一種PDL?1抗體、其藥物組合物及其用途的制作方法

本發明屬于腫瘤治療和分子免疫學領域，涉及一種抗pdl-1抗體、其藥物組合物及其用途。具體地，本發明涉及一種抗pdl-1的單克隆抗體。
背景技術：
：pd-1/pdl-1信號通路在調節免疫耐受、微生物感染及腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用。pd-1(programmedcelldeath1，程序性細胞死亡因子1)的表達主要在t細胞等免疫細胞，而pd-1的配體pdl-1主要在許多人類腫瘤組織呈高表達。應用免疫組織化學方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤、黑素瘤等多種人類腫瘤組織中檢測到pdl-1蛋白的表達，且pdl-1的表達水平和患者的臨床及預后緊密相關。阻斷pd-1/pdl-1信號通路可使被抑制的t細胞激活，進而攻擊癌細胞。阻斷pd-1/pdl-1信號可以促進腫瘤抗原特異性t細胞的增殖，發揮殺傷腫瘤細胞的作用，進而抑制局部腫瘤生長(julieretal.,2012，nengljmed.366:2455–2465)；pdl-1單抗可上調浸潤cd8+t細胞ifn-γ的分泌，表明pd-1/pdl-1信號通路的阻斷在以誘導免疫應答為目的的腫瘤免疫應答中發揮作用(blankcetal.,2006，int.j.cancer.119:317–327)。另外，pdl-1在體內還可以與b7-1結合。已有研究表明pdl-1/b7-1復合物也是t細胞活化的負信號，二者的結合可以導致t細胞表面活化標記物的表達下降，抑制t細胞增殖等。il-2(interlukin2，白細胞介素2)是由th細胞分泌的一種淋巴因子，具有廣泛的免疫活性：①刺激t細胞增殖分化；②刺激產生殺傷性t淋巴細胞；③刺激nk細胞增殖分化，增強nk活性；⑤刺激產生淋巴因子激活的殺傷細胞(lak細胞)細胞，即淋巴細胞在il-2刺激下，經3-6天體外培養可成為一種對新瘤細胞具有強烈殺傷作用的細胞，稱為lak細胞。ifn-γ(interferon-γ，干擾素-γ)由t細胞產生，具有直接抑制腫瘤細胞增殖，增加表面mhc抗原和腫瘤壞死因子表達，抗腫瘤血管生成等多種抗腫瘤作用。近年來研究發現，ifn-γ可以通過調控腫瘤細胞的fas/fasl表達以及增強腫瘤細胞對fas所介導凋亡途徑的敏感性，使腫瘤細胞逃避免疫系統攻擊的能力降低，從而抑制腫瘤細胞的惡性增殖。目前，業界普遍認為針對pdl-1通路的抗體將導致治療多種腫瘤治療的突破性的進展：用于治療非小細胞性肺癌，腎細胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(hometm.b.,parisig.,etal.,anti-pd1therapyinmelanoma.seminoncol.2015jun；42(3):466-473)，白血病以及貧血病(heldsa,heinea,etal.,advancesinimmunotherapyofchronicmyeloidleukemiacml.currcancerdrugtargets.2013sep；13(7):768-74)。目前，尚需要開發新的具有更好的結合效率的抗pdl-1抗體，以有效地阻斷pd-1與pdl-1的結合，并且激活t淋巴細胞。技術實現要素：本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，利用哺乳動物細胞表達系統表達出重組的pdl-1作為抗原免疫小鼠，經小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合獲得雜交瘤細胞。發明人通過進行對大量樣本的篩選，得到了如下的雜交瘤細胞株：雜交瘤細胞株lt005，其于2015年8月4日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c2015133。本發明人驚奇地發現，雜交瘤細胞株lt005能夠分泌產生與pdl-1特異性結合的特異性單克隆抗體(命名為5c10)，并且該單克隆抗體能夠十分有效地阻斷pd-1與pdl-1的結合。另外，本發明人還發現了阻斷pd-1與pdl-1的結合的單克隆抗體5f10和9f6。進一步地，本發明人創造性地制得了抗pdl-1的人源化抗體，分別命名為5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2。更進一步地，本發明人創造性地對5c10h2l2的恒定區進行了突變，得到5c10h2l2-igg1mt抗體，有效地降低了adcc(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity)和/或cdc(complement-dependentcytotoxicity)。本發明人還驚奇地發現，本發明的抗體特別是5c10、5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1、5c10h2l2、5f10、9f6和5c10h2l2-igg1mt均能有效地結合人t細胞，并且激活t細胞，誘導人淋巴細胞分泌ifn-γ和il-2；具有用于制備防治肺癌、黑色素瘤、腎腫瘤、卵巢癌、白血病等癌癥以及貧血病的藥物的潛力。由此提供了下述發明：本發明的一個方面涉及一種單克隆抗體或其抗原結合片段，其中，所述單克隆抗體的重鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:15－17的cdr，和/或所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:18－20的cdr；或者所述單克隆抗體的重鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:29－31的cdr，和/或所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr；或者所述單克隆抗體的重鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:35－37的cdr，和/或所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr。5c10、5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2這5個單抗的cdr的氨基酸序列相同：hcdr1：gfslsnyd(seqidno:15)hcdr2：iwtggat(seqidno:16)hcdr3：vrdsnyrydepfty(seqidno:17)lcdr1：qsigtn(seqidno:18)lcdr2：yas(seqidno:19)lcdr3：qqsnswpyt(seqidno:20)。5f10單抗的cdr的氨基酸序列如下：hcdr1:gfdikdty(seqidno:29)hcdr2:idpadgnt(seqidno:30)hcdr3:arglgawfas(seqidno:31)lcdr1:qditns(seqidno:32)lcdr2:yts(seqidno:33)lcdr3:qqghtlppt(seqidno:34)。9f6單抗的cdr的氨基酸序列如下：hcdr1:gfnikdty(seqidno:35)hcdr2:idpangnt(seqidno:36)hcdr3:srgppggigeyiyamdy(seqidno:37)lcdr1:ssvsssy(seqidno:38)lcdr2:sts(seqidno:39)lcdr3:hqyhrsppt(seqidno:40)。上述cdr可以通過本領域技術人員所熟知的技術手段，例如通過vbase2數據庫根據imgt定義分析下面的重鏈可變區的氨基酸序列或者輕鏈可變區的氨基酸序列得到。在本發明的一些實施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中，所述重鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:2、seqidno:6和seqidno:10,和/或所述輕鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:4、seqidno:8和seqidno:12；或者所述重鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:21,和/或所述輕鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:23；或者所述重鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:25,和/或所述輕鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:27。在本發明的一些實施方式中，所述的單克隆抗體，其選自如下的(1)至(7)：(1)重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:2所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:4所示(5c10)；(2)重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:6所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:8所示(5c10h1l1)；(3)重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:10所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:12所示(5c10h2l2或5c10h2l2-igg1mt)；(4)重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:6所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:12所示(5c10h1l2)；(5)重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:10所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:8所示(5c10h2l1)；(6)重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:21所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:23所示(5f10)；(7)重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:25所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:27所示(9f6)。在本發明的一些實施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中，所述單克隆抗體或其抗原結合片段選自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互補決定區片段、單鏈抗體(例如，scfv)、人源化抗體、嵌合抗體或雙抗體。在本發明的一些實施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中，所述的單克隆抗體以小于大約100nm，例如小于大約10nm、1nm、0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm、0.3nm、0.2nm、0.1nm或更小的ec50結合pdl-1蛋白；優選地，所述ec50通過間接elisa方法測得。在本發明的一些實施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中，所述的單克隆抗體包括非-cdr區，且所述非-cdr區來自不是鼠類的物種，例如來自人抗體；優選地，所述單克隆抗體的恒定區選自人igg1、igg2、igg3或igg4的恒定區；優選地，所述單克隆抗體的恒定區選自突變的人igg1恒定區，更優選地，突變的人igg1恒定區為按照eu編號系統在234、235和237位點進行如下的1種、2種或3種突變：l234a、l235a和g237a。在本發明的一些實施方式中，所述的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述單克隆抗體是有雜交瘤細胞株lt005產生的單克隆抗體，所述雜交瘤細胞株lt005保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c2015133。