針對hpv的疫苗的制作方法

針對hpv的疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明涉及治療化合物，諸如針對人乳頭瘤病毒(HPV)的疫苗，特別是針對HPV16或HPV18的DNA疫苗。本發明還涉及編碼同型二聚體肽的蛋白構建體，所述肽可以由DNA疫苗釋放或單獨使用。本申請還描述了藥物制劑、用于產生所述疫苗的宿主細胞和方法以及用于治療各種HPV誘發的疾病(諸如癌癥和傳染病)的方法。
【專利說明】針對HPV的疫苗
發明領域
[0001]本發明涉及治療化合物,諸如針對人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的疫苗，特別是針對HPV16和/或HPV18的DNA疫苗。本發明還涉及編碼同型二聚體肽的蛋白構建體，所述肽可以由DNA疫苗釋放或單獨使用。本申請還描述了藥物制劑、用于產生所述疫苗的宿主細胞和方法以及用于治療各種HPV誘發的疾病(諸如癌癥和傳染病)的方法。
[0002]發明背景
[0003]現在充分確定人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌(cervical cancer)和其他HPV-相關的惡性病的病因，所述其他HPV-相關的惡性病諸如肛門生殖器癌(anogenital cancers)(肛門癌、外陰癌、陰道癌和陰莖癌)和頭頸癌(head and neck cancers)的子集。具體地，HPV16和HPV18是造成全世界全部宮頸癌中的大約70%的原因。
[0004]迄今為止，有兩種預防性HPV疫苗在售(嘉德西爾(Gardasil)和人乳頭瘤病毒疫苗(Cervarix))。所述預防性疫苗的目的在于通過刺激對HPV病毒衣殼蛋白LI和L2特異性的中和抗體的產生而誘導體液免疫應答。盡管預防性疫苗是控制HPV誘發的宮頸癌以及可能的其他HPV相關的惡性病的重要的里程碑，但是這些疫苗的作用將不會被明顯觀察到持續 20-40 年(Ma B 等人，Current Cancer Therapy Reviews (當代癌癥治療綜述),2010)。并且，由于除了全世界已經感染HPV的大量人群之外，關于預防性疫苗的大量接種的覆蓋目前還是有限的，因此HPV相關的惡性病持續發展。因此，為了減少HPV相關的惡性病及其前體病變的死亡率和發病率，開發HPV特異性的治療性疫苗是重要的(Ma B等人，CurrentCancer Therapy Reviews (當代癌癥治療綜述),2010)。
[0005]在最近的二十年間，多種癌癥疫苗和癌癥免疫治療策略的開發已經擴大。然而，目前只有一種稱為Provenge (Dendreon INC)的治療性癌癥疫苗被核準用作前列腺癌(prostate cancer)的標準治療。特別地，由于倫理原因，大部分治療性癌癥疫苗是在攜帶晚期腫瘤的患者組中進行檢測的。該患者組基本上是免疫抑制的，意指腫瘤細胞已經長期避開免疫系統并且在癌癥發生過程中有助于誘導對腫瘤的免疫耐受性。另外，為了在患者中誘導腫瘤特異性免疫應答并避免可能導致嚴重不利事件的對健康細胞的殺傷，用作疫苗的抗原的選擇(腫瘤特異性的相對于腫瘤相關的)是至關重要的。因此，癌癥免疫治療的主要挑戰是破壞所述免疫耐受性并激活腫瘤特異性效應子功能以識別并殺死腫瘤細胞。盡管一些病例報告顯示了在晚期腫瘤患者中對治療性癌癥疫苗的臨床反應，但是最常見的初級終點是與常規治療法(手術、化療和放療)相比觀察對整體存活的影響。然而，大部分研究要么不是決定性的，要么它們完全沒有表明此。陰性結果的一個原因首先在于攜帶被刺激進行治療的終末期腫瘤的患者組。可能的策略是在治療性疫苗試驗中包括患有早期腫瘤的患者。
[0006]一種策略是靶向癌前病變。該策略的挑戰主要在于缺少由癌前病變特異性表達的針對多種組織的可靠的生物標記和差的醫學篩查(不存在或者現有方法缺乏靈敏性)。例外的是，對于HPV誘發的惡性病不是這樣的情形。例如，大部分西方國家具有良好的通過進行巴帕尼科拉烏試驗(Pap涂片試驗)進行的宮頸發育異常(cervical dysplasia)和宮頸癌(cervical cancer)的篩查項目。如果Pap涂片試驗的結果不清楚或異常,則進行陰道鏡檢查(國家宮頸癌聯合會(Nat1nal Cervical Cancer Coalit1n))。還可以將HPV-檢測推薦給一些患者，以檢測癌前病變中存在的“高危險性”HPV-類型。因此，HPV代表一種潛在的針對HPV相關的癌前病變的生物標記，特別是針對宮頸上皮發育異常(cervicalintraepithelial dysplasia, CIN)的生物標記。
[0007]DNA疫苗已經顯示出日益增加的用于治療人類疾病、特別是癌癥的希望。DNA疫苗誘導強抗原-特異性免疫應答并且可以重復施用以維持靶標-特異性的免疫應答。與其他癌癥治療形式相比，此類疫苗被認為是安全的、簡單的和便宜的，從而能夠大規模制備。許多免疫治療性干預不能誘導免疫記憶。例外地，DNA接種確保疫苗產品在體內持續釋放，這增強抗原-特異性免疫記憶。將抗原直接遞送至專門的抗原呈遞細胞(APCs)在體內刺激⑶4+和⑶8+T細胞免疫應答二者。已經證明此類強細胞免疫應答在體外和體內都特異性識別并有效地殺傷抗原-陽性惡性細胞。
[0008]本領域中對于用于誘導針對造成傳染病和癌癥的HPV的強而特異性的免疫應答的改善的疫苗仍然存在需求。
[0009]發明目的
[0010]本發明實施方案的目的是提供特異性且高度有效的治療化合物，諸如針對由HPV引起的疾病和病癥的DNA疫苗。
[0011]發明概述
[0012]本發明人已經發現，通過組合HPV (諸如HPV16和/或HPV18)的早期基因產物E6和E7的抗原與hMIP-Ι α的靶向模塊，提供治療性疫苗，其中HPV基因產物的強免疫原性表位被高效地呈遞至APCs，從而誘導特異性且強烈的免疫反應。本發明所述的產品主要考慮為治療性核酸疫苗，諸如DNA疫苗，其中編碼疫苗體(vaccibody)構建體的核酸構建體用作在接受該疫苗的人中引起在體內產生蛋白產物的治療化合物。然而，作為一種備選方案，所述蛋白產物本身可以被直接配制并且用在疫苗中。
