即用型經干燥和經輻照的皮膚等同物的制作方法

專利名稱：即用型經干燥和經輻照的皮膚等同物的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及用于在冷藏或環境溫度下長期儲存通過器官型培養制得的皮膚等同物的體系和方法。背景發明新興的組織工程學(TE)領域已準備好在即將到來的十年在器官疾病和功能障礙的治療上取得巨大的進步。2001年，23種基于細胞的治療獲批在美國(U. S.)和歐洲上市， 其中9種為皮膚替代物或移植物，且100多種產品正在開發中。(De Bree,Genomics-based Drug Data Report and Regenerative Therapy (基于基因組學的藥物數據 艮告禾口再生療法)(1)2 :77-96(2001)). 2007年，將近100家公司參與了開發工程組織、基于細胞的治療或相關的技術(Applied Data Research，2007年2月)。總體而言，該產業從1995年到2001年具有16%的年增長率。“結構”產業部分(例如，皮膚、骨、軟骨)從1998年到 2001年顯示了 85%的增長。2004年，組織工程皮膚置換物/替代物和活性傷口修復調節劑的美國市場估價近于1.95億美元。預期銷售額以9. 5%的復合年增長率增加，在2014 年達到近于 4. 81 億美元(MedTech Insight, Windhover Information, 2005 年 9 月)。高級傷口護理技術的整個美國市場在2005年價值超過23億美元。預計這在五年時期內以 12. 3%的平均年增長率增長，在2011年達到46億美元(BCC Research, PHMOl 1E, 2007年1 月)。全球傷口護理市場在2006年估價為72億美元，且包括傳統和高級兩個部分(Espicom Business Intelligence, 2007)。傳統傷口護理產品主要由低技術的基于紗布的敷料組成， 例如編織和非編織海綿、伸縮繃帶(conforming bandages)和不粘連繃帶。高級傷口護理部分(全球41億美元)為增長最快的區域，以每年10%的兩位數增長(Espicom Business Intelligence,2007)。雖然工程組織和工程器官的大量革命性和經濟上重要的應用存在于人類健康的競技場，但是該產業的全部經濟潛力遠未實現。目前，盡管對這些技術的全球投資超過35 億美元，但是全世界的上市組織工程公司中只有一家顯示盈利。(Lysaght and Reyes, Tissue Engineering (組織工程學)7(5) :485-93 (2001))。工程組織被執業醫師、醫療保健供應商和第二方支付者接受的主要障礙在于缺乏有效且高效地保藏和儲存工程組織的方法。活細胞和組織產品的性質使得對其進行長期儲存不切實際。當前的工程組織必須常常在小心控制的條件下儲存和運送以維持生存力和功能。通常，工程組織產品花費數周或數月來生產但必須在制備后數小時或數天內使用。結果，TE公司必須不斷地以最高生產力運轉其生產設備并承擔必須廢棄的未售出產品的成本。這些存貨損失，加之先前昂貴的制備過程，迫使價格至不切實際的水平。作為一個具體實例，APLIGRAF需要大約四周來制備，只在十天內可用且必須在使用前維持在20_23°C之間。作為另一個實例，EPICEL在便攜式保溫箱中由護理員從Genzyme Biosurgery的生產設備(Cambridge，ΜΑ)運輸至使用點且在到達時立即使用。這些約束代表對開發方便且有成本效益的產品的重大挑戰。雖然已開發冷凍保存作為儲存問題的解決方法，但是已知其通過結冰、冷傷和滲透不平衡引起組織損傷。除了 APLIGRAF，唯一獲批的其他活皮膚等同物0RCEL，當前正作為一種冷凍產品在臨床試驗中，但弊端在于使用前必須維持溫度低于-ioo°c。這要求專業的產品遞送和儲存條件，包括在運輸期間使用危險物品，以及使用昂貴、危險且在鄉村診所和戰地醫院中不易獲得的液氮來儲存。此外，遞送冷凍產品需要對終端用戶部分進行專業培訓以在使用前成功解凍組織。因此，本領域需要的是制備用于在使用點常規可獲得的條件下儲存的工程組織和細胞的改進方法。由于所有臨床設備均已冷藏，開發可長期儲存于標準冰箱中的皮膚等同物將大大改進這些產品的可用性和臨床效用。開發可長期儲存于環境溫度下的皮膚等同物將進一步增加這類產品在戰場上或各種第一響應情形中立即使用的可用性。發明概述本發明主要涉及用于在冷藏或環境溫度下長期儲存通過器官型培養制得的皮膚等同物的體系和方法。在一些實施方案中，本發明提供用作傷口敷料的器官型培養的皮膚等同物的保藏方法，所述方法包括提供所述器官型培養的皮膚等同物和包裝；處理所述皮膚等同物以致使皮膚等同物中的細胞非活；和包裝所述皮膚等同物以提供經包裝的皮膚等同物。本發明不限于處理所述皮膚等同物以致使組成所述皮膚等同物的細胞非活的任何具體方法來。在一些實施方案中，所述處理步驟包括輻照所述經包裝的皮膚等同物以致使所述皮膚等同物無菌和非活。在一些實施方案中，所述輻照用Y輻照進行。在一些實施方案中，所述處理步驟包括在以下條件下干燥所述皮膚等同物，所述條件使得所述皮膚等同物中的細胞非活。本發明不限于任何具體的干燥方法。在一些實施方案中，所述干燥通過選自真空干燥和冷凍干燥的方法來進行。除非另有說明，本發明不限于任何具體的步驟順序。 在一些實施方案中，所述處理在包裝之前進行。在一些實施方案中，所述處理在包裝之后進行。在一些實施方案中，所述處理包括在使得組成所述皮膚等同物的細胞非活的條件下干燥所述皮膚等同物，以及在使得所述皮膚等同物無菌的條件下輻照所述皮膚等同物。在一些實施方案中，所述干燥步驟在所述包裝之前進行而所述輻照步驟在所述包裝步驟之后進行。本發明不限于使用任何具體的皮膚等同物。在一些實施方案中，所述器官型培養的皮膚等同物包含NIKS細胞。在一些實施方案中，所述NIKS細胞包含編碼外源多肽的外源核酸序列。在一些實施方案中，組成此皮膚等同物的細胞表達多于一種外源多肽。本發明不限于使用任何具體的外源多肽。在一些實施方案中，所述外源多肽為抗微生物多肽。 在一些實施方案中，所述抗微生物多肽選自人β-防衛素1、人β-防衛素2、人β-防衛素 3和組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)。在一些實施方案中，由所述皮膚等同物提供的抗微生物多肽的量為I-IOOOng抗微生物多肽/毫升表面提取液，在一些優選的實施方案中， 由所述皮膚等同物提供的抗微生物多肽的量為I-IOOOng抗微生物多肽/毫升表面提取液。 在一些實施方案中，將所述皮膚等同物干燥至最終質量小于濕的或未干燥皮膚等同物質量的75%、50%、25%或優選15%。在一些實施方案中，所述皮膚等同物再水化后，具有的初始DPM值為約20DPM-約300DPM，優選約70DPM-約140DPM，以及DPM變化值為約5DPM-約 400DPM，優選約10DPM-約220DPM。