專利名稱：作為治療和預防hcv感染藥物的抗hcv單克隆抗體的制作方法
作為治療和預防HCV感染藥物的抗HCV單克隆抗體本發明涉及作為治療和預防HCV感染藥物的針對丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白的單克隆抗體。HCV是一種具有外周衣殼(pericapsid)和單鏈RNA的屬于黃病毒家族的病毒。基于在不同HCV分離株中所觀察到的遺傳差異，這類病毒被分為6種不同的基因型，每種均以數字標記。每種基因型依次包含若干亞型，每種亞型均以字母標記。不同HCV基因型的流行和分布在世界各地不相同。在歐洲，主要的基因型是lb，而在北美流行的是基因型la。從臨床來看，確定基因型很重要，因為這種特征有助于確定對基于α干擾素和利巴韋林組合治療的潛在反應，這種組合治療是目前最常用的治療方式。事實上，基因型1和4對基于干擾素治療的反應性弱于基因型2、3、5和6。迄今為止，沒有被證實對丙型肝炎病毒真正有效的疫苗和免疫療法。盡管被賦予對不同病毒基因型的交叉反應性，HCV抗原結構的高變性至今仍阻礙可中和病毒的抗體的開發。因而需要具有這些特征的并由此在治療和預防HCV感染中真正有效的抗HCV抗體。現有技術中記載了針對HCV的抗體。例如，Burioni等，Hepatology第28卷第3 期，1998年，記載了編碼五種特異于HCV Ε2糖蛋白(HCV Ε2)的重組人抗體片段(Fab)的序列的克隆和鑒定，所述的抗體片段能夠結合不同病毒基因型的糖蛋白(交叉反應性)。在這篇文章所記載的Fab中，有一種抗體片段名為e20。Burioni等，1998，cit，記載了 e20在中和HCV E2結合中具有很高的最小活性(NOB活性)。然而，盡管具有高NOB活性，在國際專利申請WO 03/064473中，e20抗體片段被描述為即使以高濃度(80 μ g/ml)也不能中和病毒感染(參見特別是WO 03/064473第16頁第8_10行)。本申請的發明人驚奇地發現，與現有技術、特別是WO 03/064473所聲稱的相反， e20片段能夠在體外有效地中和不同HCV基因型的感染。這使得e20特別適合HCV中和以及清除HCV感染的細胞，并用作HCV感染免疫療法和免疫保護的藥劑。這種結果的獲得需要長期而復雜的實驗工作，其在后續的實驗部分詳細說明。在極端情況下，本申請發明人完成的實驗可以證明e20抗體片段展現了以下預料不到的特征-其在屬于基因型Ib的HCV株導致的自然感染過程中產生，但能夠結合所有已知 HCV基因型的糖蛋白(特別是基因型la、lbda、2b、3、4、5和6)并且因此是廣泛地交叉反應性的；-如通過基于HCV偽顆粒(HCVpp)的中和分析所測得的，其對HCV基因型la、lb、 2a和4具有特別高的中和能力；-e20結合HCV E2糖蛋白所必需的某些氨基酸殘基在HCV感染中也是必需的，這提示能夠逃避e20結合的突變體同時擁有降低的復制能力。 上述特征顯然有利于最終應用e20抗體片段作為HCV感染的免疫療法和免疫保護的藥劑。 因此，本發明的第一個目標是能夠結合來自多種不同HCV基因型的HCV E2糖蛋白的單克隆抗體或其片段，其作為治療或預防HCV感染的藥劑，其特征在于所述的單克隆抗體或其片段包含至少一個包含氨基酸序列SEQ ID NO :1或與SEQ ID NO :1具有至少90% 同一性的序列的重鏈可變區，以及至少一個包含氨基酸序列SEQ ID NO :2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的序列的輕鏈可變區。進一步優選的序列同一性百分比是至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98 %或99 %，其中所述表述“至少，，是指對于所列的每個百分比。在本發明的一個實施方式中，所述的重鏈可變區由核苷酸序列SEQ ID NO :3編碼， 并且所述輕鏈可變區由SEQ ID NO 4編碼。術語“抗體”意指任意種類的全長免疫球蛋白及其包含輕鏈可變區與重鏈可變區的任意片段，例如Fab、F(ab’)2、⑶R(互補決定區)，或同時包含重鏈與輕鏈可變區或⑶Rs 的單鏈抗體，或包含來源于免疫球蛋白重鏈可變區與輕鏈可變區的CDR片段的一個或更多個拷貝的骨架。