本發明的另一方面涉及一種分離的核酸分子a，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區的核酸序列，其中，所述抗體的重鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:15－17的cdr；優選地，所述抗體的重鏈具有seqidno:2、seqidno:6或seqidno:10所示的氨基酸序列；更優選地，所述核酸分子具有seqidno:1、seqidno:5或seqidno:9所示的核苷酸序列；在另一個實施方案中，所述抗體的重鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:29－31的cdr，優選地，所述抗體的重鏈具有seqidno:21所示的氨基酸序列，更優選地，所述核酸分子具有seqidno:22所示的核苷酸序列；在另一個實施方案中，所述抗體的重鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:35－37的cdr，優選地，所述抗體的重鏈具有seqidno:25所示的氨基酸序列，更優選地，所述核酸分子具有seqidno:26所示的核苷酸序列。本發明的再一方面涉及分離的核酸分子b，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區的核酸序列，其中，所述抗體輕鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:18－20的cdr；優選地，所述抗體輕鏈可變區具有seqidno:4、seqidno:8或seqidno:12所示的氨基酸序列；更優選地，所述核酸分子具有seqidno:3、seqidno:7或seqidno:11所示的核苷酸序列；在另一個實施方案中，所述抗體的輕鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr，優選地，所述抗體的輕鏈具有seqidno:23所示的氨基酸序列，更優選地，所述核酸分子具有seqidno:24所示的核苷酸序列；在另一個實施方案中，所述抗體的輕鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr，優選地，所述抗體的輕鏈具有seqidno:27所示的氨基酸序列，更優選地，所述核酸分子具有seqidno:28所示的核苷酸序列。本發明的再一方面涉及一種分離的核酸分子c，其包含前述的核酸分子a，以及前述的核酸分子；可選地，核酸分子c還包括連接序列，其用于連接核酸分子a和核酸分子b。本發明的再一方面涉及一種載體，其包含本發明的分離的核酸分子a、分離的核酸分子b或分離的核酸分子c。本發明的再一方面涉及一種宿主細胞，其包含本發明的分離的核酸分子a、分離的核酸分子b或分離的核酸分子c，或者包含本發明的載體。關于上述的“分離的核酸分子a”“分離的核酸分子b”或“分離的核酸分子c”，其中字母a、b或c僅僅是為了描述清楚，或者用于區分，字母本身并不表示特別的含義。本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在合適的條件下培養本發明的宿主細胞，以及從細胞培養物中回收所述單克隆抗體或其抗原結合片段的步驟。本發明的再一方面涉及雜交瘤細胞株lt005，其保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c2015133。本發明的再一方面涉及一種單克隆抗體或其抗原結合片段，其能夠競爭結合雜交瘤細胞株lt005分泌的抗體或片段針對的抗原結合表位。優選的，所述抗體或其抗原結合片段具有以下任一活性效果：阻斷pdl-1與pd-1或b7-1結合的藥物，調節(例如下調)pdl-1活性或水平的藥物，解除pd-1或者pdl-1對機體免疫抑制的藥物，或者提高t淋巴細胞中ifn-γ和/或il-2表達的藥物。本發明的再一方面涉及一種偶聯物，其包括單克隆抗體或其抗原結合片段以及偶聯部分，其中，所述單克隆抗體為本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段，所述偶聯部分為可檢測的標記；優選地，所述偶聯部分為放射性同位素、熒光物質、發光物質、有色物質或酶。本發明的再一方面涉及一種試劑盒，其包括本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段，或者包括本發明的偶聯物；優選地，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別所述單克隆抗體或其抗原結合片段；任選地，所述第二抗體還包括可檢測的標記，例如放射性同位素、熒光物質、發光物質、有色物質或酶。本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段或者本發明的偶聯物在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測pdl-1在樣品中的存在或其水平。本發明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段或者本發明的偶聯物；可選地，其還包括藥學上可接受的載體和/或賦形劑。本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段或者本發明的偶聯物在制備預防和/或治療和/或輔助治療和/或診斷腫瘤或者貧血病的藥物中的用途；優選地，所述腫瘤選自乳腺癌、肺癌例如非小細胞性肺癌、肝癌、胃癌、腸癌例如結腸癌或直腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤、黑素瘤和白血病。本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段或者本發明的偶聯物在制備如下藥物中的用途：阻斷pdl-1與pd-1或b7-1結合的藥物，調節(例如下調)pdl-1活性或水平的藥物，解除pd-1或者pdl-1對機體免疫抑制的藥物，或者提高t淋巴細胞中ifn-γ和/或il-2表達的藥物。本發明的再一方面涉及一種在體內或體外方法，包括施加細胞以有效量的本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段或者本發明的偶聯物的步驟，所述方法選自如下：阻斷pdl-1與pd-1或b7-1結合的方法，調節(例如下調)pdl-1活性或水平的方法，解除pd-1或者pdl-1對機體免疫抑制的方法，或者提高t淋巴細胞中ifn-γ和/或il-2表達的方法。在本發明的一個實施方案中，所述方法是非治療目的的。本發明的再一方面涉及一種治療和/或預防腫瘤或者貧血病的方法，包括給予受試者有效量的本發明中任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段或者本發明的偶聯物的步驟；優選地，所述腫瘤選自乳腺癌、肺癌例如非小細胞性肺癌、肝癌、胃癌、腸癌例如結腸癌或直腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤、黑素瘤和白血病。在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。如本文中所使用的，當提及pdl-1蛋白(programmeddeath-ligand1,ncbigenbankid:np_054862.1)的氨基酸序列時，其包括pdl-1蛋白的全長，或者pdl-1的胞外片段pdl-1ecd或者包含pdl-1ecd的片段；還包括pdl-1ecd的融合蛋白，例如與小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)進行融合的片段。然而，本領域技術人員理解，在pdl-1蛋白的氨基酸序列中，可天然產生或人工引入突變或變異(包括但不限于置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學功能。因此，在本發明中，術語“pdl-1蛋白”應包括所有此類序列，包括所示的序列以及其天然或人工的變體。并且，當描述pdl-1蛋白的序列片段時，其不僅包括的序列片段，還包括其天然或人工變體中的相應序列片段。如本文中所使用的，術語ec50是指半最大效應濃度(concentrationfor50％ofmaximaleffect)，是指能引起50％最大效應的濃度。如本文中所使用的，術語“抗體”是指，是指通常由兩對多肽鏈(每對具有一條“輕”(l)鏈和一條“重”(h)鏈)組成的免疫球蛋白分子。抗體輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為igm、igd、igg、iga和ige。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區通過大約12或更多個氨基酸的“j”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個氨基酸的“d”區。各重鏈由重鏈可變區(vh)和重鏈恒定區(ch)組成。重鏈恒定區由3個結構域(ch1、ch2和ch3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(vl)和輕鏈恒定區(cl)組成。輕鏈恒定區由一個結構域cl組成。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(c1q)的結合。vh和vl區還可被細分為具有高變性的區域(稱為互補決定區(cdr))，其間散布有較保守的稱為構架區(fr)的區域。各vh和vl由按下列順序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4從氨基末端至羧基末端排列的3個cdr和4個fr組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(vh和vl)分別形成抗體結合部位。氨基酸至各區域或結構域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定義。術語“抗體”不受任何特定的產生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亞型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗體。如本文中所使用的，術語抗體的“抗原結合片段”是指包含全長抗體的片段的多肽，其保持特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為“抗原結合部分”。通常參見，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的。可通過重組dna技術或通過完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗體的抗原結合片段。在一些情況下，抗原結合片段包括fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互補決定區(cdr)片段、單鏈抗體(例如，scfv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。如本文中所使用的，術語“fd片段”意指由vh和ch1結構域組成的抗體片段；術語“fv片段”意指由抗體的單臂的vl和vh結構域組成的抗體片段；術語“dab片段”意指由vh結構域組成的抗體片段(ward等人,nature341:544-546(1989))；術語“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1結構域組成的抗體片段；術語“f(ab')2片段”意指包含通過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個fab片段的抗體片段。在一些情況下，抗體的抗原結合片段是單鏈抗體(例如，scfv)，其中vl和vh結構域通過使其能夠產生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子(參見，例如,bird等人,science242:423-426(1988)和huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988))。此類scfv分子可具有一般結構：nh2-vl-接頭-vh-cooh或nh2-vh-接頭-vl-cooh。