在一些實施方案中，所述皮膚等同物再水化后，具有的抗張強度為約0. 1-約5. OMPa，優選約0. 4-約1. SMPa0在一些實施方案中，所述包裝可熱密封。在一些實施方案中，本發明提供通過前述方法制備的包裝人皮膚等同物。在一些實施方案中，本發明提供通過前述方法制備的包裝無菌人皮膚等同物。在一些實施方案中，本發明提供組合物，所述組合物包含分離的、非活的、體外人皮膚等同物。在一些實施方案中，所述皮膚等同物為包裝的。在一些實施方案中，所述皮膚等同物為無菌的。在一些實施方案中，所述無菌皮膚等同物為經輻照的。在一些實施方案中，所述皮膚等同物為經干燥的。在一些實施方案中，所述皮膚等同物具有的質量小于濕皮膚等同物質量的50%。在一些實施方案中，所述皮膚等同物包含NIKS細胞。一些實施方案中，所述NIKS細胞包含編碼外源多肽的外源核酸序列。一些實施方案中，組成所述皮膚等同物的細胞表達多于一種外源多肽。本發明不限于使用任何具體的外源多肽。在一些實施方案中，所述外源多肽為抗微生物多肽。在一些實施方案中，所述抗微生物多肽選自人 β -防衛素1、人β -防衛素2、人β -防衛素3和組織蛋白酶抑制素。在一些實施方案中， 由所述皮膚等同物提供的抗微生物多肽的量為I-IOOOng抗微生物多肽/毫升表面提取液， 在一些優選的實施方案中，由所述皮膚等同物提供的抗微生物多肽的量為I-IOOOng抗微生物多肽/毫升表面提取液。在一些實施方案中，將所述皮膚等同物干燥至最終質量小于濕的或未干燥皮膚等同物質量的75 %、50 %、25 %或優選15%。在一些實施方案中，所述皮膚等同物再水化后，具有的初始DPM值為約20DPM-約300DPM，優選約70DPM-約140DPM，以及DPM變化值為約5DPM-約400DPM，優選約10DPM-約220DPM。在一些實施方案中，所述皮膚等同物再水化后，具有的抗張強度為約0. 1-約5. OMPa，優選約0. 4-約1. SMPa0在一些實施方案中，本發明提供治療受試者的方法，所述方法包括提供如上述的皮膚等同物組合物，和將所述皮膚等同物在以下條件下施用至傷口，所述條件使得所述皮膚等同物接觸所述傷口。在一些實施方案中，將所述皮膚等同物暫時施用至所述傷口。在一些實施方案中，本發明提供試劑盒，所述試劑盒包含含有上述皮膚等同物組合物的包裝。在一些實施方案中，所述皮膚等同物具有的保存期限為約一個月至約六個月。在一些實施方案中，本發明提供組合物，所述組合物包含非活的、分離的、體外器官型培養的皮膚等同物，該皮膚等同物具有的質量小于濕皮膚等同物質量的50%。在一些實施方案中，所述組合物包含至少一種由組成所述皮膚等同物所需的細胞表達的外源抗微生物多肽。在一些實施方案中，本發明提供前述組合物在治療受試者中的用途。在一些實施方案中，本發明提供前述組合物在治療受試者的傷口中的用途。附圖描述

圖1輻照后組織的生存力。9F1和2D2組織為已輻照的，且在輻照后3、7或14天獲取打孔活檢以及使用MTT測定法分析生存力。數據表示測量自每個試驗組中至少三個獨立活檢樣品的平均值+/_標準偏差。圖2角質形成細胞生存力/遷移測定。(A)表現出無角質形成細胞生長暈的外植體記為活角質形成細胞陰性。(B)角質形成細胞已遷移環繞在真皮邊緣的樣品記為活角質形成細胞陽性。
圖3成纖維細胞生長暈測定。用膠原酶處理來自對照和輻照9F1組織的活檢，并將分離的細胞培養六天之后，用亞甲藍染色以顯現細胞集落。圖4釋放自輻照2D2和9F1組織的蛋白。在劑量0、1或5kGy下輻照人皮膚替代物組織。用水從在輻照后3天獲取的打孔活檢中提取蛋白且通過BCA測定法定量。數據表示來自四次測量值的平均值+/_標準偏差。圖5輻照2D2組織的抗微生物活性。將獲自未輻照和輻照2D2組織的打孔活檢在無血清培養基中孵育所示時間。提取自這些組織的物質的抗微生物活性通過CFU計數來確定并針對對照細菌培養物進行歸一化。每個數據點表示獲自兩個獨立樣品的平均值。圖6輻照9F1組織的抗微生物活性。將獲自未輻照和輻照9F1組織的打孔活檢在無血清培養基中孵育4小時。來自這些組織的抗微生物活性通過CFU計數來確定并針對對照細菌培養物(設定其值為1)進行歸一化。每個數據點表示來自指示處理組中組織的四個活檢樣品的平均值+/_標準偏差。圖7輻照2D2組織的抗微生物活性。將獲自未輻照和輻照2D2組織的打孔活檢在無血清培養基中孵育4小時。來自這些組織的抗微生物活性通過CFU計數來確定并針對對照細菌培養物(設定其值為1)進行歸一化。每個數據點表示來自指示處理組中組織的四個活檢樣品的平均值+/_標準偏差。圖8從儲存在營養凝膠或不粘連紗布上的皮膚等同物組織中釋放的總蛋白。輻照人皮膚等同物組織且在14天后獲取打孔活檢并在0. 2ml無菌水中于37°C孵育M小時。提取的蛋白通過BCA測定法來定量。數據表示來自四次測量值的平均值+/_標準偏差。圖9冷凍干燥經輻照的工程皮膚等同物的組織學分析。將新鮮皮膚等同物與冷凍干燥的或冷凍干燥且經lkGy、5kGy或25kGy劑量水平輻照的皮膚等同物相比較。將組織切片用蘇木精/伊紅染色并在400x放大率下拍照。比例尺=200 μ m圖10真空干燥經輻照的工程皮膚等同物的組織學分析。將新鮮皮膚等同物與真空干燥的或真空干燥且經lkGy、5kGy或25kGy劑量水平輻照的皮膚等同物相比較。將組織切片用蘇木精/伊紅染色并在400x放大率下拍照。比例尺=200 μ m圖11經輻照的真空干燥和冷凍干燥皮膚等同物的生存力。條顏色表示(從左到右)黑色=OkGy(未輻照的)；深灰色=11^7;淺灰色=51^7;白色=251^^。數據點表示平均值+/_標準偏差(n = 4-8)，歸一至新鮮制備的、未輻照皮膚等同物組織。圖12干燥的經輻照皮膚等同物的表皮屏障功能。左面板在10秒間隔內測量經 lkGy、5kGy或25kGy輻照的冷凍干燥或真空干燥的工程皮膚組織在組織表面電容方面的變化。值表示來自兩個獨立組織各自的兩個測量值的平均值+/_標準偏差。右面板報道了經lkGy、5kGy或25kGy輻照的冷凍干燥或真空干燥組織的初始DPM值。條顏色表示(從左到右)黑色=OkGy (未輻照的)；深灰色=IkGy ；淺灰色=5kGy ；白色=25kGy。值表示來自兩個獨立組織各自的兩個測量值的平均值+/_標準偏差。圖13干燥和輻照的工程皮膚組織的機械性能。條顏色表示(從左到右)黑色= OkGy (未輻照的)；深灰色=IkGy ；淺灰色=^Gy ；白色=25kGy。數據為平均值士標準偏差。η = 2-4定義本文所用的術語“皮膚等同物”、“人皮膚等同物”、“人皮膚替代物”和“器官型培養物”可替換地用于指角質形成細胞的體外衍生培養物，其已分層為鱗狀上皮細胞。通常，所述皮膚等同物通過器官型培養制備且包含除了角質形成細胞層之外的真皮層。本文所用的術語“濕皮膚等同物”是指在器官型培養中或立即從器官型培養中移出的皮膚等同物。本文所用的術語“非活的”是指通過諸如MTT測定法等測定法確定為非活的細胞。