這包括了命名為kFvs、diabodies、VHHs或分離的輕鏈或重鏈的功能性抗體片段。表述“抗體”進一步包含可通過在輕鏈可變區重排方法中應用e20抗體片段可變區序列，以構建具有改善親和力、穩定性和/或重組生產特性的VH/VL組合所產生的抗體。 表述“抗體”還包括任意類型的融合特異性全長免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的全長免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其可靶向所述e20抗體片段或免疫球蛋白至特定組織、細胞或可溶性蛋白結構。本發明的單克隆抗體優選是人的。本發明的抗體可以是游離形式或綴合形式。綴合形式是與能夠調節體內持續性、 促進或限制體內分布、降低對蛋白水解劑的敏感性、降低抗原性、提高細胞毒能力和/或易于在體液和組織中檢測的分子綴合的上述的抗體。適于綴合的分子的非限制例子包括人血清白蛋白，麥芽糖結合蛋白，谷胱甘肽-S-轉移酶，噬菌體外殼p3或p8蛋白，肽，糖，PEG或 PEG樣分子，動物、植物或微生物源毒素，細胞因子，酶，化學發光化合物，生物發光化合物， 金屬原子，放射性同位素，熒光化合物，標簽基團或磷酸化、糖基化、泛素化、蘇素化或內肽酶解的底物。為便于綴合，抗體的C末端或N末端可以是修飾的，例如，通過插入額外的氨基酸殘基，如一個或更多個可形成二硫橋的半胱氨酸殘基。本發明應用的抗體還可以連接人紅血球或其它細胞載體，連接特定制劑，或連接緩釋系統例如但不限于脂質體、樹形聚合物、微粒體、納米顆粒、微膠囊、病毒載體等等。本發明的另一目標是治療或預防HCV感染的藥物組合物，包含藥學有效量的上述定義的單克隆抗體或其片段。本發明的組合物可被施用給被HCV感染的或有感染風險的受試者。可以應用任何合適的施用途徑，包括胃腸外的、口服、眼、局部(topical)、局部區域(loco-regional)、灌腸或氣溶膠給藥。胃腸外給藥包括肌內注射、靜脈注射、淋巴管內注射、皮下或皮內注射及輸注。本發明的組合物可被制備成適合所選擇施用途徑的任意藥學形式，例如可注射溶液或懸浮液、輸液、片劑、膠囊、霜劑、軟膏、洗劑或栓劑形式。本發明的組合物包含作為有效成分的上述抗體或其片段，以及本領域技術人員知曉的合適的藥物輔料、載體或稀釋劑。本發明的進一步的目標是能夠特異性結合上述抗體或其片段獨特型的抗獨特型抗體。本發明的抗獨特型抗體可通過本領域技術人員本身已知的獲得抗獨特型抗體的傳統方法獲得。
本發明參照附圖在后續僅通過例證的方式提供的實驗部分進一步詳述，其中
圖1顯示了 e20與不同基因型來源的HCV E2糖蛋白的結合。數據顯示為陽性熒光細胞百分比。圖2顯示了通過應用展示來源于基因型la :UKN1A20. 8 (a)、E1E2基因型Ib UKN1B5. 23 (b)、E1E2 基因型 2a :UKN2A1. 2 (c)、E1E2 基因型 2b :UKN2B1. 1 (d)、E1E2 基因型 4 :UKN4. 21. 16(e)的E1-E2糖蛋白的病毒偽顆粒的Fab e20中和活性。(f)通過應用展示來源于不同基因型(UKN1A20. 8，UKN1B5. 23，UKN2A1. 2，UKN2B1. 1 ；UKN3A13. 6，UKN4. 21. 16， UKN5. 15. 11，UKN6. 5. 8)的 E1-E2 的病毒偽顆粒，15 μ g/ml Fab e20 的中和活性。圖3顯示了通過應用HCVcc系統(基因型加)的e20及其它抗HCV抗體(el37， AP33)的中和活性。在e20和陰性對照Fab(c33-3)存在時的JFH-I傳染性顯示為標準化至甘油醛-3-磷酸脫氫酶RNA的病毒RNA的量，其通過定量反轉錄PCR確定。實驗部分克降策略絲狀噬菌體表面展示的隨機組合文庫的制備代表了一種用于選擇高親和力人單克隆抗體的高度有效工具。實際上，基于噬菌體展示的選擇步驟非常靈活，并且可被優化用以選擇交叉反應的抗體。特別地，e20作為來源于一位58歲女性的B淋巴細胞庫的IgGl Fab片段克隆，該女性持續一直感染有基因型Ib的HCV株。為選擇交叉反應克隆，源自患者的文庫經歷對來源于不同基因型病毒分離株的重組HCV E2糖蛋白的淘選，所述不同基因型是la。