合適的現有技術接頭由重復的ggggs氨基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接頭，但也可使用其變體(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本發明的其他接頭由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情況下，抗體的抗原結合片段是雙抗體，即，雙價抗體，其中vh和vl結構域在單個多肽鏈上表達，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對并且產生兩個抗原結合部位(參見，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:1121-1123(1994))。在另一些情況下，抗體的抗原結合片段是“雙特異性抗體”，指由第一抗體(片段)和第二抗體(片段)或抗體類似物通過偶聯臂所形成的偶聯物，偶聯的方式包括但不限于化學反應、基因融合和酶促。抗體的抗原結合片段可以是“多特異性抗體”包括例如：三特異性抗體和四特異性抗體，前者是具有三種不同抗原結合特異性的抗體，而后者是具有四種不同抗原結合特異性的抗體。例如，經設計的錨蛋白重復蛋白(darpin)，與igg抗體，scfv-fc抗體片段相連或其組合，如cn104341529a。抗il-17a的fynomer與抗il-6r抗體結合，如wo2015141862a1。在另一些情況下，抗體的抗原結合片段是“雙功能抗體偶聯物”，指由第一抗體(片段)和或第二生物學功能片段(非抗體及其類似物)通過偶聯臂所形成的偶聯物，偶聯的方式包括但不限于化學反應、基因融合和酶促，第二生物學功能片段包括具有結合活性多肽、蛋白、聚乙二醇(peg)，核素，核酸，小分子毒素，受體或配體等，該偶聯物保留了各自抗體的活性，故具有雙功能和雙特異性。可使用本領域技術人員已知的常規技術(例如，重組dna技術或酶促或化學斷裂法)從給定的抗體(例如本發明提供的單克隆抗體5c10、5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2)獲得抗體的抗原結合片段(例如，上述抗體片段)，并且以與用于完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結合片段。在本文中，除非上下文明確指出，否則當提及術語“抗體”時，其不僅包括完整抗體，而且包括抗體的抗原結合片段。如本文中所使用的，術語“單抗”和“單克隆抗體”是指，來自一群高度同源的抗體分子中的一個抗體或抗體的一個片斷，也即除可能自發出現的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對抗原上的單一表位具有高特異性。多克隆抗體是相對于單克隆抗體而言的，其通常包含至少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識別抗原上的不同表位。單克隆抗體通常可采用kohler等首次報道的雜交瘤技術獲得(nature,256:495,1975)，但也可采用重組dna技術獲得(如參見u.s.p4,816,567)。如本文中所使用的，術語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一部分源自一個抗體(其可以源自某一特定物種或屬于某一特定抗體類或亞類)，且輕鏈或/和重鏈的另一部分源自另一個抗體(其可以源自相同或不同的物種或屬于相同或不同的抗體類或亞類)，但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。如本文中所使用的，術語“人源化抗體”是指，人源免疫球蛋白(受體抗體)的全部或部分cdr區被一非人源抗體(供體抗體)的cdr區替換后得到的抗體或抗體片段，其中的供體抗體可以是具有預期特異性、親和性或反應性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗體。此外，受體抗體的構架區(fr)的一些氨基酸殘基也可被相應的非人源抗體的氨基酸殘基替換，或被其他抗體的氨基酸殘基替換，以進一步完善或優化抗體的性能。關于人源化抗體的更多詳細內容，可參見例如，jonesetal.,nature,321:522525(1986)；reichmannetal.,nature,332:323329(1988)；presta,curr.op.struct.biol.,2:593596(1992)；和clark,immunol.today21:397402(2000)。人源化的方法根據目前常用的人源化方法中的一種或幾種的結合。例如采用下面所述的方法。人源化的方法可以采用cdr移植(cdrgrafting)的方法。本方法首先確定鼠源抗體的cdr區域，隨后將獲得的鼠源重鏈及輕鏈的6個cdr嫁接到與鼠源fr區具有較高相似度的人源模板上。人源模板的選擇可以是原始種系序列(germline)，如來源于imgt數據庫中的germline序列，也可以是成熟抗體的序列，如來源于genebank中的抗體序列。cdr移植完成的抗體可以采用回復突變的方法，即將個別人源模板氨基酸，回復突變回鼠源氨基酸以保證抗體親和力。人源化的方法可以采用sdr移植(sdrgrafting)的方法。本方法首先需要確定鼠源抗體的sdr區域。sdr區域的確定可以通過丙氨酸掃描(alaninescanning)的方法。隨后將獲得的鼠源sdr嫁接到與鼠源序列具有較高相似度的人源模板上。人源模板的選擇可以是原始種系序列(germline)，如來源于imgt數據庫中的germline序列，也可以是成熟抗體的序列，如來源于genebank中的抗體序列。cdr移植完成的抗體可以采用回復突變的方法，即將個別人源模板氨基酸，回復突變回鼠源氨基酸以保證抗體親和力。tamura,m.,d.e.milenic,m.iwahashi,e.padlan,j.schlom&s.v.kashmiri:structuralcorrelatesofananticarcinomaantibody:identificationofspecificitydeterminingresidues(sdrs)anddevelopmentofaminimallyimmunogenicantibodyvariantbyretentionofsdrsonly.j.immunol.,164,1432-41(2000)人源化的方法可以采用表面重排(resurfacing)的方法。本方法首先通過鼠源抗體計算機建模或者蛋白結晶的方法，獲得鼠源抗體模型，根據模型，確定可及表面的氨基酸，隨后將這些氨基酸突變為對應的人源氨基酸。人源氨基酸的選擇可以是相同位點上，人源抗體中占有較高比例的氨基酸。padlan,e.a.:apossibleprocedureforreducingtheimmunogenicityofantibodyvariabledomainswhilepreservingtheirligand-bindingproperties.mol.immunol.,28,489-98(1991)人源化的方法可以采用過人源化(superhumanization)的方法。本方法首先確定鼠源抗體的cdr區域，隨后選擇與鼠源6個cdr有較高相似度的人源序列作為模板，將6個鼠源cdr嫁接到選擇的模板上。人源模板的選擇可以是原始種系序列(germline)，如來源于imgt數據庫中的germline序列，也可以是成熟抗體的序列，如來源于genebank中的抗體序列。cdr移植完成的抗體可以采用回復突變的方法，即將個別人源模板氨基酸，回復突變回鼠源氨基酸以保證抗體親和力。tan,p.,d.a.mitchell,t.n.buss,m.a.holmes,c.anasetti&j.foote:"superhumanized"antibodies:reductionofimmunogenicpotentialbycomplementaritydeterminingregiongraftingwithhumangermlinesequences:applicationtoananti-cd28.j.immunol.,169,1119-25(2002)如本文中所使用的，術語“分離的”或“被分離的”指的是，從天然狀態下經人工手段獲得的。如果自然界中出現某一種“分離”的物質或成分，那么可能是其所處的天然環境發生了改變，或從天然環境下分離出該物質，或二者情況均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術語“分離的”或“被分離的”不排除混有人工或合成的物質，也不排除存在不影響物質活性的其它不純物質。如本文中所使用的，術語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限于：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動物病毒等。可用作載體的動物病毒包括但不限于，逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)。一種載體可以含有多種控制表達的元件，包括但不限于，啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有復制起始位點。如本文中所使用的，術語“宿主細胞”是指，可用于導入載體的細胞，其包括但不限于，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細胞，如酵母細胞或曲霉菌等的真菌細胞，如s2果蠅細胞或sf9等的昆蟲細胞，或者如纖維原細胞，cho細胞，cos細胞，nso細胞，hela細胞，bhk細胞，hek293細胞或人細胞等的動物細胞。如本文中使用的，術語“特異性結合”是指，兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。在某些實施方式中，特異性結合某抗原的抗體(或對某抗原具有特異性的抗體)是指，抗體以小于大約10-5m，例如小于大約10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的親和力(kd)結合該抗原。如本文中所使用的，術語“kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，其用于描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。通常，抗體(例如，本發明的單克隆抗體5c10、5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2)以小于大約10-5m，例如小于大約10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的解離平衡常數(kd)結合抗原(例如，pdl-1蛋白)，例如，如使用fortebio分子相互作用儀測定的。如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”和“單抗”具有相同的含義且可互換使用；術語“多克隆抗體”和“多抗”具有相同的含義且可互換使用；術語“多肽”和“蛋白質”具有相同的含義且可互換使用。并且在本發明中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。如本文中所使用的，術語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”可互換使用，并且當提及術語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”時，其還包括雜交瘤的亞克隆和后代細胞。例如，當提及雜交瘤細胞株lt005時，其還指雜交瘤細胞株lt005的亞克隆和后代細胞。如本文中所使用的，術語“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，ph調節劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如tween-80；離子強度增強劑包括但不限于氯化鈉。如本文中所使用的，術語“佐劑”是指非特異性免疫增強劑，當其與抗原一起或預先遞送入機體時，其可增強機體對抗原的免疫應答或改變免疫應答類型。佐劑有很多種，包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)、弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)、短小棒狀桿菌、脂多糖、細胞因子等。弗氏佐劑是目前動物試驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑則在臨床實驗中使用較多。如本文中所使用的，術語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預防疾病(例如腫瘤)有效量是指，足以預防，阻止，或延遲疾病(例如腫瘤)的發生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發癥的量。