[0013]因此，在第一方面，本發明涉及兩個相同氨基酸鏈的同型二聚體蛋白，每個氨基酸鏈包含:(1)信號肽，(2)靶向單元，(3) 二聚化基序和(4)抗原單元，所述靶向單元包含與SEQ ID NO:1的氨基酸序列24-93具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原單元包含人乳頭瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，諸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原單元，諸如來源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原單元。
[0014]在第二方面，本發明涉及包含下述的氨基酸鏈:(I)信號肽，⑵靶向單元，⑶二聚化基序和(4)抗原單元，所述靶向單元包含與SEQ ID NO:1的氨基酸序列24-93具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原單元包含人乳頭瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，諸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原單元，諸如來源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原單元，所述氨基酸鏈能夠形成本發明所述的同型二聚體蛋白。
[0015]在第三方面，本發明涉及編碼氨基酸鏈的核酸分子，諸如DNA，所述氨基酸鏈包含:(I)信號肽，⑵靶向單元，⑶二聚化基序和⑷抗原單元，所述靶向單元包含與SEQ IDNO:1的氨基酸序列24-93具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原單元包含人乳頭瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，諸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原單元，諸如來源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原單元，所述氨基酸鏈能夠形成本發明所述的同型二聚體蛋白。
[0016]在另一方面，本發明涉及本發明所述的同型二聚體蛋白，或本發明所述的氨基酸鏈，或本發明所述的核酸分子，其用作藥物。
[0017]在另一方面，本發明涉及包含本發明所述的同型二聚體蛋白或本發明所述的氨基酸鏈或本發明所述的核酸分子的藥物組合物。
[0018]在另一方面，本發明涉及包含本發明所述的核酸分子的宿主細胞。
[0019]在另一方面，本發明涉及用于制備本發明所述的同型二聚體蛋白或本發明的氨基酸鏈的方法，所述方法包括:a)將本發明所述的核酸分子轉染到細胞群中；b)培養所述細胞群；c)收集并且純化由所述細胞群表達的所述同型二聚體蛋白或氨基酸鏈。
[0020]在另一方面，本發明涉及用于制備包含免疫有效量的本發明所述的核酸分子的疫苗如DNA疫苗的方法，所述方法包括:a)制備本發明所述的核酸分子；b)將步驟a)中獲得的所述核酸分子溶解在藥用載體、稀釋劑或緩沖劑中。
[0021]在另一方面，本發明涉及針對HPV的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的本發明所述的同型二聚體蛋白或本發明所述的氨基酸鏈或本發明所述的核酸分子如DNA，其中所述疫苗能夠引發T細胞-和B細胞免疫應答。
[0022]在另一方面，本發明涉及治療或預防患者中HPV誘發的疾病或病癥(如由HPV引起的癌癥或傳染病)的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本發明所述的同型二聚體蛋白或本發明所述的氨基酸鏈或本發明所述的核酸分子，如DNA。
[0023]附圖圖例
[0024]圖1:具有E7/E6融合抗原的疫苗體疫苗的整體結構。顯示的是DNA和蛋白兩種形式。所述疫苗體由三個功能模塊組成；在靶向模塊中的趨化因子人MIP-1a (LD78i3)，在二聚化模塊中的來自人IgG3的鉸鏈和CH3序列和在疫苗模塊中的全長E7和/或E6融合體。
[0025]圖2:關于針對HPV-誘發的惡性病的疫苗體DNA疫苗的提議的作用模式。皮內注射編碼疫苗體的裸DNA質粒，然后電穿孔。所述質粒被局部細胞攝入，并且產生和分泌疫苗體蛋白。趨化靶向模塊吸引CCRl和CCR5表達抗原呈遞細胞(APC)并且確保結合并攝入至樹突細胞(DC)中。所述DC將抗原肽呈遞至⑶4+和⑶8+T細胞，并且⑶8+T細胞將殺死宮頸中感染和轉化HPV的細胞。
[0026]圖3:顯示作為施用的不同量的疫苗的函數的E7和E6特異性T細胞反應數目的ELISP0T結果。在第O天和第7天，C57BL/6小鼠皮內注射編碼VB1009和VB1016的裸DNA質粒及其相對應的對照，然后電穿孔(Cellectis，法國)在第21天收集脾細胞，并用I類MHC-限制型E7或E6肽刺激24小時。通過ELISP0T計算分泌IFN Y的脾細胞的數目。(A)用25 μ g VB1009、對照I (單獨的抗原)和pUMVC4a(空載體)皮內接種后的E7-特異性反應。(B)用12.5和1.4ygVB1016、對照2(單獨的抗原)和pUMVC4a(空載體)皮內接種后的E7-特異性反應。(C)用12.5和1.4 μ g VB1016、對照2 (單獨的抗原)和pUMVC4a (空載體)皮內接種后的E6-特異性反應。
