每種。
14.依照權利要求1至11中任一項的用途或方法，其中所述2劑各包含超過20μ g HPV 16VLP 禾口 HPV 18VLP 之每種。
15.依照權利要求14的用途或方法，其中所述2劑各包含40μ g HPV 16VLP和HPV 18VLP之每種。
16.依照前述權利要求任一項的用途或方法，其中所述VLP包含Li。
17.依照前述權利要求任一項的用途或方法，其中所述VLP包含截短的Ll蛋白。
18.依照前述權利要求任一項的用途或方法，其中所述VLP是僅有Ll的VLP。
19.依照前述權利要求任一項的用途或方法，其中所述疫苗中存在HPV6型和11型的VLP。
20.依照權利要求1至18中任一項的用途或方法，其中所述疫苗中僅存在HPV16型和 18型的VLP。
21.依照前述權利要求任一項的用途或方法，其中所述疫苗用于在年齡為25歲或以下的女性中預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染。
22.依照權利要求21的用途或方法，其中所述疫苗用于在年齡為9至25歲的女性中預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染。
23.依照權利要求22的用途或方法，其中所述疫苗用于在年齡為9至14歲的女性中預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染。
24.依照權利要求22的用途或方法，其中所述疫苗用于在年齡為15至19歲的女性中預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染。
25.依照權利要求22的用途或方法，其中所述疫苗用于在年齡為20至25歲的女性中預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染。
26.一種用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的疫苗，所述疫苗包含與佐劑一起的濃度為每人疫苗劑量體積40 μ g每種的HPV 16VLP和HPV 18VLP。
27.依照權利要求沈的疫苗，其中所述人疫苗劑量體積是500μ 1。
28.依照權利要求沈或權利要求27的疫苗，其中所述佐劑是鋁鹽。
29.依照權利要求觀的疫苗，其中所述佐劑是氫氧化鋁。
30.依照權利要求沈或27的疫苗，其中所述佐劑包含脂質A衍生物。
31.依照權利要求30的疫苗，其中所述佐劑包含3D-MPL。
32.依照權利要求31的疫苗，其中所述佐劑包含3D-MPL和氫氧化鋁。
33.一種用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的方法，所述方法包括對有所需要的個體投遞依照權利要求26至32中任一項的疫苗。
34.一種容器，其含有依照權利要求沈至32中任一項的疫苗的500 μ 1人疫苗劑量。
35.一種用于制造疫苗的方法，所述方法包括組合HPV 16VLP、HPV 18VLP和佐劑，并給貯存或投遞容器填充含有40 μ g HPV 16VLP和40 μ g HPV 18VLP的人劑量體積。
36.一種用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的方法，所述方法包括對有所需要的個體投遞連續兩劑的依照權利要求35的方法制造的疫苗。
全文摘要
HPV 16和HPV 18病毒樣顆粒(VLP)與藥學可接受賦形劑一起在用于預防人乳頭瘤病毒相關疾病或感染的疫苗中的用途，其中配制所述疫苗以依照由第一劑和第二劑組成的兩劑方案施用。
文檔編號A61P35/00GK102159239SQ200980135875
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月29日 優先權日2008年7月31日
發明者多米尼克·德坎普斯, 尼古拉斯·勒克倫尼爾, 桑德拉·詹尼尼, 瓊·斯蒂芬尼, 馬蒂尼·A·C·韋坦多爾夫 申請人:葛蘭素史密斯克萊生物公司