測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力范圍之內。例如，對于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。發明的有益效果本發明的單克隆抗體5c10能夠很好地特異性與pdl-1結合，并且能夠十分有效地阻斷pd-1與pdl-1的結合，特異地解除pdl-1對機體免疫抑制，激活t淋巴細胞。附圖說明圖1：pdl-1ecd-mfc融合蛋白的sds-page檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依次為：m：marker10μl；上樣層析柱樣品10μl；層析柱穿透10μl；層析柱洗脫10μl。圖2：pd-1-hfc融合蛋白的sds-page檢測結果。從左至右的2個泳道的樣品及其上樣量依次為：上樣層析柱樣品10μl；m：marker10μl。圖3：b7-1-hfc融合蛋白的sds-page檢測結果。從左至右的2個泳道的樣品及其上樣量依次為：上樣層析柱樣品10μl；m：marker10μl。圖4：5c10抗體的sds-page檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體1μg；純化的上樣流穿液；非還原型蛋白電泳上樣緩沖液1μg。圖5：5c10的人源化抗體5c10h1l1的sds-page檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；層析柱洗脫10μl；上樣層析柱穿透10μl；上樣層析柱樣品10μl。圖6：5c10的人源化抗體5c10h1l2的sds-page檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；層析柱洗脫10μl；上樣層析柱穿透10μl；上樣層析柱樣品10μl。圖7：5c10的人源化抗體5c10h2l1的sds-page檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；層析柱洗脫10μl；上樣層析柱穿透10μl；上樣層析柱樣品10μl。圖8：5c10的人源化抗體5c10h2l2的sds-page檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依次為：m:marker10μl；層析柱洗脫10μl；上樣層析柱穿透10μl；上樣層析柱樣品10μl。圖9：單抗5c10h2l2的動力學特征參數檢測結果。圖10：hplp的動力學特征參數檢測結果。圖11：pcab的動力學特征參數檢測結果。圖12：fortebio測定5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1結合。圖13：單抗5c10h1l1與293t細胞表面pdl-1的結合結果。圖14：單抗5c10h1l2與293t細胞表面pdl-1的結合結果。圖15：單抗5c10h2l1與293t細胞表面pdl-1的結合結果。圖16：單抗5c10h2l2與293t細胞表面pdl-1的結合結果。圖17：hplp與293t細胞表面pdl-1的結合結果。圖18：pcab與293t細胞表面pdl-1的結合結果。圖19：采用間接elisa方法分別測定5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1與人pdl-1的結合。圖20：采用間接elisa方法分別測定5c10h2l2、hplp與猴pdl-1的結合。圖21：5c10h2l2抗體與人pdl-1、人pd-l2以及鼠pdl-1的結合活性elisa檢測。圖22：5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1與pd-1競爭elisa結果。圖23：5c10h2l2與b7-1競爭elisa結果。圖24：5c10h2l2通過阻止pdl-1與pd-1的結合提高ifn-γ的分泌。圖25：5c10h2l2通過阻止pdl-1與pd-1的結合提高il-2的分泌。圖26a：5c10h2l2-igg1mt與fcγriiia的動態親和力biacore檢測。圖26b：與fcγriiia的動態親和力biacore檢測。圖27a：5c10h2l2-igg1mt與c1q的動態親和力biacore檢測。圖27b：與c1q的動態親和力biacore檢測。圖28：5c10h2l2-igg1mt對非小細胞肺癌細胞療效。關于生物材料保藏的說明：雜交瘤細胞株lt005，其于2015年8月4日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c2015133，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，郵編：430072。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市場購買獲得的常規產品。在本發明的下述實施例中，使用的balb/c小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心。使用的t細胞來自中山康方生物醫藥有限公司。制備例1：融合蛋白pdl-1ecd-mfc的制備1.基因pdl-1ecd-mfc的合成對基因pdl-1的胞外片段pdl-1ecd(programmedcelldeath1ligand1,ncbigenbankid:np_054862.1)，在科技文獻中pdl-1和pd-l1可以互換使用，本文統一使用pdl-1，所對應的氨基酸序列與小鼠igg的fc蛋白片段(mfc)進行融合設計。為提高目的基因在293f細胞表達系統中的表達效率，委托金斯瑞公司蛋白序列相對應的核酸序列進行優化，并委托金斯瑞公司合成相對應的融合蛋白基因。2.puc57simple-pdl-1ecd-mfc質粒的獲得：由金斯瑞公司將合成的pdl-1ecd-mfc融合基因克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)表達載體中，獲得puc57simple-pdl-1ecd-mfc質粒。3.pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc重組質粒的構建：將質粒puc57simple-pdl-1ecd-mfc進行酶切(xbai和bamhi)，電泳回收得到的融合基因片段pdl-1ecd-mfc與pcdna3.1表達載體(購自invitrogen公司)進行連接反應，獲得pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc，轉染感受態大腸桿菌細胞dh5a(購自tiangen公司)，轉染和培養按照說明書進行。篩選得到陽性的pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc克隆菌落，按照常規方法擴增大腸桿菌，然后采用試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，dp103-03)并按照試劑盒的說明書提取得到pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc重組質粒。4.按照lipofectamin轉染試劑盒(購自invitrogen公司)方法將重組質粒pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc轉染293f細胞(購自invitrogen公司)。5.將重組質粒pcdna3.1-pdl-1ecd-mfc轉染293f細胞7天后，將培養液通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及hitrapproteinahp柱進行純化pdl-1ecd-mfc融合蛋白，并取純化后樣品加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液，進行sds-page電泳檢測。如圖1所示，目標蛋白大約在53kd處。制備例2：融合蛋白pd-1-hfc的制備1.基因pd-1-hfc的合成對基因pd-1的胞外片段pd-1ecd(programmedcelldeathprotein1,ncbigenbankid:np_005009.2)所對應的氨基酸序列與人igg的fc蛋白片段(hfc)進行融合設計。為提高目的基因在293f細胞表達系統中的表達效率，委托金斯瑞公司蛋白序列相對應的核酸序列進行優化，并委托金斯瑞公司合成相對應的融合蛋白基因。2.puc57simple-pd-1ecd-tev-hfc質粒的獲得將金斯瑞公司將合成的和pd-1ecd-tev-hfc融合基因克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)表達載體中，獲得puc57simple-pd-1ecd-tev-hfc質粒。3.pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc重組質粒的構建將質粒puc57simple-pd-1ecd-tev-hfc進行酶切(xbai和bamhi)，電泳回收得到的融合基因片段pd-1ecd-tev-hfc與pcdna3.1表達載體(購自invitrogen公司)進行連接反應，獲得pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc，轉染感受態大腸桿菌細胞dh5a(購自tiangen公司)，轉染和培養按照說明書進行。篩選得到陽性的pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc克隆菌落，按照常規方法擴增大腸桿菌，然后采用試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，dp103-03)并按照試劑盒的說明書提取得到pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc重組質粒。4.按照lipofectamin轉染試劑盒(購自invitrogen公司)方法分別將重組質粒pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc轉染293f細胞(購自invitrogen公司)。5.分別將重組質粒pcdna3.1-pd-1ecd-tev-hfc轉染293f細胞7天后，將培養液通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及mabselectsure柱進行純化pd-1ecd-tev-hfc融合蛋白，并取純化后樣品加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液，進行sds-page電泳檢測，還原型蛋白樣品電泳圖如圖2所示。制備例3：b7-1-hfc的制備1.基因b7-1-hfc的合成對基因b7-1(clusterofdifferentiation80(alsocd80andb7-1),ncbigenbankid:np_005182.1)的胞外片段b7-1ecd所對應的氨基酸與人igg的fc蛋白片段(hfc)進行融合設計。為提高目的基因在293f細胞表達系統中的表達效率，委托金斯瑞公司蛋白序列相對應的核酸序列進行優化，并委托金斯瑞公司合成相對應的融合蛋白基因。2.puc57simple-b7-1ecd-hfc質粒的獲得將金斯瑞公司將合成的和b7-1ecd-hfc融合基因克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)表達載體中，獲得puc57simple-b7-1ecd-hfc質粒。3.pcdna3.1-b7-1ecd-hfc重組質粒的構建將質粒puc57simple-b7-1ecd-hfc進行酶切(xbai和bamhi)，電泳回收得到的融合基因片段b7-1ecd-hfc與pcdna3.1表達載體(購自invitrogen公司)進行連接反應，獲得pcdna3.1-b7-1ecd-hfc，轉染感受態大腸桿菌細胞dh5a(購自tiangen公司)，轉染和培養按照說明書進行。篩選得到陽性的pcdna3.1-b7-1ecd-hfc克隆菌落，按照常規方法擴增大腸桿菌，然后采用試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，dp103-03)并按照試劑盒的說明書提取得到pcdna3.1-b7-1ecd-hfc重組質粒。4.按照lipofectamin轉染試劑盒(購自invitrogen公司)方法分別將重組質粒pcdna3.1-b7-1ecd-hfc轉染293f細胞(購自invitrogen公司)。