[0027]圖4:通過測量腫瘤體積顯示的VB1016的治療作用。C57BL/6小鼠在第O天皮下注射5x10s個TC-1細胞。在第3天和第10天，小鼠皮內注射12.5 μ g編碼VB1016的裸DNA質粒、對照2或空載體，然后電穿孔(Cellectis，法國)。每周用卡鉗測量腫瘤尺寸二至三次,并且計算腫瘤體積。
[0028]圖5:通過測量腫瘤體積顯示的VB1016的治療作用。C57BL/6小鼠在第O天在頸部區域皮下注射5xl04個TC-1細胞。在第3、7天和第10天，小鼠皮內注射20 μ g或2 μ g編碼VB1016的裸DNA質粒、對照2或空載體，然后電穿孔(Cellectis，法國)。每周用卡鉗測量腫瘤尺寸二至三次，并且計算腫瘤體積。
[0029]圖6:通過測量腫瘤體積顯示的VB1020和VB1021的治療作用。C57BL/6小鼠在第O天在大腿皮下注射5xl04個TC-1細胞。在第3天和第10天，小鼠皮內注射10 μ g編碼VB1016、VB1020、VB1021的裸DNA質粒或空載體，然后電穿孔(Cellectis，法國)。每周用卡鉗測量腫瘤尺寸二至三次，并且計算腫瘤體積。
[0030]發明詳述
[0031]由本發明的發明人在本文中所述的構建體和DNA疫苗技術(也稱為“疫苗體”分子/疫苗/構建體)代表一種新穎的誘導針對傳染病和癌癥的強烈且特異性的免疫應答的疫苗策略。本文所述的HPV E6/E7，諸如HPV16或HPV18E6/E7疫苗，可以作為DNA疫苗通過皮內注射而施用，優選接著進行電穿孔。這導致編碼疫苗體-HPV16和/或HPV18E6/E7疫苗的DNA-構建體攝入到注射部位(真皮)的細胞中，包括樹突細胞(朗格漢斯細胞)，導致在體內產生所述疫苗體-E6/E7分子。
[0032]來自“高危險性” HPV類型如HPV16和18的早期基因產物E6和E7可能負責基細胞-上皮細胞(basal-eithelium cells)的轉化和癌前病變的誘導。這兩種蛋白由高度免疫原性的表位組成，并且在本文中顯示出誘導導致“高危險性”HPV陽性腫瘤細胞在體外和體內的特異性清除的強免疫應答。
[0033]本文所述的疫苗體分子是由三個模塊組成的同型二聚體:靶向模塊，二聚化模塊和疫苗模塊(圖1)。編碼這三個模塊的基因被遺傳改造作為一個基因被表達。當在體內表達時，所述疫苗體分子靶向抗原呈遞細胞(APCs)，與相同的非靶向性的抗原相比，這導致增強的抗原效力。趨化因子人巨噬細胞炎性蛋白la (hMIP-la/LD78^)的體內表達導致將DCs、嗜中性粒細胞和其他攜帶CCRl和CCR5受體的免疫細胞吸引至表達位點。由此，由hMIP-1 a作為靶向模塊組成的疫苗體分子不僅使抗原靶向特定的細胞，而且另外通過將特定的免疫細胞招募至注射部位而提供反應-放大作用(佐劑作用(adjuvant effect))。這種特有的機制在其中由于疫苗本身提供佐劑作用而使患者可能接受不含任何另外的佐劑的疫苗的臨床設置中是非常重要的。
[0034]本發明的發明人在本文中描述了疫苗構建體，其中抗原模塊由與來源于HPV16或HPV18亞型的E6全長序列融合的E7全長遺傳序列組成。這種形式的優點在于E6和E7存在于一種構建體中，并且由此可以在體內同等地表達。故而，由多個抗原單元組成的一種疫苗體分子可以代表用于免疫系統的相等水平的E6和E7。HPV16E6和E7基因產物以其天然形式是致癌的。為了中和它們的致癌特性，在E6和E7遺傳序列中可以引入在特定位點的突變。
[0035]可以在特定位點引入突變，包括缺失，已知所述位點抑制E6和E7的致癌特性，諸如在 Dalai S 等人，J Virol (病毒學雜志)，1996 ；Miinger K 等人，EMBO, 1989 ；NakagawaS 等人，Virology (病毒學)，1995 ；CrookT 等人，Cell (細胞)，1991 ；MiingerK 等人，HPVCompendium Online (在線HPV 目錄)，I997 (http.//www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf) ；Nguyen, M 等人，J Virol (病毒學雜志)，2002 ；NomineY 等人，Molecular Cell (分子細胞)，2006 ；Moody C 等人，NatRev Cancer (自然癌癥綜述),2010,Polakova I 等人，Vaccine (疫苗)，2010 ；Xie Q, Virologica Sinica, 2011 ；Mesplede T 等人，J Virol (病毒學雜志)，2012 ；US2008/0102084和US6306397任一篇參考文獻中所述的任意一個位點，所述參考文獻通過引用結合于此。因此，在本發明的一些方面中，本發明所述的構建體包含在HPV16E6、E7任一種或二者的已知抑制致癌特性的位置具有一個或多個突變的HPV16E6、E7或HPV16E6/E7嵌合構建體，所述位置如Dalai S等人，J Virol (病毒學雜志)，1996 ；Miinger K 等人，EMBO, 1989 ；Nakagawa S 等人，Virology (病毒學)，1995 ；Crook T 等人，Cell (細胞)，1991 ；Miinger K 等人，HPV Compendium Online (在線 HPV 目錄),1997 (http://www.stdgen.lanl.gov/C0MPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf) ；Nguyen, M 等人，J Virol (病毒學雜志)，2002 ；NomineY 等，Molecular Cell (分子細胞)，2006 ；Moody C 等人，Nat Rev Cancer (自然癌癥綜述),2010, Polakova I 等人，Vaccine (疫苗)，2010 ；Xie Q,Virologica Sinica, 2011 ；Mesplede T 等人，J Virol (病毒學雜志)，2012 ；US2008/0102084或US6306397中所述。