本文所用的術語“無菌的”是指基本或完全無微生物或真菌污染的皮膚等同物。本文所用的術語“干燥的”是指已移除水分的組合物。“干燥皮膚等同物”為已移除水分的皮膚等同物，因此干燥皮膚等同物比濕的或立即從器官型培養中移出的皮膚等同物具有更低的水分含量。比較干燥皮膚等同物與濕皮膚等同物的質量以用作干燥程度的衡量，并反映干燥過程期間從所述皮膚等同物中移除的水量。本文所用的術語“NIKS細胞”是指具有保藏為細胞系ATCCCRL-1219的細胞特性的細胞。術語“同源性”是指互補性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，相同)。 部分互補序列至少部分地抑制完全互補序列與靶核酸的雜交，并使用功能術語“基本同源” 提及。術語“結合抑制”，當用于指核酸結合時，是指由同源序列的競爭引起對結合靶序列的結合抑制。完全互補序列與靶序列的雜交抑制可在低嚴格性條件下使用雜交測定(DNA或 RNA印跡、溶液雜交等)來檢驗。基本同源序列或探針在低嚴格性條件下競爭和抑制完全同源物與靶結合(即，雜交)。這并不是說低嚴格性條件允許非特異性結合；低嚴格性條件要求兩個序列的相互結合為特異性(即，選擇性)相互作用。不存在非特異性結合可通過使用第二個靶來檢測，所述第二個靶缺乏甚至部分程度的互補性(例如，小于約30%的同一性)；在非特異性結合不存在下，所述探針將不與所述第二個非互補性靶雜交。術語“基因”是指核酸(例如，DNA)序列，其包含產生多肽或前體(例如，KGF-2) 所需的編碼序列。所述多肽可由全長編碼序列或由該編碼序列的任何部分來編碼，只要保留了全長或片段的所需活性或功能性質(例如，酶活性、配體結合、信號轉導，等等)即可。 該術語還包括結構基因的編碼區和內含序列，該內含序列在5’和3’兩個末端毗鄰編碼區， 在任一末端的距離約11Λ，使得所述基因對應全長mRNA的長度。位于編碼區5’且存在于 mRNA上的序列稱為5’非翻譯序列。位于編碼區3’或下游且存在于mRNA上的序列稱為3’ 非翻譯序列。術語“基因”包括基因的cDNA和基因組兩種形式。基因的基因組形式或克隆含有由叫做“內含子”或“間插區”或“間插序列”的非編碼序列打斷的編碼區。內含子為轉錄成核RNA(hnRNA)的基因區段；內含子可含有諸如增強子等調控元件。內含子被從核轉錄物或初級轉錄物中移除或“剪接掉”；因此內含子不存在于信使RNA(mRNA)轉錄物中。翻譯期間mRNA功能為指定新生多肽中的氨基酸序列或順序。本文所用的術語“核酸分子編碼”、“DNA序列編碼”和“DNA編碼”是指沿著脫氧核糖核酸鏈的脫氧核苷酸的順序或序列。這些脫氧核苷酸的順序決定沿著多肽(蛋白)鏈的氨基酸的順序。因此DNA序列編碼氨基酸序列。本文所用的術語“重組DNA分子”是指由DNA區段組成的DNA分子，該DNA區段借助分子生物學技術連接在一起。本文所用的術語“純化的”或“純化”是指從樣品中移除污染物。本文所用的術語“載體”用于指將DNA區段從一個細胞轉移到另一個細胞的核酸分子。術語“運載體”有時與“載體”可替換使用。本文所用的術語“表達載體”是指以下重組DNA分子，其含有所需編碼序列和對在特定宿主生物中表達可操作連接的編碼序列所需的適當核酸序列。原核生物中表達所需的核酸序列通常包括啟動子、操縱基因(任選的)和核糖體結合位點，常常伴隨其他序列。已知真核細胞利用啟動子、增強子以及終止信號和多腺苷酸化信號。“可操作連接的”是指并置，其中如此描述的組分處于允許其以其預期的方式行使功能的關系中。調控序列當其以以下方式連接時與編碼序列“可操作連接”，所述方式使得在與該調控序列兼容的條件下獲得編碼序列的表達。本文所用的術語“轉染”是指將外源DNA引入真核細胞。轉染可通過本領域已知的各種方法來完成，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、1，5- 二甲基-1，5- 二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂轉染、原生質體融合、反轉錄病毒侵染以及生物射彈。術語“穩定轉染”或“穩定轉染的”是指將外源DNA引入且整合進轉染細胞的基因組中。術語“穩定轉染子”是指已將外源DNA穩定整合進基因組DNA的細胞。術語“瞬時轉染”或“瞬時轉染的”是指將外源DNA引入細胞，其中外源DNA未能整合進已轉染細胞的基因組中。外源DNA在轉染細胞的細胞核中存留數天。這段時間里， 外源DNA受控于控制染色體中內源基因表達的調控控件。術語“瞬時轉染子”是指已攝入外源DNA但未能整合此DNA的細胞。本文所用的術語“抗微生物多肽”通常是指5-100個氨基酸長度的短肽，其表現出抗微生物活性。抗微生物多肽的實例包括但不限于人β -防衛素1、2和3以及組織蛋白酶抑制素。本發明范圍內多種抗微生物多肽的序列為已知和可得的，包括在WO 05/012,492 中鑒定的那些，該文獻通過引用以其整體結合于本文中。發明詳述本發明主要涉及制備、運送和儲存通過器官型培養制得的皮膚等同物的體系和方法。特別地，本發明涉及以下方法，其用于干燥或輻照人皮膚等同物以消除所述皮膚等同物的生存力，使得其可在標準條件下長時期儲存和運輸以用于戰場或現場使用，與用于醫院相對比。醫療規劃為伊拉克自由行動的關鍵部分且包括燒傷傷亡人員預計數目的預測模 M (Barillo, D. J.,等,Tracking the daily availability of burn beds for national emergencies(追蹤全國緊急事件中燒傷床位的每日可用性).J Burn Care Rehabi 1, 2005. 26(2)第174-82頁)。這些模型中傷亡人員估計超過了唯一的國防部燒傷中心的容量。國防部協同美國燒傷協會開發了基于現行實踐和可用于燒傷護理的技術的大規模人員傷亡計劃。第一次海灣戰爭中已知對方軍隊使用了包括硫芥子氣在內的化學武器。當前的伊拉克和阿富汗沖突中，戰場燒傷數量已達到新水平。皮膚的熱起皰(發皰)燒傷和化學起皰(發皰)燒傷，以及常用于治療這些損傷的蝕頂和清創術的程序，導致產生易受細菌病原體感染開放性傷口。不幸的是，過去25年里嚴重缺乏針對治療皮膚燒傷或起皰傷口而開發的創新的救生技術。此領域對創新的需求通過2006年10月25-28日由國立綜合醫學科學研究院贊助的題為“Mate of the Science of Burn Research (燒傷研究科學的狀態)”的會議來強調。Y-輻照的人尸體皮膚在環境溫度下為穩定的且已成功用于治療皮膚缺損 (Rosales, M. A. ,M. Bruntz 禾口 D. G. Armstrong,Gamma-irradiated human skin allograft a potential treatment modality for lower extremity ulcers ( γ -福照的人皮膚同禾中異體移植物下肢潰瘍的潛在治療藥征).ht Wound J, 2004. 