5.分別將重組質粒pcdna3.1-b7-1ecd-hfc轉染293f細胞7天后，將培養液通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及mabselectsure柱進行純化b7-1ecd-hfc融合蛋白，并取純化后樣品加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液，進行sds-page電泳檢測，還原型蛋白樣品電泳圖如圖3所示。實施例1：雜交瘤細胞株lt005的獲得以及單克隆抗體5c10、5f10、9f6的制備利用哺乳動物細胞表達系統表達出重組的pdl-1ecd-mfc融合蛋白作為抗原免疫小鼠，經小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合獲得雜交瘤細胞。通過大量的樣本篩選，得到了一種雜交瘤細胞株lt005，該細胞株能夠分泌產生與pdl-1特異性結合的單克隆抗體5c10。本發明還制得了另外兩種單克隆抗體5f10和9f6。具體方法如下：1.雜交瘤細胞株的建立用前面制備例1制得pdl-1ecd-mfc融合蛋白作為抗原，取免疫balb/c小鼠(購自廣東醫學實驗動物中心)的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，參照目前已確立的方法(e.g.,stewart,s.j.,“monoclonalantibodyproduction”,inbasicmethodsinantibodyproductionandcharacterization,eds.g.c.howardandd.r.bethell,bocaraton:crcpress,2000)。用pdl-1ecd-mfc作為抗原包被酶標板，進行間接elisa法篩選，得到分泌與pdl-1ecd-mfc特異性結合的新的抗體的雜交瘤細胞。對間接elisa篩選得到的雜交瘤細胞，通過競爭elisa篩選出能夠分泌與配體pd-1(pd-1-hfc，制備例2值得)競爭結合pdl-1的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并經過有限稀釋法得到穩定的雜交瘤細胞株。將該雜交瘤細胞株命名lt005，其分泌的單克隆抗體命名為5c10。雜交瘤細胞株lt005，其于2015年8月4日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c2015133，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，郵編：430072。類似地，本發明人還構建了另外2株雜交瘤細胞株，其分泌的抗體為鼠源抗體，抗體分別命名為5f10和9f6。2.抗體5c10、5f10和9f6的制備用含10％的低igg胎牛血清對本發明pdl-1-5c10細胞株進行培養，7天后收集細胞培養上清進行純化制備抗體5c10。抗體5f10、9f6按照上述方法制備。3.抗體5c10的sds-page電泳檢測：將純化后的樣品分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，純化的上樣流穿液，煮沸后進行檢測。檢測結果顯示，還原型蛋白樣品目標蛋白大約在50kd和25kd處，非還原型蛋白樣品目標蛋白大約在150kd處(圖4)。4.鼠源抗體5c10、5f10和9f6的親和力、競爭親和力以及細胞親和力的檢測：elisa親和力測試方法請參見實施例9，elisa競爭親和力測試方法請參見實施例13facs細胞親和力測試方法請參見實施例8。結果如下面的表1所示。表1:鼠源抗體5c10、5f10、9f6親和力，競爭親和力以及細胞親和力以檢測結果表明，三個抗體鼠源抗體在親和力和競爭親和力方面不遜于對照抗體pcab(制備見實施例5)，其中，5c10在細胞親和力及陽性率表現最好，5f10細胞親和力優于pcab，9f6陽性率優于對照抗體pcab。實施例2：單克隆抗體5c10、5f10和9f6的輕鏈和重鏈序列的獲得按照培養細胞細菌總rna提取試劑盒(tiangen，貨號dp430)的方法，從實施例1獲得的雜交瘤細胞株lt005中提取mrna。按照transgenbiotechtransscriptfirst-strandcdnasynthesissupermix試劑盒說明書合成cdna，并進行pcr擴增。pcr擴增產物直接進行ta克隆，具體操作參照peasy-t1cloningkit(transgenct101)試劑盒說明書進行。將ta克隆的產物直接進行測序，測序結果如下：編碼單抗5c10重鏈可變區的核苷酸：(360bp)caggtgcaactgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagaacctgtccattacctgcactgtctctgggttctcattaagcaactatgatataagctggattcgccagccaccaggaaagggtctggagtggctcggagtaatatggactggtggagccacaaattataattcagctttcatgtccagactgagcatcagtagggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatattactgtgtgagagattcgaactataggtacgacgagccgtttacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(seqidno:1)單抗5c10重鏈可變區的氨基酸序列：(120aa)qvqlkesgpglvapsqnlsitctvsgfslsnydiswirqppgkglewlgviwtggatnynsafmsrlsisrdnsksqvflkmnslqtddtaiyycvrdsnyrydepftywgqgtlvtvsa(seqidno:2)編碼單抗5c10輕鏈可變區的核苷酸序列：(318bp)gacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtctctcctgcagggccagtcagagcattggcacaaacatacactggtttcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctcataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatcagggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattactactgtcaacaaagtaatagctggccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaata(seqidno:3)單抗5c10輕鏈可變區的氨基酸序列：(106aa)dilltqspailsvspgervslscrasqsigtnihwfqqrtngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqsnswpytfgggtklei(seqidno:4)類似地，可獲得單克隆抗體9f6和5f10的輕鏈和重鏈序列。單抗5f10重鏈可變區的氨基酸序列：(117aa)evqlqqsgaelvkpgasvklsctasgfdikdtyihwvkqrpeqglewigridpadgntrydpkfqdkttittdtssntahlqlssltsedtavyycarglgawfaswgqgtlvtvsa(seqidno:21)編碼單抗5f10重鏈可變區的核苷酸序列：(351bp)gaggttcagctgcagcagtctggggcagagcttgtgaagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcgacattaaagacacctatatccactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggagtggattggaaggattgatcctgcggacggtaatactaggtatgacccgaagttccaggacaagaccactataacaaccgacacatcctccaacacagcccacctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtgctagaggcctcggagcttggtttgcttcctggggccaagggactctggtcactgtctctgca(seqidno:22)單抗5f10輕鏈可變區的氨基酸序列：(106aa)diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqditnslnwyqqkpdgtvkllihytsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqghtlpptfgggtklei(seqidno:23)編碼單抗5f10輕鏈可變區的核苷酸序列：(318bp)gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattaccaattccttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatccactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtcatacgcttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatc(seqidno:24)單抗9f6重鏈可變區的氨基酸序列：(124aa)evqlqqsgaelvkpgasvklsctasgfnikdtymywvkqrpeqglewigridpangntkydpkfqgkatitadtsantaylqlssltsedtavyycsrgppggigeyiyamdywgqgtsvtvss(seqidno:25)編碼單抗9f6重鏈可變區的核苷酸序列：(372bp)gaggttcagctgcagcagtctggggcagagcttgtgaagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgtactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggagtggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatactaaatatgacccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatccgccaacacagcctacctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgttctagaggccctccaggaggtatcggcgagtatatctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(seqidno:26)單抗9f6輕鏈可變區的氨基酸序列：(107aa)qivltqspaimsaslgervtmtctasssvsssylhwyqqkpgsspklwiystsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyychqyhrspptfgggtklei(seqidno:27)編碼單抗9f6輕鏈可變區的核苷酸序列：(321bp)caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaacgggtcaccatgacctgcactgccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtcccagctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccaccagtatcatcgttccccacccacgttcggtggaggcaccaagctggaaatc(seqidno:28)實施例3：人源化抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1、5c10h2l2的輕鏈和重鏈序列的設計根據pdl-1蛋白的三維晶體結構(pdbcode3bik，lin,dyet.al.,pnasusa105(8):3011-6(2008)以及實施例2獲得的抗體5c10的序列，通過計算機模擬抗體模型，根據模型設計突變，得到抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1、5c10h2l2的可變區序列(重鏈恒定區為iggamma