在本發明的另一方面，本發明所述的構建體包含在HPV18E6、E7任一種或二者的已知抑制致癌特性的位置具有一個或多個突變的HPV18E6、E7或HPV18E6/E7嵌合構建體，所述位置如Dalai S等人，J Virol (病毒學雜志)，1996 ；Munger K等人，EMBO,1989 ；Nakagawa S等人,Virology (病毒學)，1995 ；Crook T等人，Cell (細胞)，1991 ；MiingerK 等人，HPV Compendium Online (在線 HPV 目錄)，1997 (http://www.stdgen.lanl.gov/C0MPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf) ；Moody C 等人，Nat Rev Cancer (自然癌癥綜述)，2010，US2008/0102084 或 US6306397 中所述。
[0036]存在這樣的可能性，即，疫苗體-結構部分(靶向和二聚化模塊)在最終融合蛋白中可以根除E6和E7野生型蛋白的致癌特性。因此，本發明的另一方面是野生型全長E6和/或E7序列在所述疫苗體構建中的應用。
[0037]本發明描述了疫苗體HPV治療性DNA疫苗的幾種變體，其全部是基于圖1所述的整體形式，所述治療性疫苗體-HPV DNA疫苗編碼在人中天然表達的基因；靶向模炔基因編碼趨化因子hMIP-Ι α，其與其在APCs細胞表面上表達的相關受體CCRl和CCR5結合。二聚化模炔基因可以編碼鉸鏈區和恒定重鏈3，諸如來自人IgG3的鉸鏈區和恒定重鏈3，其連接兩個疫苗體單體，產生同型二聚體分子。用于所述策略的編碼疫苗模塊的基因由HPV組成，諸如HPV16和/或HPV18E7和E6抗原，諸如全長HPV16E7和E6抗原，任選地包含一個或多個突變以抑制致癌特性。一旦通過皮內注射進行體內施用接著進行電穿孔，攝入所述疫苗構建體的真皮細胞將表達所述疫苗體-HPV分子。該體內產生的疫苗體疫苗靶向皮膚中在APCs、特別是DCs表面上表達的CCRl和CCR5。所述疫苗體分子與其相關受體的結合導致該復合物在APC中的內在化，蛋白降解成小肽，所述小肽負載在MHC分子上并且呈遞至⑶4+和⑶8+T細胞上，從而誘導HPV16E6和E7特異性免疫應答。當被刺激時并且在激活的⑶4+T細胞的幫助下，⑶8+T細胞將靶向并且殺死表達HPV16E6和E7的細胞(圖2)。此類針對具有“內置”佐劑作用的疫苗的增強的免疫應答可以通過破壞免疫耐受性而有力地克服腫瘤-逃逸(腫瘤免疫監視)并且有效地殺死惡性細胞。hMIP-Ι α靶向單元可以通過二聚化基序(如鉸鏈區)與抗原單元連接，其中后者在C00H-末端或在ΝΗ2-末端。本發明不僅涉及編碼該重組蛋白的DNA序列，還涉及包含這些DNA序列的表達載體，包含所述表達載體的細胞系，涉及優先通過疫苗體DNA、疫苗體RNA或疫苗體蛋白免疫治療哺乳動物，并且最后涉及包含所述分子的藥物和試劑盒。
[0038]在本發明所述的蛋白中的二聚化基序可以構建成包含鉸鏈區和免疫球蛋白結構域(例如，C Y 3結構域)，例如，羧基端C結構域(Ch3結構域)，或與所述C結構域基本上相同的序列。所述鉸鏈區可以是Ig來源的，并且有助于通過形成鏈間共價鍵(例如，二硫鍵)而二聚化。另外，其作用為在各結構域之間的靈活的間隔臂，允許兩個靶向單元同時結合在APC上表達的具有可變距離的兩個靶分子。免疫球蛋白結構域有助于通過非共價相互作用(例如疏水相互作用)而同型二聚化。在優選的實施方案中，Ch3結構域來源于IgG。這些二聚化基序可以與其他多聚體化結構部分(例如，來自其他Ig同種型/亞類)交換。優選地，所述二聚化基序來源于天然人蛋白，諸如人IgG。
[0039]應該理解，關于抗原單元和靶向單元，所述二聚化基序可以具有任意的方向。在一個實施方案中，所述抗原單元在所述二聚化基序的COOH-末端，而所述靶向單元在所述二聚化基序的N-末端。在另一個實施方案中，所述抗原單元在所述二聚化基序的N-末端，而所述靶向單元在所述二聚化基序的COOH-末端。
[0040]國際申請W02004/076489 (其通過引用結合于此)公開了可以按照本發明使用的核酸序列和載體。
[0041]本發明所述的蛋白包括來源于HPV的抗原單元，諸如HPV16E7和E6抗原，諸如全長HPV16E7和E6抗原，及其免疫原性片段或變體。抗原序列應該是充分長度的。所述抗原單元的最小長度可以大約是9個氨基酸。因此，在一些實施方案中，來源于HPV的抗原單元包含與編碼所述抗原單元的核酸序列中的至少約27個核苷酸相對應的至少9個氨基酸的氨基酸序列。優選地，來源于HPV的抗原單元是相當長的，諸如全長HPV16E7和E6抗原。通過在編碼區(以<2%的頻率)和非編碼區(以<5%的頻率)的有限的核苷酸改變在給定的HPV基因型中產生多樣性(Bernard，HU等人，Iht J Cancer(國際癌癥雜志)，2006)。此類變體在系統發生上基于其地理起源而分離，并且因此是標記的歐洲、非洲、亞洲、亞洲-美洲和北美變體。此類序列插入到疫苗體形式中可能導致兩個臂的免疫應答的激活。
[0042]通過疫苗體蛋白、疫苗體DNA或疫苗體RNA的免疫都是本發明所述的可能的方法，例如，后面兩種通過肌內或皮內注射用或不用隨后的電穿孔執行。
[0043]如上文所討論的，本發明涉及針對由HPV引起的癌癥或傳染病的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含免疫有效量的編碼本發明的分子的核酸或其簡并變體。所述疫苗能夠引發T細胞-和B細胞免疫應答。本發明還涉及用于診斷、醫學或科學目的的包含疫苗體DNA、RNA或蛋白的試劑盒。
[0044]本發明還涉及制備本發明的重組分子的方法，所述方法包括:將包含本發明的分子的載體轉染到細胞群中；培養所述細胞群；收集由所述細胞群表達的重組蛋白；并且純化所表達的蛋白。