1(3)第201-6頁；Cancio， L.C·，等，Burn support for Operation Iraqi Freedom and related operations,2003 to 2004(對伊拉克自由行動的燒傷支持及相關手術，2003-2004). J Burn Care Rehabi 1, 2005.26(2)第151-61頁)。然而，未指明這類產品用于有感染跡象的傷口。皮膚傷口 (例如起因于起皰性暴露和熱損傷的那些)為細菌的生長和源自創面膿毒癥的并發癥提供了理想的環境。此外，多重耐藥臨床生物分離群(例如鮑氏不動桿菌(AcinetcAacter baumannii)、f同綠/[叚單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)禾口而 甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA))頻率的增加，強調了對于新型方法的需求以補充用于皮膚傷口治療的當前抗微生物治療方案(MiIner, S. Μ.禾P Μ. R. Ortega, Reduced antimicrobial peptide expression in human burn wounds (人燒傷傷口中縮減的抗微生物肽表達).Burns，1999. 25 (5)第 411-3 頁)。在一些實施方案中，本發明為治療起皰性皮膚損傷、熱皮膚損傷及外傷性皮膚損傷提供現場準備(field-ready)的組織工程干燥或輻照抗微生物皮膚等同物。將所述干燥或輻照皮膚等同物設計用于在環境溫度下長期儲存，并對具有對外部上皮的起皰性損傷、 熱傷或外傷損傷的患者有最大的多能性和安全性。在優選的實施方案中，將所述干燥或輻照皮膚等同物改造成將廣譜人宿主防衛肽防衛素-3(hBD-;3)或組織蛋白酶抑制素 (hCAP18/LL-37)遞送至傷口床。因此，在一些實施方案中，本發明提供包含非活細胞的干燥或輻照人皮膚等同物。在一些實施方案中，將所述皮膚等同物改造成表達和提供外源抗微生物多肽，優選人 β-防衛素_1、2或3或組織蛋白酶抑制素(hCAP18/LL37)。在一些實施方案中，將所述非活的皮膚等同物施用至傷口。在一些實施方案中，將所述非活的人皮膚等同物暫時施用至傷口。在一些實施方案中，將所述非活的人皮膚等同物移除并替換為提供相同抗微生物多肽的其他非活的人皮膚等同物。在其他的實施方案中，將所述非活的人皮膚等同物移除并替換為提供不同抗微生物多肽的其他非活的皮膚等同物。在其他實施方案中，在傷口(例如燒傷傷口)上施用活皮膚等同物或永久皮膚移植物之前將非活的人皮膚等同物移除。在優選的實施方案中，將本發明的皮膚等同物改造成表達外源抗微生物多肽。本發明不限于使用任何具體的抗微生物多肽。在優選的實施方案中，所述抗微生物多肽為人 β -防衛素-I、人β -防衛素-2、人β -防衛素-3或者組織蛋白酶抑制素(hCAP-18/LL37) 或變體。在一些優選的實施方案中，將編碼所述抗微生物多肽的核酸構建體或載體引入角質形成細胞(例如，NIKS細胞)并將轉染的角質形成細胞用于通過器官型培養技術制備所述皮膚等同物。在共同待審申請10/909，119中提供制備表達外源多肽以及其它野生型和變體抗微生物多肽的皮膚等同物的優選實施方案，所述申請的全部內容通過引用結合于本文中。A)通過器官型培養制備的皮膚等同物本發明不限于使用能夠分化為鱗狀上皮細胞的細胞的任何具體來源。實際上， 本發明考慮使用各種可分化為鱗狀上皮細胞的細胞系和來源，包括原代和無限增殖化角質形成細胞。細胞來源包括從人和尸體供體中切除的角質形成細胞和真皮成纖維細胞(Auger 等，h Vitro Cell (體外細胞).Dev. Biol. -Animal 36 :96-103 ；美國專利號5，968，546和5，693，332，其各自都通過引用結合于本文中)、新生包皮(Asbill等， Pharm. Research 17(9) :1092-97(2000) ；Meana 等，Burns 24:621-30(1998)；美國專利號 4，485,096,6,039, 760和5，536，656，其各自都通過引用結合于本文中)，以及無限增殖化角質形成細胞細胞系例如NMl細胞(Baden，In Vitro Cell (體外細胞).Dev. Biol. 23 (3) 205-213(1987))、HaCaT 細胞(Boucamp 等，J. cell. Boil. 106 :761-771 (1988))，以及 NIKS細胞(細胞系BC-1-Ep/SL ；美國專利號5，989，837，通過引用結合于本文中；ATCC CRL-12191)。這些細胞系中的每一種都可經培養或遺傳修飾以產生能夠表達或聯合表達所需蛋白的細胞系。在特別優選的實施方案中，使用NIKS細胞。一種新型人角質形成細胞系(近二倍體無限增殖化角質形成細胞(near-diploid immortalized Jseratinocyte^l或 NIKS)的發現為使用非病毒載體遺傳改造人角質形成細胞提供了機會。OTKS細胞的獨特優勢在于其為遺傳上均勻、無病原體的人角質形成細胞的連貫來源。為此，其可用于應用遺傳工程和基因組基因表達方法以提供相對于當前可用技術和皮膚組織產品性能增強的皮膚等同物培養物。由Wisconsin大學鑒別和表征的NIKS角質形成細胞細胞系為非致瘤的，表現出穩定的核型，且在單層培養和器官型培養中均表現出正常生長和分化。NIKS細胞在培養中形成完全分層的皮膚等同物。這些培養物不能被測試的所有標準區別，因而并非形成自原代人角質形成細胞的器官型培養物。然而不同于原代細胞，無限增殖化NIKS細胞將在單層培養中無限地繼續增殖。這為在遺傳上操縱細胞以及分離具有新有用性質的新克隆提供了機會(Allen-Hoffmann 等，J. Invest. Dermatol.，114(3) :444-455 (2000))。NIKS細胞由分離自一個表觀正常男性嬰兒的人類新生兒包皮角質形成細胞的 BC-I-Ep株系產生。早期傳代中，BC-I-Ep細胞表現出無形態學或生長特征，這對于培養的正常人角質形成細胞而言為非典型的。培養的BC-I-Ep細胞表現出成層現象以及程序性細胞死亡的特征。為確定復制壽命，將BC-I-Ep細胞在標準角質形成細胞生長培養基中以 3xl05個細胞/100-mm皿的密度連續培養至衰老并每隔一周傳代(大約1 25分裂)。至第 15代，群體中大部分角質形成細胞出現衰老，這根據出現大量表現出大型、扁平細胞的敗育集落來判斷。然而，在第16代，表現小細胞尺寸的角質形成細胞為明顯的。至第17代，只有所述小尺寸的角質形成細胞存在于培養物中且明顯無大的衰老角質形成細胞。幸存于這個推定轉捩期的小角質形成細胞產生的群體表現形態學上均勻，并且產生表現出典型的角質形成細胞特征(包括細胞-細胞黏著和表觀鱗狀物產生)的角質形成細胞集落。幸免于衰老的角質形成細胞以3xl05個細胞/100-mm皿的密度連續培養。