-1chaincregion，accession:p01857，輕鏈恒定區為igkappachaincregion，accession:p01834)，可變區序列如下：1.5c10人源化單克隆抗體5c10h1l1的輕鏈和重鏈序列編碼5c10h1l1重鏈可變區的核苷酸序列：(360bp)caggtccagctgcaggagtcaggccccggcctggtgaagcccagtgagaacctgtcaatcacctgcacagtctctggcttctcactgagcaattacgacatcagttggattcgacagccccctggaaagggcctggaatggctgggcgtgatctggacaggcggggcaactaactataatccagcctttaaaagccggctgaccatttccagagacaactccaagtctcaggtgtctctgaaaatgagctccctgcaggccgctgataccgctgtgtactattgtgtcagggacagcaattaccgctatgatgagcccttcacatactgggggcagggaactctggtgaccgtctctagt(seqidno:5)5c10h1l1重鏈可變區的氨基酸序列：(120aa)qvqlqesgpglvkpsenlsitctvsgfslsnydiswirqppgkglewlgviwtggatnynpafksrltisrdnsksqvslkmsslqaadtavyycvrdsnyrydepftywgqgtlvtvss(seqidno:6)編碼5c10h1l1輕鏈可變區的核苷酸序列：(321bp)gaaatcgtgctgacacagagccctgacacactgagcgtgactcccaaggagaaagtcaccctgacatgccgggcatcacagagcatcggaacaaacattcactggttccagcagagaccaggccagagccccaagctgctgatcaaatacgcctccgaatctatcagtggcattccttcccgattctcaggcagcgggtccggaaccgactttactctgaccattaactctgtggaggctgaagatgccgctacatactattgccagcagtctaatagttggccttataccttcggccaggggacaaagctggagatcaaa(seqidno:7)5c10h1l1輕鏈可變區的氨基酸序列：(107aa)eivltqspdtlsvtpkekvtltcrasqsigtnihwfqqrpgqspkllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftltinsveaedaatyycqqsnswpytfgqgtkleik(seqidno:8)2.5c10人源化單克隆抗體5c10h2l2的輕鏈和重鏈序列編碼5c10h2l2重鏈可變區的核苷酸序列：(360bp)caggtccagctgcaggagtccggccccggcctggtgaagccctccgagacactgtctatcacctgcacagtcagcggcttctcactgagcaactacgacatctcctggattcgacagccccctggaaagggcctggaatggctgggcgtgatctggacaggcggggcaactaactataatccagccctgaaatctcggctgactattagtagagacaactcaaagaatcaggtgtccctgaaaatgagctccgtcaccgccgctgatacagctgtgtactattgtgtcagggacagcaattaccgctatgatgagccctttacctactgggggcagggaactctggtgaccgtctctagt(seqidno:9)5c10h2l2重鏈可變區的氨基酸序列：(120aa)qvqlqesgpglvkpsetlsitctvsgfslsnydiswirqppgkglewlgviwtggatnynpalksrltisrdnsknqvslkmssvtaadtavyycvrdsnyrydepftywgqgtlvtvss(seqidno:10)編碼5c10h2l2輕鏈可變區的核苷酸序列：(321bp)gaaatcgtgctgacacagtctcctgataccctgagcgtgactcccaaggagaaagtcaccctgacatgcagggcatcacagagcatcggaacaaacattcactggttccagcagaagccaggccagagccccaagctgctgatcaaatacgcctccgaatctattagtggagtgccttcccgcttctcaggcagcgggtccggaaccgactttactctgaccatcaactctgtggaggctgaagatgccgctacatactattgccagcagtctaatagttggccttataccttcggccaggggacaaagctggagatcaaa(seqidno:11)5c10h2l2輕鏈可變區的氨基酸序列：(107aa)eivltqspdtlsvtpkekvtltcrasqsigtnihwfqqkpgqspkllikyasesisgvpsrfsgsgsgtdftltinsveaedaatyycqqsnswpytfgqgtkleik(seqidno:12)3.5c10人源化單克隆抗體5c10h1l2的輕鏈和重鏈序列編碼5c10h1l2重鏈可變區的核苷酸序列：seqidno:5，5c10h1l2重鏈可變區的氨基酸序列：seqidno:6。編碼5c10h1l2輕鏈可變區的核苷酸序列：seqidno:11，5c10h1l2輕鏈可變區的氨基酸序列：seqidno:12。4.5c10人源化單克隆抗體5c10h2l1的輕鏈和重鏈序列編碼5c10h2l1重鏈可變區的核苷酸序列：seqidno:9，5c10h2l1重鏈可變區的氨基酸序列：seqidno:10。編碼5c10h2l1輕鏈可變區的核苷酸序列：seqidno:7，5c10h2l1輕鏈可變區的氨基酸序列：seqidno:8。實施例4：5c10人源化抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2的制備和sds-page電泳檢測將5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1和5c10h2l2的重鏈cdna(重鏈可變區序列分別如seqidno:5、seqidno:9所示；重鏈恒定區序列為higg1序列)和輕鏈的cdna(輕鏈可變區序列分別如seqidno:7、seqidno:11所示；輕鏈恒定區為humankappa序列)分別克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)載體中，獲得puc57simple-5c10h1、puc57simple5c10l1、puc57simple-5c10h2和puc57simple-5c10l2克隆質粒。然后參照制備例1中的方法，亞克隆到pcdna3.1載體中。提取重組質粒共轉染293f細胞。細胞培養7天后，將培養液通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及hitrapproteinahp柱進行純化。將純化后的樣品分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸后進行sds-page電泳檢測，結果分別如圖5、圖6、圖7和圖8所示，還原型蛋白樣品目標蛋白大約在50kd和25kd處，非還原型蛋白樣品目標蛋白大約在150kd處。實施例5：人源化抗體5c10h2l2的動力學參數測定使用fortebio分子相互作用儀測定人源化抗體5c10h2l2與抗原pdl-1(ncbigenbankid:np_054862.1，編碼核酸序列為seqidno:13，所編碼的氨基酸序列為seqidno:14)結合的動力學參數。1.前期的實驗樣品準備(1)參照制備例1中的pdl-1ecd-mfc的制備方法制備pdl-1-mfc蛋白，并用tev蛋白酶酶切pdl-1-mfc蛋白，過柱純化獲得pdl-1抗原。pdl-1的基因序列:(870bp)atgaggattttcgccgtctttatctttatgacctactggcatctgctgaacgcttttactgtgaccgtccccaaggatctgtatgtggtggagtacggaagcaacatgactatcgagtgcaagttccccgtggaaaaacagctggacctggccgctctgattgtctattgggagatggaagataagaatatcattcagtttgtgcacggcgaggaagacctgaaagtccagcatagctcctacaggcagcgcgcccgactgctgaaggatcagctgtccctggggaacgcagccctgcagatcaccgacgtgaaactgcaggatgctggagtctacaggtgcatgatctcttacggcggggctgattataagcgcattacagtgaaagtcaatgcaccttataacaagatcaatcagagaattctggtggtcgacccagtgaccagtgagcacgaactgacatgtcaggctgagggctaccccaaggcagaagtgatctggacctctagtgatcatcaggtcctgtcagggaaaaccacaactaccaacagcaagcgagaggaaaaactgttcaatgtgacatccactctgaggatcaacacaactaccaatgagattttctattgcacttttcggagactggaccctgaggaaaaccacaccgcagagctggtcatcccagaactgccactggcacacccacctaatgagcgaacacacctggtcatcctgggagccattctgctgtgcctgggcgtcgctctgactttcatttttcggctgagaaaggggcggatgatggacgtgaaaaagtgtggcattcaggatactaactcaaaaaagcagtccgatacccatctggaagaaacc(seqidno:13)pdl-1蛋白的氨基酸序列:(290aa)mrifavfifmtywhllnaftvtvpkdlyvveygsnmtieckfpvekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrarllkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritvkvnapynkinqrilvvdpvtseheltcqaegypkaeviwtssdhqvlsgkttttnskreeklfnvtstlrintttneifyctfrrldpeenhtaelvipelplahppnerthlvilgaillclgvaltfifrlrkgrmmdvkkcgiqdtnskkqsdthleet(seqidno:14)(2)陽性對照抗體hplp和pcab的獲得本發明選擇hplp或pcab作為陽性對照，其中，hplp是已上市的atezolizumab(商品名)，pcab是進入臨床的pdl-1抗體。atezolizumab(商品名)購自roche公司。hplp(亦稱為kf025hplp)的制備可參照美國專利申請us2010/0203056a1例如其實施例10，該抗體的vh序列請參見該專利中的序列20，vl序列請參見該專利中的序列21。pcab的制備可參照美國專利us7,943,743b2例如其實施例1，該抗體的vh序列請參見該專利中的序列1，vl序列請參見該專利中的序列11。2.實驗方法為檢測5c10h2l2、hplp和pcab與抗原pdl-1的親和力，將5μg/ml的抗原pdl-1采用氨基偶聯的方式固定于ar2g傳感器表面，經乙醇胺封閉，于pbst中平衡后，將傳感器固定的抗原與抗體結合。抗體濃度從200nm三倍稀釋，緩沖液為10mmpbst。采用fortebiodataanalysis7.0軟件，分析5c10h2l2、hplp和pcab與抗原pdl-1的親和力。3.實驗結果抗體5c10h2l2、hplp和pcab與pdl-1結合的動力學參數見表2，動力學特征參數檢測結果分別如圖9-11所示。表2：抗體5c10h2l2、hplp、pcab動力學參數抗體名稱kd(m)kon(1/ms)kon誤差kdis(1/s)kdis誤差5c10h2l28.08e-115.58e+062.06e+054.51e-041.66e-05hplp3.68e-114.07e+061.02e+051.50e-049.99e-06pcab1.28e-106.55e+063.88e+058.37e-042.25e-05kd為親和力常數；kon為抗原抗體結合速率；kdis為抗原抗體解離速率；kd＝kdis/kon。