[0045]上述核苷酸序列可以插入到適用于基因治療的載體中，例如，在特定啟動子的控制下，并且引入到細胞中。在一些實施方案中，包含所述DNA序列的載體是病毒，例如，腺病毒(adenovirus),痘苗病毒(vaccinia virus)或腺伴隨病毒(adeno-associated virus)。在一些實施方案中，使用反轉錄病毒作為載體。適當的反轉錄病毒的實例例如MoMuLV或HaMuSV。為了基因治療的目的，本發明所述的DNA/RNA序列還可以以膠體分散液形式被轉運到祀細胞中。例如，其包含脂質體或lipoplexes。
[0046]本發明包括與本文限定的氨基酸序列或與具有本文限定的特定特性的多肽具有最小程度的序列同一性或序列同源性的靶向單元以及抗原單元的應用。具體地，本發明包括用于本發明所述的構建體的肽變體或肽單元的應用，所述肽變體或肽單元與SEQ ID NO:I, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO -J, SEQ ID NO:9, SEQ IDNO:11, SEQ ID NO:13, SEQID NO:15, SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ IDNO:24, SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34中的任一種具有一定程度的序列同一性。此處，術語“變體”意指與主題氨基酸序列或主題核苷酸序列具有特定程度的序列同一性的實體，其中所述主題氨基酸序列優選為 SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO -J, SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ IDNO:11, SEQID NO:12, SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ IDNO:17，SEQ IDNO: 18，SEQ ID NO: 19，SEQ IDNO:20, SEQ ID NO:21,SEQ IDNO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34。
[0047]在一個方面，變體或片段氨基酸序列和/或核苷酸序列應該提供和/或編碼保留下述序列的多肽的功能活性和/或增強下述序列的多肽的活性的多肽:SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15,SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24, SEQID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ IDNO:32 或 SEQ ID NO:34。
[0048]在本發明的情形中，變體序列視為包括可能與主題序列至少80%、至少85%、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %相同的氨基酸序列。典型地，按照本發明使用的變體包含與主題氨基酸序列相同的活性位點等。盡管同源性也可以被認為是相似性(即，具有相似化學特性/功能的氨基酸殘基)，但是在本發明的情形中，優選用序列同一性來表示同源性。
[0049]序列同一性比較可以通過眼睛進行，或者更為通常地，用容易獲得的序列比較計算機程序輔助進行。這些商購的計算機程序使用復雜的比較算法來比對兩種以上的序列，最好地反映可能導致所述兩種以上的序列之間的差異的進化事件。因此，這些算法用評分系統進行操作，所述評分系統給相同或相似氨基酸的比對得分(rewarding)，并給缺口插入、缺口延伸和不相似氨基酸比對罰分(penalising)。所述比較算法的評分系統包括:
[0050]i)當每次插入缺口時給予罰分(缺口罰分)，
[0051]ii)當每次現有的缺口延伸額外位置時給予罰分(延伸罰分)，
[0052]i i i)當比對相同的氨基酸時給予高得分，和
[0053]iv)每當比對不相同的氨基酸時分配可變的得分(variable scores)。[0054]大部分比對程序允許修改缺口罰分。然而，當使用此類軟件用于序列比較時，優選使用默認值。
[0055]關于不相同氨基酸的比對給出的得分按照也稱為置換矩陣(substitut1nmatrix)的評分矩陣進行分配。以所述置換矩陣提供的得分反映以下事實:進化過程中一種氨基酸被另一種氨基酸置換的可能性是變化的并且取決于要被置換的氨基酸的物理/化學性質。例如，極性氨基酸被另一個極性氨基酸置換的可能性高于被疏水氨基酸置換的可能性。因此，所述評分矩陣為相同的氨基酸分配最高得分，為不相同但是相似的氨基酸分配較低的得分，并且為不相同不相似的氨基酸分配甚至更低的得分。最經常使用的評分矩陣是 PAM 矩陣(Dayhoff 等人(1978)，Jones 等人(1992))，BLOSUM 矩陣(Henikoff 和Henikoff (1992))以及 Gonnet 矩陣(Gonnet 等人(1992))。
[0056]適于進行所述比對的計算機程序包括但不限于，Vector NTI (Invitrogen Corp.)和 ClustalV、Clustalff 和 Clustalff2 程序(Higgins DG&Sharp PM(1988), Higgins 等(1992), Thompson等(1994), Larkin等(2007))。不同比對工具的選擇可以從ExPASy蛋白質組學服務器(www.expasy.0rg)獲得。可以進行序列比對的軟件的另一個實例是BLAST (基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)),該軟件可在國家生物技術信息中心(Nat1nal Center for B1technology Informat1n)的網頁上找到(目前可以在http://www.ncb1.nlm.nih.gov/處找到),并且該軟件首先描述于Altschul等(1990) J.Mol.B1l.(分子生物學雜志)215 ;403_410。