簡要地，用這種方法可以獲得在自然感染過程中產生的抗體，但其仍然能夠結合從未被所選擇研究患者的免疫系統遇到過的不同糖蛋白。重鏈和輕鏈序列研究e20重鏈及輕鏈基因的測序及其突變模式(表1)的研究表明，這種抗體來源于體細胞突變過程，這是一種為了提高抗體本身對抗原的親和力，在抗體克隆中通過持續接觸特異性抗原刺激的過程。關于重鏈，e20具有與胚系基因低于85%的核苷酸序列同源性。突變模式顯示了體細胞突變克隆的典型分布，在互補決定區(CDRs)具有特異性極化。對e20連接區域(產生⑶R3的連接區域)的檢查顯示其由屬于VH 1-69亞家族(一種在人抗HCV體液應答中高度表現的基因)的V基因、屬于D2-21亞家族的D基因以及屬于JH4亞家族的JH基因組成。以類似的方式，e20輕鏈(獨特型κ)具有與體細胞突變過程一致的突變百分比， 正如⑶Rs中的極化所示。對連接區域的檢查揭示了 e20輕鏈⑶R3來自κ V3-15亞家族的 κ V基因以及KJ5亞家族的κ J基因的連接。這些序列數據可以得出這樣一個結論e20不是一種人工抗體，而且正好相反，其實際存在于所選擇研究的患者的抗體庫中。^ 1a)
權利要求
1.作為治療或預防HCV感染藥物的能夠結合來自多種不同HCV基因型的HCVE2糖蛋白的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其片段含有至少一個包含氨基酸序列SEQ ID NO :1或與SEQ ID NO :1具有至少90%同一性的序列的重鏈可變區，以及至少一個包含氨基酸序列SEQ ID NO :2或與SEQ ID NO :2具有至少90%同一性的序列的輕鏈可變區。
2.權利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其能夠結合來自基因型la、lb、h、2b、3、4、 5和6的HCV E2糖蛋白。
3.權利要求1或2所述的單克隆抗體或其片段，其是全長免疫球蛋白或包含至少一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區的免疫球蛋白片段。
4.權利要求3所述的單克隆抗體或其片段，其中所述片段選自Fab、F(ab’)2、CDR(互補決定區)，或同時包含重鏈與輕鏈可變區或CDRs的單鏈抗體，或包含來源于免疫球蛋白重鏈可變區與輕鏈可變區的CDR片段的一個或更多個拷貝的骨架。
5.權利要求14任一項的單克隆抗體或其片段，其是游離形式的。
6.權利要求14任一項的單克隆抗體或其片段，其與能夠調節體內持續性、促進或限制體內分布、降低對蛋白水解劑的敏感性、降低抗原性、提高細胞毒能力和/或易于在體液和組織中檢測的分子綴合。
7.權利要求1-6任一項的單克隆抗體或其片段，其與能夠靶向所述抗體至特定組織、 細胞或可溶性蛋白結構的特異性全長免疫球蛋白或免疫球蛋白片段融合。
8.用于治療或預防HCV感染的藥物組合物，其包含藥物有效量的權利要求1-7任一項的單克隆抗體或其片段。
9.權利要求8的藥物組合物，其是適于胃腸外的、口服、眼、局部、局部區域、灌腸或氣溶膠施用的藥物劑型。
10.權利要求8或9的藥物組合物，其是可注射溶液或懸浮液、輸液、片劑、膠囊、霜劑、 軟膏、洗劑或栓劑形式。
11.權利要求1-7任一項的單克隆抗體或其片段用于制備治療或預防HCV感染藥物的用途。
12.能夠特異性結合權利要求1-7任一項的抗體或其片段的獨特型的抗獨特型抗體。
全文摘要
本發明涉及作為治療和預防HCV感染藥物的單克隆抗體e20或其功能性片段。e20抗體能夠結合所有已知的HCV基因型，并展示了很強的對所述病毒特別是基因型Ia、Ib、2a和4的中和活性。本發明還記載了用于治療或預防HCV感染的藥物組合物，其包含單克隆抗體e20或其功能性片段，以及藥學上可接受的輔料、載體或稀釋劑。
文檔編號A61K39/395GK102264393SQ200980152151
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月21日 優先權日2008年12月22日
發明者M·克萊門蒂, R·布里奧尼 申請人:波莫納·里切爾卡有限公司