結果表明，3種抗體均與抗原有較好的親和力，5c10h2l2和hplp與抗原的親和力強于pcab。實施例6：fortebio測定5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1結合為檢測5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1的結合，將5μg/ml的抗原pdl-1采用氨基偶聯的方式固定于ar2g傳感器表面，經乙醇胺封閉，于pbst中平衡。然后將傳感器固定的抗原與抗體結合，抗體濃度從33.33nm三倍稀釋，緩沖液為10mmpbst。然后把傳感器于10μg/ml配體pd-1中浸泡420s。5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1結合結果如圖12所示。由圖可見，各抗體均能夠有效地抑制人pdl-1與pd-1的結合，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度及曲線模擬的結合效率ec50見表3。表3：抗體5c10、5c10h2l2和hplp抑制人pdl-1與pd-1結合抗體(nm)5c105c10h2l2hplp33.330.0058-0.01090.012711.110.0038-0.00780.01493.7040.0088-0.00070.00731.2350.02890.01030.02680.41150.05990.04250.06970.13720.07390.07320.08670.045720.07730.06010.0947ec50(nm)0.8170.6540.625結果表明，3種抗體均能夠有效地抑制人pdl-1與pd-1的結合，并且其結合效率呈劑量依賴關系。實施例7：5c10h2l2與hplp阻斷pd1/pdl-1結合采用htrf的方法比較5c10h2l2與hplp阻斷pd1/pdl-1結合。使用pd1/pdl-1bindingassay(cisbio，貨號:63adk000cplpeh)試劑盒。用稀釋緩沖液稀釋5c10h2l2與hplp，100μg/ml起始，3倍稀釋，10個濃度點。加入2μl樣品、4μlpdl-1-euk和4μltag-pd1，離心，室溫孵育20分鐘。加入10μlanti-tag-xl665，瞬時離心，室溫孵育2小時。使用pherastarfs(bmg)進行讀數，將數據導入graphprism進行計算。結果表明，hplp和5c10h2l2對pd1/pdl-1結合阻斷的能力一致，分別為67.29ng/ml和68.97ng/ml，2種抗體均能夠有效地抑制人pdl-1與pd-1的結合。實施例8：流式細胞儀方法檢測人源化抗體與細胞表面抗原pdl-1的結合活性首先構建表達pdl-1抗原的宿主細胞293t；然后用本發明中制備的人源化抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1及陽性對照抗體(hplp和pcab)對宿主細胞進行標記。然后采用流式細胞術分析驗證抗體5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1及陽性對照抗體(hplp和pcab)對細胞表面具有天然構象的抗原的特異性結合。具體步驟如下：1.表達pdl-1抗原的宿主細胞293t的構建按照lipofectamin轉染試劑盒(購自invitrogen公司)方法將包含pdl-1的載體plenti6.3-pdl-1(載體plenti6.3購自invitrogen公司)轉染293f細胞，經篩選獲得穩定表達pdl-1的克隆群體。2.抗體標記和流式細胞儀檢測采用常規胰酶消化方法上述步驟獲得的表達pdl-1抗原的宿主細胞293t，并使每個收集管細胞數為2×105。用pbs(1％bsa)配制濃度分別為50nm，20nm，10nm，3nm，1nm，0.1nm，0.01nm，0nm的各抗體稀釋液，冰上與表達pdl-1的293t細胞孵育2小時，pbs清洗3次。用pbs按1:100稀釋fitc-goat-anti-humanigg,每管加入100μl,冰上孵育1小時，pbs清洗3次。并加入300μlpbs重懸后，在流式細胞儀上用fitc通道檢測熒光信號。3.實驗結果檢測5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l1、5c10h2l2及陽性對照抗體(hplp和pcab)與293t細胞表面pdl-1的結合結果分別如圖13-18所示。由圖可見，被檢測抗體均能有效地結合宿主細胞293t表面的靶標pdl-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系。通過對結合的被檢測抗體進行熒光定量分析，曲線模擬各抗體的結合效率ec50，如下的表4所示。表4：流式細胞儀檢測5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab結合宿主細胞293t表面抗原pdl-1的熒光強度分析結果表明，被檢測抗體均能有效地結合宿主細胞293t表面的靶標pdl-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系。實施例9：間接elisa方法檢測人源化抗體與人pdl-1的結合活性采用間接elisa方法分別測定5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1及陽性對照抗體(hplp和pcab)與人pdl-1的結合活性。酶標板中加入抗原孵育，4℃度過夜，用1％的bsa37℃度封閉2h后，分別加入抗體，37℃度孵育30min，加入hrp標記羊抗人igg(h+l)二抗(jackson，109-035-088)，用tmb(neogen，308177)進行顯色反應5min，并在酶標儀中檢測450nm波長吸光度。檢測上述抗體與人pdl-1結合結果分別如圖19所示。由圖可見，5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab能有效地結合人pdl-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度及曲線模擬的結合效率ec50見表5。表5：5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab與人pdl-1的結合(間接elisa)結果表明，本發明的抗體能有效地結合人pdl-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系。實施例10：間接elisa方法檢測5c10h2l2抗體與猴pdl-1的結合活性考慮到藥代動力學實驗和毒理學實驗需要用到實驗動物，本實驗目的在于判定是不是和猴子的靶抗原可以結合，如果可以結合就可以采用猴子做藥代動力學和毒理實驗。采用間接elisa方法分別測定5c10h2l2和陽性對照抗體hplp與猴pdl-1的結合活性。酶標板中加入抗原孵育，4℃度過夜，用1％的bsa37℃度封閉2h后，分別加入抗體，37℃度孵育30min，加入hrp標記羊抗人igg(h+l)二抗(jackson，109-035-088)，用tmb(neogen，308177)進行顯色反應5min，并在酶標儀中檢測450nm波長吸光度。檢測5c10h2l2和hplp與猴pdl-1結合結果分別如圖20所示。由圖可見，5c10h2l2和hplp能有效地結合猴pdl-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度及曲線模擬的結合效率ec50見表6。表6：5c10h2l2和hplp與猴pdl-1的結合(間接elisa)結果表明，5c10h2l2和hplp能有效地結合猴pdl-1蛋白，且5c10h2l2與猴pdl-1蛋白的結合能力強于hplp,并且其結合效率呈劑量依賴關系。實施例11：間接elisa方法檢測5c10h2l2抗體與人pdl-1、人pd-l2以及鼠pdl-1的結合活性采用間接elisa方法測定5c10h2l2抗體與人pdl-1、人pd-l2(購自義翹神州，貨號10292-h08h)以及鼠pdl-1(購自義翹神州，貨號50010-m08h)的結合活性。人pdl-1、人pd-l2以及鼠pdl-1，酶標板中加入0.5μg/ml抗原100μl孵育，4℃度過夜。抗體稀釋至起始濃度為1μg/ml，按3倍比例梯度稀釋，共稀釋11個濃度。用1％的bsa37℃度封閉2h后，分別加入抗體，37℃度孵育30min。按1:20000稀釋，加入hrp標記羊抗人igg(h+l)二抗(購自jackson，貨號109-035-088)，用tmb(購自neogen，貨號308177)進行顯色反應5min，并在酶標儀中檢測450nm波長吸光度。5c10h2l2抗體與人pdl-1、人pd-l2以及鼠pdl-1結合結果如圖21所示。由圖可見，5c10h2l2能有效地結合人pdl-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的吸光強度及曲線模擬的結合效率ec50＝9.16ng/ml；而5c10h2l2與人pd-l2和鼠pdl-1不存在結合。結果表明，5c10h2l2抗體與人pdl-1特異性結合，而atezolizumab與鼠pdl-1結合(參見在fda的公開審評資料pharmacologyreview，applicationnumber761034orig1s000),本發明具有優良的特異性。實施例12：競爭elisa方法檢測人源化抗體與pdl-1、pd-1的競爭結合活性采用競爭elisa方法分別測定5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1及陽性對照抗體(hplp和pcab)與pd-1競爭結合抗原pdl-1的能力。酶標板中加入受體孵育，4℃度過夜，用1％的bsa37℃度封閉2h，抗體與抗原在室溫混合孵育15分鐘后，混合液轉移到酶標板中，37℃度孵育30min，加入hrp標記羊抗鼠igg(h+l)二抗(jackson，109-035-062)，用tmb(neogen，308177)進行顯色反應5min，并在酶標儀中檢測450nm波長吸光度。檢測上述抗體與pd-1競爭結合抗原pdl-1的結果如圖22所示。由圖可見，5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab均能有效地與pd-1競爭結合抗原pdl-1，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度及曲線模擬的結合效率ec50見表7。表7：5c10h1l1、5c10h1l2、5c10h2l2、5c10h2l1、hplp、pcab與pd-1競爭結合pdl-1elisa結果表明，被檢測抗體均能有效地與pd-1競爭結合抗原pdl-1，并且其結合效率呈劑量依賴關系。實施例13：競爭elisa方法檢測5c10h2l2抗體與pdl-1、b7-1的競爭結合采用競爭elisa方法分別測定5c10h2l2及陽性對照抗體(hplp和pcab)與b7-1(b7-1-hfc，制備例3制得)競爭結合抗原pdl-1的能力。酶標板中加入受體孵育，4℃度過夜，用1％的bsa37℃度封閉2h，抗體與抗原在室溫混合孵育15分鐘后，混合液轉移到酶標板中，37℃度孵育30min，加入hrp標記羊抗鼠igg(h+l)二抗(jackson，109-035-062)，用tmb(neogen，308177)進行顯色反應5min，并在酶標儀中檢測450nm波長吸光度。檢測上述抗體與b7-1競爭結合抗原pdl-1的結果如圖23所示。由圖可見，5c10h2l2、hplp、pcab均能有效地與b7-1競爭結合抗原pdl-1，各劑量的熒光強度及曲線模擬的結合效率ec50見表8。表8：5c10h2l2、hplp、pcab與b7-1競爭結合pdl-1elisa*抑制不徹底，應該理解為競爭實驗中的數據窗口與另外兩個抗體相比較小；另如表7所示，hplp在1:27開始再增加濃度時，如1:9，1:3，3μg/ml時，od讀數隨濃度增加降低不明顯，不能達到5c10h2l2和pcab3ug/ml時的數值。結果表明，被檢測抗體均能與b7-1競爭結合抗原pdl-1，其中5c10h2l2的競爭結合活性較強，ec50是pcab的1/2倍；hplp隨著濃度增高，但是抑制程度并未呈現明顯增加趨勢。實施例14：5c10h2l2及陽性對照抗體(hplp和pcab)的細胞生物學活性分析為檢測單克隆抗體5c10h2l2及陽性對照抗體(hplp和pcab)對外周血單核細胞(peripheralbloodmononuclearcell:pbmc)il-2和ifn-γ分泌的影響，采用ficoll-paqueplus(gehealthcarelotno.:171440-02)分離pbmc，將分離出來的pbmc加入il-4(peprotechk2513，1000u/ml)和gm-csf(peprotechh1513，1000u/ml)誘導6天后，加入tnf-α(peprotechg1513，200u/ml)誘導3天獲得dc細胞。