[0057]在所述軟件生成比對后，可能的是計算％相似性和％序列同一性。所述軟件通常將此作為序列比較的部分進行并且產生數值結果。
[0058]在一個實施方案中，優選的是使用ClustalW軟件用于進行序列比對。優選地，利用ClustalW的比對以下述參數用于成對比對:
[0059]
【權利要求】
1.兩個相同的氨基酸鏈的同型二聚體蛋白，每個氨基酸鏈包含:(1)信號肽，(2)靶向單元，(3) 二聚化基序和(4)抗原單元，所述靶向單元包含與SEQ ID NO:1的氨基酸序列24-93具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原單元包含人乳頭瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，諸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原單元，諸如來源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原單元。
2.根據權利要求1所述的同型二聚體蛋白，其中所述氨基酸鏈中的所述靶向單元、二聚化基序和抗原單元從N-端至C-端的順序為靶向單元、二聚化基序和抗原單元。
3.根據權利要求1或2任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述信號肽由與SEQID NO:I的氨基酸序列1-23具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列組成。
4.根據權利要求3所述的同型二聚體蛋白，其中所述信號肽由與SEQID NO:1的氨基酸序列1-23具有至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%、如100%的序列同一性的氨基酸序列組成。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述靶向單元由與SEQIDNO:1的氨基酸序列24-93具有至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至 少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列組成。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述二聚化基序包含鉸鏈區和任選地促進二聚化的另一個結構域，如免疫球蛋白結構域，它們任選地通過接頭連接。
7.根據權利要求6所述的同型二聚體蛋白，其中所述鉸鏈區是Ig來源的，諸如來源于IgG3。
8.根據權利要求6-7中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述鉸鏈區具有形成一個、兩個或數個共價鍵的能力。
9.根據權利要求8所述的同型二聚體蛋白，其中所述共價鍵是二硫鍵。
10.根據權利要求6-9中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白結構域是羧基端C結構域，或是與所述C結構域基本上相同的序列或其變體。
11.根據權利要求10所述的同型二聚體蛋白，其中所述羧基端C結構域來源于IgG。
12.根據權利要求6-11中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白結構域具有同型二聚化的能力。
13.根據權利要求6-12中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述免疫球蛋白結構域具有通過非共價相互作用同型二聚化的能力。
14.根據權利要求13所述的同型二聚體蛋白，其中所述非共價相互作用是疏水相互作用。
15.根據權利要求1-14中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述二聚化結構域不包含CH2結構域。
16.根據權利要求1-15中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述二聚化基序由通過接頭與人IgG3的Ch3結構域連接的鉸鏈外顯子hi和h4組成。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述二聚化基序由與SEQ ID NO: 3的氨基酸序列94-237具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列組成。
18.根據權利要求2-17中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述接頭是G3S2G3SG接頭。
19.根據權利要求1-18中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元和所述二聚化基序通過接頭連接，所述接頭如GLGGL接頭或GLSGL接頭。
20.根據權利要求1-19中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述靶向單元由SEQIDNO:1的氨基酸24-93或其變體組成。
21.根據權利要求1-20中任一項所述的同型二聚體蛋白，與具有由SEQID NO:1的氨基酸24-93或其變體組成的靶向單元的相同的同型二聚體蛋白的親和力相比較，所述同型二聚體蛋白具有增加的針對選自CCR1、CCR3和CCR5的任一種趨化因子受體的親和力。