通常該培養物在7天內達到近于SxlO6個細胞的細胞密度。此穩定的細胞生長速率一直維持到至少59代，表明該細胞已達到永生。自原始衰老群體出現的角質形成細胞最初命名為BC-I-Ep/自發系而現在稱為NIKS。已利用PCR或DNA印跡分析針對原病毒DNA序列篩選NIKS細胞系，所述原病毒 DNA 序列為 HIV-I、HIV-2、EBV、CMV、HTLV-1、HTLV-2、HBV、HCV、B-19 細小病毒、HPV-16、 SV40、HHV-6、HHV-7、HPV-18和HPV-31的原病毒DNA序列。這些病毒均未檢測到。對親代BC-I-Ep細胞的第3代以及NIKS細胞的第31和M代進行染色體分析。親代BC-I-Ep細胞具有正常染色體組46，XY。在第31代，所有NIKS細胞包含47條染色體， 在8號染色體長臂帶有一條額外的等臂染色體。未檢測到其他明顯的染色體異常或標記染色體。已表明NIKS細胞的核型穩定到至少第M代。NIKS細胞系和BC-I-Ep角質形成細胞的DNA指紋在分析的全部12個基因座方面完全相同，表明NIKS細胞產生于親代BC-I-Ep群體。NIKS細胞系通過隨機機會具有親代BC-I-Ep DNA指紋的幾率為4xl(T16。人角質形成細胞三種不同來源(ED_l_Ep、SCC4和 SCC13y)的DNA指紋與BC-I-Ep指紋型不同。此數據也顯示分離自其他人的角質形成細胞 (ED-1-Ep, SCC4和SCC13y)與BC-I-Ep細胞不相關或彼此不相關。該NIKS DNA指紋數據提供了明確的方法來鑒定NIKS細胞系。培養的細胞中，丟失p53功能與增強的增殖潛能和增加的永生頻率有關。OTKS細胞中P53的序列與發表的p53序列((ienBank檢索號M14695)相同。人中，p53以兩種主要的多態形式存在，通過在72號密碼子的氨基酸的子來區別。OTKS細胞中p53的兩個等位基因均為野生型且在72號密碼子具有序列CGC，其編碼精氨酸。p53的另一種常見形式在此位置具有脯氨酸。NIKS細胞中p53的全序列與BC-I-Ep祖細胞相同。亦已發現NIKS細胞中Rb為野生型。無貼壁依賴的生長與體內致瘤性高度關聯。為此，研究了含瓊脂或甲基纖維素的培養基中NIKS細胞的無貼壁依賴的生長特征。OTKS細胞在含瓊脂或甲基纖維素的培養基中4周后仍為單細胞。繼續該試驗至總共8周以檢測緩慢生長的OTKS細胞變體。未觀察到任何變體。為確定親代BC-I-Ep角質形成細胞和無限增殖NIKS角質形成細胞細胞系的致瘤性，將細胞注入無胸腺裸鼠的脅中。人鱗狀細胞癌細胞系SCC4，用作這些動物中腫瘤產生的陽性對照。設計樣品的注入設計，使得動物在一側脅接受SCC4細胞而對側的脅接受親代 BC-I-Ep角質形成細胞或OTKS細胞。這種注入策略消除了腫瘤產生中動物與動物間的差異并且證實該鼠支持致瘤細胞的旺盛生長。親代BC-I-Ep角質形成細胞(第6代)和NIKS 角質形成細胞(第35代)在無胸腺裸鼠中均不產生腫瘤。分析了 NIKS細胞在深層培養和器官型培養中經歷分化的能力。實施例中詳述了器官型培養的技術。在特別優選的實施方案中，本發明的器官型培養的皮膚等同物包括真皮等同物，該真皮等同物形成自膠原或相似的材料以及成纖維細胞。遵照器官型培養方法， 將角質形成細胞(例如NIKS細胞或NIKS細胞與來自患者細胞的組合)接種到所述真皮等同物，并形成以鱗狀分化為特征的表皮層。對于深層培養的細胞，監控角質化包膜的形成作為鱗狀分化的標志。培養的人角質形成細胞中，角質化包膜裝配的早期導致形成由內披蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑-α 和其他蛋白組成的未成熟結構，其代表成熟角質化包膜最內部的三分之一。少于2%的來自貼壁BC-I-Ep細胞或OTKS細胞系的角質形成細胞產生角質化包膜。此發現與先前的研究一致，表明活躍生長的、分會合的角質形成細胞產生少于5%的角質化包膜。為確定NIKS細胞系是否能夠在誘導分化時產生角質化包膜，將該細胞從貼壁培養中移出并在用甲基纖維素制成的半固體培養基中懸浮M小時。終末分化的許多方面，包括角蛋白的差異表達和角質化包膜形成，可通過丟失角質形成細胞的細胞-細胞和細胞-基底黏著來體外觸發。NIKS 角質形成細胞產生與親代角質形成細胞同樣多或通常更多的角質化包膜。這些研究結果表明NIKS角質形成細胞在其啟動形成此細胞型特異性分化結構的能力上沒有缺陷。為證實NIKS角質形成細胞可經歷鱗狀分化，將該細胞在器官型培養中培養。生長在塑料基底和浸沒于培養基的角質形成細胞培養物復制但表現出有限的分化。具體而言， 人角質形成細胞變為匯合的且經歷有限的分層而產生由3層或更多層角質細胞層組成的片層。經光學和電子顯微鏡術，在深層培養和完整的人皮膚中形成的多層片層的構造之間存在顯著的差異。與此相反，器官型培養技術允許角質形成細胞在體內樣條件下生長和分化。具體而言，該細胞黏附于由包埋在纖維狀膠原基質內部的真皮成纖維細胞組成的生理基底。將器官型培養物維持在空氣-培養基界面。這樣，上片層中的細胞暴露于空氣中而增殖中的基底細胞仍然最靠近由通過膠原凝膠的擴散提供的營養物梯度。在這些條件下，形成了正確的組織構造。正常分化表皮的數個特征為明顯的。親代細胞和NIKS細胞系兩者中，單層立方基底細胞均靜止于表皮和真皮等同物的連接處。圓形的形態和高核質比指示了活躍分裂的角質形成細胞群體。正常人表皮中，基底細胞分裂時產生子細胞，其向上移動進入組織的分化層。子細胞在尺寸上增大且變為扁平和鱗狀。最終這些細胞去核且形成角質化的角化結構。這種正常分化過程在親代細胞和NIKS細胞的上層中均為明顯的。上面的表皮層中明顯出現扁平鱗狀細胞，表明器官型培養物中已發生了分層。器官型培養物最上面的部分中，去核的鱗狀物剝離培養物的頂端。到目前為止，未觀察到器官型培養中的親代角質形成細胞和NIKS角質形成細胞細胞系之間在光學顯微水平下的分化組織學差異。為觀察親代(第5代)和NIKS(第38代)器官型培養物更詳細的特征以及為確認組織學觀察結果，使用電子顯微鏡術分析樣品。在器官型培養15天后獲取親代細胞和無限增殖化NIKS人角質形成細胞細胞系，垂直切開基底層以顯示分層的程度。親代細胞和NIKS 細胞系均在器官型培養中經歷廣泛分層并形成正常人表皮的特征性結構。大量的橋粒形成于親代細胞和NIKS細胞系的器官型培養物中。還觀察到，親代細胞和細胞系的基底角質形成細胞層中均形成了基板和相關的半橋粒。半橋粒為特化的結構，其增加角質形成細胞與基板的黏附且有助于維持組織的完整性和強度。這些結構尤其明顯出現在親代細胞或NIKS細胞直接依附于多孔支持體的區域。這些研究結果與早前的超微結構研究結果一致，該超微結構研究結果使用了在含成纖維細胞的多孔支持體上培養的人包皮角質形成細胞。在光學和電子顯微水平下的分析均表明器官型培養中的NIKS細胞系可分層、分化以及形成正常人表皮中存在的結構，如橋粒、 基板和半橋粒。