pbmc中分離得到t細胞，將獲得的dc細胞與t細胞按1:10的比例混合培養，同時加入不同比例的抗體5c10h2l2(higg做為對照)培養5-6天后，采用elisa試劑盒檢測ifn-γ(購自達科為公司)和il-2(購自達科為公司)的分泌量。dc細胞和t細胞混合培養后ifn-γ和il-2的分泌檢測結果分別如圖24、圖25所示：5c10h2l2、hplp和pcab均能有效地誘導混合淋巴細胞分泌ifn-γ和il-2，并且其分泌量與抗體呈劑量依賴關系。實施例15：經修飾人類igg1恒定區的單抗5c10h2l2-igg1mt的設計和制備本發明對重鏈恒定區為iggamma-1chaincregion，accession:p01857，輕鏈恒定區為igkappachaincregion，accession:p01834的eu編號系統234,235，237進行突變如下：l234a，l235a，g237a，命名為5c10h2l2-igg1mt。參照實施例4的方法制備5c10h2l2-igg1mt。實施例16：fortebio測定5c10h2l2-igg1mt與fcγriiia、c1q的動態親和力1.通過fortebio(購自pall貨號octet,qke)分析表征了5c10h2l2-igg1mt、與fcγriiia的親和力和結合動力學。具體步驟如下：使用fortebio提供的標準方法和試劑盒，通過生物素與鏈霉素的結合將純化的fcγriiia-biotin連接到sa芯片(鏈霉素包被的芯片)上，固定條件：1μg/mlfcγriiia-biotin,300s。抗體濃度為4000nm結合120s，的，在pbst(ph7.4)緩沖液解離180s。用octet軟件將結合和解離曲線模型擬合。實驗結果如圖26a和26b所示。結果表明：5c10h2l2-igg1mt、均不與fcγriiia結合，間接表明其都不具備adcc活性。2.通過fortebio(購自pall貨號octet,qke)分析表征了5c10h2l2-igg1mt、與c1q(購自fitzgerald，貨號32r-ac049)的親和力和結合動力學。具體步驟如下：使用fortebio提供的標準方法和試劑盒，通過生物素與鏈霉素的結合將純化抗體連接到sa芯片(鏈霉素包被的芯片)上，固定條件：20ug/mlantibody-biotin,300s。c1q濃度為200nm,2倍濃度梯度，結合120s。在pbst(ph7.4)緩沖液解離180s。用octet軟件將結合和解離曲線模型擬合。為了使結合常數估計中的親合力的影響降至最小，只用對應于結合和解離階段的最初的數據段進行擬合。測定的kd、kon和koff值顯示在表9中，具體圖譜如圖27a和圖27b。表9：5c10h2l2-igg1mt、與c1q動態親和力結果表明，5c10h2l2-igg1mt比與c1q動態親和力更低。實施例17：測定5c10h2l2-igg1mt的cdc細胞活性首先培養腫瘤細胞hcc1954(購自atcc貨號crl-2338)是pdl-1陽性的細胞。用對應培養基(rpmi1640+10％牛血清)進行培養。hcc1954檢測培養基(rpmi1640+10％人血清)稀釋5c10h2l2-igg1mt藥物10000μg/ml起始，5倍稀釋，10個濃度梯度。采用常規胰酶消化方法上述的腫瘤細胞，收集管細胞數，用對應檢測培養基(含rpmi1640+10％人血清)重懸，加入10000細胞/孔至對應的稀釋好抗體96孔板中，共培養5小時。然后每孔加入cck8試劑20μl(購自東仁化學科技有限公司，貨號ck04,lot:jj744)，反應至3小時，酶標儀450nm讀數(廠家：moleculardevices,型號：spectramaxm2)，通過檢測線粒體內的脫氫酶的活性，反映出抗體對hcc1954細胞的殺傷作用。結果顯示，5c10h2l2-igg1mt未對hcc1954細胞產生cdc殺傷作用。實施例18：對結腸癌的體內療效1.受試藥物5c10h2l2-igg1mt，人igg均由四川科倫藥物研究院有限公司提供；其中購自roche公司，人igg購自成都蓉生藥業有限責任公司。配制方法：三藥均用含0.1％bsa生理鹽水稀釋成所需濃度。1.試驗細胞和動物mc-38/h-11細胞是小鼠結腸癌mc-38(購自cobioer,貨號cbp60825)細胞通過crispr/cas9技術敲除小鼠內源性pdl-1，轉染并表達人pdl-1的單克隆細胞,因此，mc-38/h-11細胞只高表達人pdl-1蛋白。c57bl/6小鼠，7-8周，♀，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。2.實驗步驟每只小鼠皮下接種1×105mc-38/h-11細胞，接種后第二天(d0)隨機分組并腹腔注射(ip)藥物，隔1天1次(q2d)；溶劑組注射相同體積的人igg(15mg/kg)，5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)、(15mg/kg)，注射體積0.1ml/10g體重。各組均為10只小鼠。3.實驗指標實驗指標為考察藥物對腫瘤生長的影響，具體指標為t/c％或抑瘤率tgi(％)。每周二次用游標卡尺測量腫瘤直徑,腫瘤體積(v)計算公式為：v＝1/2×a×b2其中a、b分別表示長、寬。t/c％＝t/c×100,c、t分別為溶劑組和治療組的腫瘤體積或腫瘤重量。抑瘤率(tgi)(％)＝(c-t)/c×100,c、t分別為溶劑組和治療組的腫瘤體積或腫瘤重量。4.實驗結果如下面的表10所示。表10：5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)、對小鼠結腸癌mc-38/h-11小鼠皮下移植瘤的療效注：隨機分組，第一次給藥時間為d0；d27為給藥后第27天。5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)對mc-38/h-11小鼠皮下移植瘤的抑瘤率分別為63.9％、75.8％和68.6％(根據平均腫瘤體積計算)；鑒于每組腫瘤的個體差異較大，采用中位腫瘤體積計算抑瘤率比較合理，則抑瘤率調整為100％、100％和100％；參比藥物(15mg/kg)對mc-38/h-11的抑瘤率為93.8％(根據中位腫瘤體積計算)；采用中位腫瘤重量計算抑瘤率，則5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)對mc-38/h-11的抑瘤率分別為100％、100％、100％，的抑瘤率為93.7％；中位腫瘤體積與中位腫瘤重量計算所得抑瘤率非常一致，說明腫瘤體積測量方法的可靠性。5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)不但抑制腫瘤生長，還抑制腫瘤成瘤，實驗結束時(d27)，5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)劑量組成瘤率分別為40％、40％和40％，組的成瘤率為50％。荷瘤小鼠對以上藥物均能很好耐受，沒有明顯體重減輕等癥狀發生。相比較，5c10h2l2-igg1mt(1.5、5、15mg/kg)對小鼠結腸癌mc-38/h-11小鼠皮下移植瘤較具有更強的抑瘤作用。實施例19：對肺癌的體內療效建模方法：將非小細胞肺癌細胞hcc827(購自atcc貨號crl-2868)皮下接種nog鼠，構建肺癌荷瘤鼠模型，待腫瘤長到約100mm3,給藥前小鼠靜脈注射激活后的人pbmcs模擬人免疫系統，然后給藥。給藥方案：給藥劑量為10mg/kg，靜脈注射、每兩天一次，共計給藥四次。給藥后每周兩次測定腫瘤體積。分為對照igg，5c10h2l2-igg1mt，三組，每組6只。腫瘤生長曲線見圖28。結果顯示，在第4天開始，5c10h2l2-igg1mt組的腫瘤體積明顯小于組和igg對照組，5c10h2l2-igg1mt的腫瘤生長幾乎被完全抑制，組和igg對照組腫瘤在不斷生長，證明了本發明抗體較具有更強的體內抑瘤作用。盡管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護范圍之內。本發明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。sequencelisting<110>四川科倫藥物研究院有限公司<120>一種pdl-1抗體、其藥物組合物及其用途<130>idc170033<150>201610122117.6<151>2016-03-04<160>40<170>patentinversion3.2<210>1<211>360<212>dna<213>artificial<220><223>編碼單抗5c10重鏈可變區的核苷酸<400>1caggtgcaactgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagaacctgtccatt60acctgcactgtctctgggttctcattaagcaactatgatataagctggattcgccagcca120ccaggaaagggtctggagtggctcggagtaatatggactggtggagccacaaattataat180tcagctttcatgtccagactgagcatcagtagggacaactccaagagccaagttttctta240aaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatattactgtgtgagagattcgaac300tataggtacgacgagccgtttacttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca360<210>2<211>120<212>prt<213>artificial<220><223>單抗5c10重鏈可變區的氨基酸序列<400>2glnvalglnleulysgluserglyproglyleuvalalaprosergln151015asnleuserilethrcysthrvalserglypheserleuserasntyr202530aspilesertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpleu354045glyvaliletrpthrglyglyalathrasntyrasnseralaphemet505560serargleuserileserargaspasnserlysserglnvalpheleu65707580lysmetasnserleuglnthraspaspthralailetyrtyrcysval859095argaspserasntyrargtyraspgluprophethrtyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserala115120<210>3<211>318<212>dna<213>artificial<220><223>編碼單抗5c10輕鏈可變區的核苷酸序列<400>3gacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagt60ctctcctgcagggccagtcagagcattggcacaaacatacactggtttcagcaaagaaca120aatggttctccaaggcttctcataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttcc180aggtttagtggcagtggatcagggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtct240gaagatattgcagattactactgtcaacaaagtaatagctggccgtacacgttcggaggg300gggaccaagctggaaata318<210>4<211>106<212>prt<213>artificial<220><223>單抗5c10輕鏈可變區的氨基酸序列<400>4aspileleuleuthrglnserproalaileleuservalserprogly151015gluargvalserleusercysargalaserglnserileglythrasn202530ilehistrppheglnglnargthrasnglyserproargleuleuile354045lystyralasergluserileserglyileproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuserileasnservalgluser65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