22.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含與SEQ ID NO:3的氨基酸序列243-293具有至少80 %、如至少81 %、如至少82 %、如至少83 %、如至少84%、如 至少85 %、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
23.根據權利要求1-22中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元由與SEQID NO:3的氨基酸序列243-293具有至少80 %、如至少81 %、如至少82 %、如至少83 %、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列組成。
24.根據22或23所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含在選自由SEQIDNO:22的F47、L50、C63、C106和1128組成的列表的位置處的一個或多個氨基酸置換，或涉及選自由SEQ ID NO:22的Y43-L50組成的列表的一個或多個氨基酸的缺失。
25.根據權利要求1-23中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:9 的氨基酸序列 243-293,或其變體或抗原片段。
26.根據權利要求1-23中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元由SEQIDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的氨基酸序列243-293或其變體或抗原片段組成。
27.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含與SEQ ID NO:11的氨基酸序列243-340具有至少80%、如至少81 %、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
28.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元由與SEQID NO: 11的氨基酸序列243-340具有至少80 %、如至少81%、如至少82 %、如至少83 %、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92 %、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列組成。
29.根據權利要求27或28所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含在選自由SEQ ID NO:23的C24、E26、C58、C61、C91和C94組成的列表的位置處的一個或多個氨基酸置換，或涉及選自由SEQ ID NO:23的L22-E26和/或C58-C61和/或C91-S95組成的列表的一個或多個氨基酸的缺失。
30.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含SEQID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸序列 243-340，或其變體或抗原片段。
31.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元由SEQIDNO:11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸序列 243-340 或其變體或抗原片段組成。
32.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含與SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:32 或 SEQ ID NO:34 的氨基酸序列 243-501 具有至少80%、如至少81 %、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
33.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元由與SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:32 或 SEQ ID NO:34 的氨基酸序列 243-501 具有至少80%、如至少81 %、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列組成。
34.根據權利要求1-22、24-25、27、29-30、32-33中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含來源于早期蛋白E6和E7的人乳頭瘤病毒16(HPV16)的氨基酸序列。
35.根據權利要求32-34所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含在選自由SEQID NO:22 的 F47、L50、C63、C106 和 1128 和 SEQ ID NO:23 的 C24、E26、C58、C61、C91、C94 組成的列表的位置處的一個或多個置換。
36.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元由SEQIDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:32 或 SEQ ID NO:34 的氨基酸序列 243-501 或其變體或抗原片段組成。