B)皮膚等同物的干燥或輻照在優選的實施方案中，將如實施例1中所述制備的皮膚等同物輻照和/或干燥以提供非活的皮膚等同物。在一些實施方案中，將所述皮膚等同物干燥以消除細胞生存力。在一些實施方案中，將所述皮膚等同物輻照，例如，Y輻照。在一些實施方案中，對所述皮膚等同物給以劑量為約0. 5kGy-約25kGy的、輻照。在一些實施方案中，對所述皮膚等同物給以劑量為約0. 5-約12kGy的輻照，更優選約IkGy-約5kGy的、輻照。任何情況下，遞送到所述皮膚等同物的輻照量優選足以造成所述皮膚等同物所含細胞成為非活的，該細胞的非活通過MTT生存力測定法或其他適宜的生存力測定法來測定。在另外優選的實施方案中，將所述皮膚等同物真空干燥或冷凍干燥。在一些實施方案中，將所述皮膚等同物在輻照之前干燥。在一些優選的實施方案中，將所述皮膚等同物在干燥或輻照前包裝在無菌包裝中。在另外優選的實施方案中，將所述皮膚等同物用諸如紗布等無菌織物包裝以允許儲存、 運輸和終端用戶的簡易使用。在其他實施方案中，所述干燥或輻照皮膚等同物保持了在與傷口接觸后釋放內源多肽至傷口表面的能力。在另外實施方案中，所述干燥或輻照皮膚等同物保持了在與傷口環境接觸后釋放外源多肽至傷口的能力。在另外實施方案中，將所述皮膚等同物在使用前冷藏，而在其他實施方案中，將所述皮膚等同物在使用前儲存于環境溫度下。應認識的是，所述皮膚等同物干燥的程度可通過比較干燥皮膚等同物的質量和未干燥皮膚等同物(濕皮膚等同物，即，剛從器官型培養中移出的皮膚等同物)的質量來確定。在一些實施方案中，將所述皮膚等同物干燥至最終質量小于濕皮膚等同物質量的75%、 50%、25%或優選15%。在一些實施方案中，本發明的干燥皮膚等同物具有的質量小于濕的或未干燥皮膚等同物質量的75 %、50 %、25 %或優選15%。在一些實施方案中，將所述干燥皮膚等同物在施用于受試者之前再水化。在一些實施方案中，所述再水化皮膚等同物具有的抗張強度為0. l-5.0MPa，優選約0.4-約1. 8MPa。在一些實施方案中，所述再水化皮膚等同物具有的初始DPM值為約20DPM-約300DPM，優選約70-約140DPM，以及DPM變化值為約 5DPM-約 400DPM，優選約 10DPM-約 220DPM。在一些實施方案中，將所述干燥和/或輻照皮膚等同物用于遞送目的肽或蛋白至受試者，以及在一些優選實施方案中至受試者的傷口床。表達外源肽和蛋白的皮膚等同物先前已由發明者描述，參見，例如WO 05/012492，通過引用以其整體結合于本文中。在一些實施方案中，將所述皮膚等同物改造成表達一種或多種抗微生物多肽。在一些實施方案中， 所述抗微生物多肽為組織蛋白酶抑制素、人β -防衛素1、人β -防衛素2、或人β -防衛素 3、或其組合。在優選的實施方案中，所述肽或多肽為外源的，即，由改造進入角質形成細胞的外源基因構建體編碼和表達的，該角質形成細胞用來制備所述皮膚等同物。由所述皮膚等同物遞送的肽或多肽的量可通過將水溶液施用至皮膚等同物并測定遞送進所述溶液的肽或多肽的量來確定。在一些實施方案中，提供所述多肽的量為I-IOOOng抗微生物多肽/ 毫升提取液。在一些實施方案中，提供所述多肽的量為10-500ng抗微生物多肽/毫升提取液。C)治療應用已設想本發明的非活皮膚等同物可在治療上使用。在一些實施方案中，將所述干燥或輻照皮膚用于傷口閉合和燒傷治療應用。使用自體移植物和同種異體移植物治療燒傷和傷口閉合已描述于Myers等，A.J.Surg. 170(1) :75-83(1995)以及美國專利號 5，693，332,5, 658，331和6，039，760，其各自都通過引用結合于本文中。在一些實施方案中，所述皮膚等同物可與真皮替代物(例如DERMAGRAFT或INTEGRA)結合使用。因此，本發明提供傷口(包括由燒傷造成的傷口)閉合的方法，包括提供皮膚等同物和受傷的患者，以及在使得傷口閉合的條件下用所述皮膚等同物治療所述患者。在一些實施方案中，利用所述皮膚等同物治療慢性皮膚傷口。慢性皮膚傷口(例如，靜脈曲張性潰瘍、糖尿病性潰瘍、壓迫性潰瘍)為嚴重的問題。治愈這種傷口常常花費遠超過一年的治療。目前治療選擇包括敷料和清創術(使用化學藥品或外科手術清除壞死組織)，和/或在感染的情況下抗生素。這些治療選擇需要長久的時間和大量的患者依從性。因此，可增加醫師在治愈慢性傷口方面的成功且加快傷口愈合速率的療法將滿足本領域未滿足的需求。因此，本發明設想用皮膚等同物治療皮膚傷口，該皮膚等同物包含本發明的細胞(例如，NIKS細胞)。在一些實施方案中，將皮膚等同物局部施用于傷口。在其他實施方案中，將包含NIKS細胞的皮膚等同物用于部分皮層傷口(partial thickness wound)上的移植。在其他實施方案中，將包含NIKS細胞的皮膚等同物用于全層傷口(full thickness wound)上的移植。在其他實施方案中，將包含NIKS細胞的皮膚等同物用于治療多種類型的內部傷口，包括但不限于排列在胃腸道的粘膜內部傷口、潰瘍性結腸炎，以及可能由癌癥治療引起的粘膜炎癥。在又另外的實施方案中，將包含表達宿主防衛肽的NIKS細胞的皮膚等同物用作暫時或永久性的傷口敷料。在再另外的實施方案中，將所述細胞改造成提供附加的治療劑給受試者。本發明不限于遞送任何具體的治療劑。實際上，設想的是可將各種治療劑遞送給受試者，包括但不限于酶、肽、肽類激素、其他蛋白、核糖體RNA、核酶、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA) 以及反義RNA。在優選的實施方案中，所述治療劑為宿主防衛肽，如人0_防衛素1、2或 3或組織蛋白酶抑制素，參見，例如，美國專利申請10/909，119，通過引用以其整體結合于本文中。這些治療劑可為各種目的而遞送，包括但不限于修正遺傳缺陷的目的。在一些具體的優選實施方案中，所述治療劑以解毒有遺傳的先天性代謝缺陷(例如，氨基酸代謝病 (aminoacidopathesis))的患者為目的而遞送，其中移植物充當野生型組織。設想的是遞送所述治療劑修正所述缺陷。在一些實施方案中，用編碼治療劑(例如，胰島素、凝血因子IX、 紅細胞生成素，等等)的DNA構建體轉染所述細胞，然后將轉染細胞給予受試者。所述治療劑隨后從移植物中遞送至患者的血流或其他組織。在優選的實施方案中，編碼所述治療劑的核酸可操作地連接適當的啟動子。本發明不限于使用任何具體的啟動子。實際上，設想使用各種啟動子，包括但不限于誘導型啟動子、組成型啟動子、組織特異性啟動子以及角質形成細胞特異性啟動子。在一些實施方案中，將編碼所述治療劑的核酸直接引入角質形成細胞中(即，通過電穿孔、磷酸鈣共沉淀或脂質體轉染)。在其他優選的實施方案中，提供編碼所述治療劑的核酸作為載體且通過本領域已知的方法將所述載體引入角質形成細胞中。 在一些實施方案中，所述載體為諸如復制型質粒等附加型載體。在其他實施方案中，所述載體整合進角質形成細胞的基因組中。整合型載體的實例包括但不限于反轉錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、非復制型質粒載體和轉座子載體。實驗性實施例提供下列實施例以表明和進一步說明本發明的某些優選實施方案和方面且不應理解為限制其范圍。在以下實驗性公開內容中，下列縮寫適用eq(當量)；M(摩爾的)；mM(毫摩爾的)；μΜ(微摩爾的)；N(正常的)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μπιο (微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克)；mg(毫克)；yg(微克)；ng(納克)；1或L(升)；ml或mL(毫升)；μ 或 yL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μπι(微米)；nm(毫微米)；C(攝氏度)；U(單位)， mU(毫單位)；min.(分鐘)；sec.(秒)；% (百分比)；1Λ(千堿基)；bp(堿基對)；PCR(聚合酶鏈反應)；BSA(牛血清白蛋白)；CFU(集落生成單位)；kGy(千戈瑞)；PVDF(聚偏二氟乙烯)；BCA(二辛可寧酸)；SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)。實施例1本實施例描述制備皮膚等同物的方法。培養基.器官型培養過程使用三種不同的培養基，均基于美國專利7，407，805中所述SMB培養基的配方，例外的是從所有培養基中除去霍亂毒素。FMOl用來增殖在皮膚等同物真皮等同物層中使用的正常人真皮成纖維細胞(NHDF)。除了含有胎兒克隆II血清最終)和缺少霍亂毒素之外，FMOl具有與SMB相同的配方。KMOl用來生長NIKS角質形成細胞，且除了含有2. 5%胎兒克隆II并額外加入了終濃度為5ng/ml的表皮生長因子 (EGF)之外，其具有與SMB相同的組成。SMOl用于皮膚等同物制備的表皮分層階段期間且除了不含霍亂毒素之外，與SMB相同。真皮等同物制備.第0天，將冷凍的NHDF細胞解凍和涂板。次日(第1天)用 FMOl飼養所述細胞以移除殘留的冷凍保護劑且在第3天重復。第4天，將其收獲以用于真皮等同物中。為制備真皮等同物，首先將I型鼠尾膠原在0. 03N醋酸中稀釋至;3mg/ml，并在冰上冷卻。將濃縮Ham，s F12培養基的混合物(8. 7X標準強度且用pH 7. 5的HEPES緩沖) 與胎兒克隆II混合。這兩種溶液的終溶液體積為11. 3和9.6%。向培養基混合物中加入 IN NaOH(終溶液的2.4%)。然后向混合物中加入(74. 7% )稀釋的膠原。向混合物中加入2%體積的懸浮成纖維細胞(2. 78xl06/ml)。將9ml最終的真皮等同物混合物倒入各個 75mm TRANSTOLL 內眼板(Corning Costar)中。50-70 分鐘凝膠形成期之后，將 Transwell 內眼板轉移到150mm培養皿中的不銹鋼網表面。將80ml FMOl置入TRANSWELL內眼板外面的150mm皿中以及IOml置于真皮等同物之上。在用于器官型培養物之前，將真皮等同物置入37°C、5% CO2、90%相對濕度的培養箱中4-5天。NIKS生長和接種.將NIKS細胞解凍且以約切105個細胞/IOOmm皿的密度涂板。 NIKS培養可在存在或缺乏鼠飼養細胞時進行。第1天，用新鮮KMOl飼養所述NIKS細胞以移除殘留的冷凍保護劑。第3天再次飼養所述NIKS細胞。第4天，從初始的plOO培養物中收獲所述NIKS細胞且以1. 2xl06/瓶的密度接種入225cm2培養瓶中。第7和8天用新鮮培養基飼養所述NIKS培養物。第9天，將所述NIKS細胞收獲、計數并重懸于SMOl中。將 2. 27xl04個NIKS細胞/cm2接種到真皮等同物表面。皿中為飼養和升至空氣_培養基界面的培養物。將培養物轉移至設為75%的受控濕度培養箱，在此其繼續剩余的生長。第14、 18,22,25,28和30天用SMOl飼養培養物。實施例2對制備非活的無菌皮膚等同物組織所需Y輻照的致死劑量的確定開發輻照皮膚等同物的制備方案以先前對工程人皮膚組織產品建立的觀天制備過程為基礎。將已分別針對增強表達宿主防衛肽hBD-3和hCAP18/LL-3改造的9F1和2D2 組織，采用無菌程序來制備。將組織轉移到營養凝膠室，并在包裝和運輸之前密封。Y輻照由 MerigenicsJnc.在其 Charlotte，North Carolina 設施中使用 ExCell 高精密度 γ 輻照器來進行。組織接受了五種輻照劑量中的一種0kGy、lkGy、5kGy、8kGy或llkGy。這些劑量是基于先前對同種異體移植物組織上的相似劑量進行的評價而選定的。輻照后，在下文指示的時間分析之前將組織冷藏。已處理的樣品返回Mratatech時，發現一些儲存在營養凝膠上的組織脫離了其下面的支撐膜，導致組織的折疊和起皺。在輻照和未輻照組織中均觀察到此現象。隨后開發解決此問題的運送程序。參見下文實施例。無菌檢驗從9F1和2D2組織中獲取打孔活檢，該組織經受了劑量范圍O-IlkGy的 Y輻照。將來自輻照后儲存3天的組織的樣品接種至胰胨豆胨培養液或液體巰基乙酸鹽培養基。將培養物在美國藥典對無菌檢驗定義的條件下孵育14天。14天后，目測檢查培養物的微生物生長。未觀察到任何分析的組織有微生物生長，表明所述組織在處理、輻照和運輸全程中保持無菌。通過MTT生存力測定法檢驗生存力輻照處理后3天、7天或14天從對照或Y輻照9F1和2D2組織中獲取活檢，并通過MTT生存力測定法測定細胞生存力。簡而言之，MTT 底物3- ，5-二甲基噻唑基-2-基)-2，5-二苯基四唑鐵溴化物，通過活細胞中細胞脫氫酶轉化為MTT甲贈產物。然后將有色產物萃取入異丙醇，在550nm處讀數。在四個獨立的組織分批中測定生存力，代表性的結果顯示于圖1中。未輻照組織的生存力在儲存期間未顯著改變。用IkGy輻照處理的組織在輻照后3天具有殘留的酶活性，該殘留酶活性在輻照后7和14天繼續降低。然而，用5、8或IlkGy劑量處理的組織在所有時間點顯示出最小的殘留酶活性，且在14天儲存期的全過程中保持低酶活性。至輻照后14天，用IkGy輻照的組織的代謝活性降低到與較高輻照劑量所示同樣低的水平。通過角質形成細胞遷移測定法確定生存力從對照組織或輻照組織中建立活檢外植塊培養物以確定角質形成細胞是否已通過輻照處理而失活。將從輻照后3天的組織中獲取的打孔活檢轉移至生長培養基，培養48小時，并用蘇木精/伊紅和數字顯微鏡進行組織學染色。獲取圖像以評定組織構造，以及根據角質形成細胞從由圖2中示意圖的活檢穿孔創建的傷口邊緣遷移出而記為陽性或陰性。細胞遷移在未輻照9F1和2D2組織中為明顯的， 但不存在于所有經受、輻照的組織中。成纖維細胞生長暈測定輻照后7天從對照和輻照組織中獲取活檢，且用細菌膠原酶處理以釋放成纖維細胞。將釋放自這些組織的細胞轉移至培養皿，使其在培養基中生長六天，并通過亞甲藍染色來顯現。