37.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述氨基酸鏈由選自下述列表的氨基酸序列或其變體或抗原片段組成，所述列表由SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQIDNO:7,SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:11,SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ IDNO: 17, SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO:34 組成。
38.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元包含與選自 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO:25 中的任一種氨基酸序列具有至少80%、如至少81%、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
39.根據權利要求1-21中任一項所述的同型二聚體蛋白，其中所述抗原單元由與選自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO:25 中的任一種氨基酸序列具有至少80%、如至少81 %、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91 %、如至少92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的序列同一性的氨基酸序列組成。
40.根據權利要求1-39中任一項所述的同型二聚體蛋白，以其不帶有任何信號肽序列的成熟形式存在。
41.一種氨基酸鏈，其包含:(I)信號肽，(2)靶向單元，(3) 二聚化基序和⑷抗原單元，所述靶向單元包含與SEQ ID NO:1的氨基酸序列24-93具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原單元包含人乳頭瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，諸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原單元，諸如來源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原單元，所述氨基酸鏈能夠形成權利要求1-40中任一項所述的同型二聚體蛋白。
42.編碼權利要求41所述的氨基酸鏈的核酸分子，如DNA。
43.根據權利要求42所述的核酸分子，所述核酸分子是經過人密碼子優化的。
44.一種核酸分子,所述核酸分子包含選自下述列表的任一種核苷酸序列或其變體，所述列表由 SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:33組成。
45.根據權利要求42-44所述的核酸分子，其包含在載體中。
46.根據權利要求42-45中任一項所述的核酸分子，其配制用于施用給患者以在所述患者中誘導同型二聚體蛋白的產生。
47.根據權利要求1-40中任一項所述的同型二聚體蛋白，或根據權利要求41所述的氨基酸鏈，或根據權利要求42-46中任一項所述的核酸分子，其用作藥物。
48.一種藥物組合物，其包含權利要求1-40中任一項所述的同型二聚體蛋白，或權利要求41所述的氨基酸鏈,或權利要求42-46中任一項所述的核酸分子。
49.包含權利要求42-46中任一項所述的核酸分子的宿主細胞。
50.—種用于制備權利要求1-40中任一項所述的同型二聚體蛋白或權利要求41的氨基酸鏈的方法，所述方法包括: a)將權利要求41-45中任一項所述的核酸分子轉染到細胞群中； b)培養所述細胞群； c)收集并純化由所述細胞群表達的所述同型二聚體蛋白或氨基酸鏈。
51.一種制備疫苗如DNA疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的權利要求42-46中任一項所述的核酸分子，所述方法包括: a)制備權利要求41-45中任一項所述的核酸分子； b)將在步驟a)中得到的核酸分子溶解在藥用載體、稀釋劑或緩沖劑中。
52.一種針對HPV的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的權利要求1-40中任一項所述的同型二聚體蛋白，或權利要求41所述的氨基酸鏈，或權利要求42-46中任一項所述的核酸分子，如DNA，其中所述疫苗能夠引發T細胞-和B細胞免疫應答。
53.根據權利要求52所述的疫苗，所述疫苗還包含藥用載體和/或佐劑。
54.一種用于治療或預防患者中HPV誘發的疾病或病癥如由HPV引起的癌癥或傳染病的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用權利要求1-40中任一項所述的同型二聚體蛋白，或權利要求41所述的氨基酸鏈，或權利要求42-46中任一項所述的核酸分子，如DNA。
55.根據權利要求54所述的方法，其中所述方法包括給有此需要的患者施用權利要求42-46之一所述的核酸分子，如DNA，然后進行電穿孔步驟。
56.根據權利要求54或55所述的方法，其中所述施用皮內或肌內進行。
【文檔編號】A61P31/20GK104039833SQ201280064089
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2011年12月21日
【發明者】奧勒·亨里克·布魯克, 阿格妮特·不倫瑞克·弗雷德里克森, 阿里·阿雷法德, 莫娜·瑪麗·林德貝里 申請人:瓦西博迪公司