分別基于存在或不存在染色的藍色細胞，將成纖維細胞細胞生長暈記為陽性或陰性。分離自未輻照或輻照組織的成纖維細胞培養物的圖像顯示于圖3中。未接受輻照的對照組織中觀察到了細胞生長暈，但其不存在于來自輻照組織的標本中。上述研究確定了制備和處理組織全程中保持了產品無菌。用IkGy的輻照劑量處理皮膚等同物組織產生了使用兩個獨立的生存力測定為非活的組織。5kGy或更高的劑量產生了通過全部三種方法評定為非活的組織。實施例3γ輻照皮膚等同物組織的結構性質的評價冷藏3天后輻照組織的結構性質通過用蘇木精和伊紅組織學染色并通過光學顯微鏡術觀察來評價。組織學染色證實了輻照組織保留正常組織構成和總體形態。所有細胞層，包括真皮層、基底層和棘狀角質形成細胞層，以及角質層，在未輻照對照和輻照組織中為可識別的，但在較高的輻照劑量下有一些明顯的組織損傷，顯現為真皮和表皮區室之間的裂隙。因此，確定IkGy和5kGy劑量水平作為最有前景的水平，用于后續研究。實施例4γ輻照皮膚等同物組織的生化性質(包括體外抗微生物活性)評價.γ輻照直接和非直接地激發對蛋白的劑量依賴性損傷。直接損傷由電離引發，而非直接損傷涉及水分子的水解和大分子的氧化修飾或交聯。因此，組織蛋白在輻照時可表現出增強的降解和降低的溶解度。由于預期開發中的產品通過提供高水平的宿主防衛肽來起作用，所以有必要確定輻照后的蛋白可及性和生物活性。輻照組織的分析包括可溶性蛋白和總蛋白分析、免疫印跡分析以及抗微生物活性測定。可溶性蛋白和總蛋白分析從未輻照和輻照2D2和9F1皮膚組織中獲取打孔活檢并將其浸入0. 2mL無菌水中。將活檢樣品在37°C孵育72小時以提取蛋白，收集上清液，并通過BCA測定法定量總蛋白。如圖4所示，洗提入上清液中的總蛋白隨輻照劑量的增大而減少。這些結果與蛋白經由交聯(降低蛋白溶解度的修飾)的廣泛報道輻照介導損傷一致。然而，初步研究中使用的組織包裝在由不粘連紗布組成的較小水合的環境中，消除了這種輻照劑量依賴的蛋白可提取性的降低(參見實施例6)。肽分析蛋白可提取性可反映經處理組織的總體生化狀態；支持開發抗微生物傷口敷料更相關的參數為抗微生物肽的完整性和溶解度。為評價這些參數，對提取自輻照和未輻照2D2組織的蛋白進行免疫印跡分析。從2D2組織中獲取打孔活檢，并轉移至無血清生長培養基中另外48小時。收集來自雙份組織的條件培養基，通過SDS-PAGE將蛋白分開， 轉移至PVDF膜，并針對免疫印跡分析而使用標準方法處理。使用hCAP18-特異性抗體來檢測抗微生物肽，該抗體檢測完整的人抗微生物蛋白hCAP18及其生物活性蛋白水解片段 LL-37。在根據組織調節的培養基中易檢測到完整的hCAP18和LL-37兩者，不依賴于輻照劑量，且這些蛋白在SDS-PAGE上的遷移模式也不受用于這些研究中的輻照劑量影響。從未輻照對照組織中釋放的肽有輕微的增加。這些輕微的增加可能起因于活組織新合成并分泌肽，或者是這些組織中肽溶解度增大的結果。盡管有此觀察結果，組織蛋白酶抑制素抗微生物肽保持完整且可容易地從輻照組織中提取。抗微生物活性測定確認了從未輻照和輻照組織中釋放的抗微生物肽的完整性之后，我們評價了對照和輻照組織的抗微生物性質。簡而言之，從輻照或未輻照組織中獲取打孔活檢，并將其轉移至無血清培養基培養2、4或M小時以允許提取抗微生物肽。收集培養基并與接種物組合，該接種物為含1. OxlO3CFU肉葡萄球菌(S. carnosus)的細菌生長培養基。將此混合物在37°C以恒定振蕩孵育60min。然后，使用WASP2螺旋接種儀(Microbiology International, Frederick, MD)將樣品涂布至細菌學平板并在37°C孵育16小時。計菌落數，并確定活細菌密度(以CFU/mL表示)。將值歸一化于在不含組織提取物的無血清培養基存在下生長的細菌培養物密度。如圖5所示，從用IkGy輻照處理的2D2組織中提取的樣品表現出增強的抗微生物活性，這通過細菌密度在2和4小時條件作用期時相對于未輻照組織減小來指示。未在用5kGy劑量處理的組織中觀察到這種抗微生物活性的短暫增強，其在更長的組織條件作用時間下亦不明顯。IkGy輻照的9F1組織中觀察到相似的活性增強 (數據未顯示)。此改進的抗微生物活性令人驚奇，因為已知輻照組織可在較長時期內釋放較低量的總蛋白和組織蛋白酶抑制素抗微生物肽。然而，當上述研究使用孵育了至少48小時的組織時，只在提取自2或4小時的輻照組織的樣品中觀察到改進的抗微生物活性。總而言之，輻照皮膚等同物的生化分析顯示了可溶性蛋白的整體水平降低，但是抗微生物肽完整性大都得到了保持。顯示從IkGy輻照的皮膚等同物組織中提取的肽，相對于對照細菌培養物將細菌生長減少高達80%。這些結果表明了維持這些極限處理的工程皮膚組織生物活性的可行性。實施例5輻照皮膚等同物組織的儲存對儲存于營養凝膠的輻照9F1和2D2組織的短期儲存能力進行了分析。這些研究中，分析了處理后7天和37天的冷藏輻照組織，且評定或測定了組織構造和抗微生物肽活性。37天的冷藏儲存期間保持了輻照組織的整體組織構成。檢測的劑量水平下，冷藏組織維持了真皮和表皮區室兩者。表皮區室內，基底層和棘狀角質形成細胞層仍有區別，而角質層大都仍然不變。組織內最小的細胞損傷表現為在基底層和基底上層的角質形成細胞之間的細胞間隙，且組織的儲存導致真皮和表皮區室之間的局部分離。然而，這在所有檢測時期的組織中都觀察到了。抗微生物肽活性從輻照之后在冷藏溫度下儲存了 7天或37天的輻照或未輻照 9F1和2D2組織中獲取樣品。如上文進行抗微生物活性測定。確定了細菌密度(CFU/mL) 且將數據歸一化于在存在新鮮無血清生長培養基下生長的細菌培養物。9F1和2D2組織的這些研究結果分別顯示于圖6和7中。用IkGy輻照輻照且冷藏儲存7天的9F1組織，顯示細菌生長相對于對照細菌培養物減少86%。相比之下，未輻照9F1組織導致細菌生長減少 52%。同樣地，與未輻照2D2組織引起57%的減少相比，冷藏7天的IkGy輻照2D2組織導致了細菌生長減少72%。IkGy輻照9F1和2D2組織的抗微生物活性經過37天的冷藏儲存恢復到近于未輻照組織的抗微生物活性，但相對于對照培養物依然表現出抗微生物活性。 盡管所有以5kGy處理的組織在輻照后儲存7天時保留了可測量的抗微生物活性，但是此活性在長期儲存中降低。這些數據表明輻照組織可在多于一個月的冷藏儲存之后提供可檢測的抗微生物活性。實施例6包裝構型的影響觀察到上文實施例2中處理的組織，與下面的支撐膜分離，導致組織的折疊和起皺。為避免此現象，開發了一種包裝構型以防止組織移動。此改良的構型中，將組織從其內眼板中移出，轉移至無菌的不粘連紗布上，并密封入無菌塑料袋中。從所述塑料袋中移出后，組織未顯示明顯的起皺或折疊。別處已描述了 Y輻照對蛋白的作用，且這些作用大部分通過樣品內水分子水解產生的自由基和活性氧類別來介導。由于用于運輸工程組織產品的營養凝膠室的高水分含量，因此預料包裝在營養凝膠室或干的不粘連紗布上的輻照組織在輻照處理期間會表現出不同的生化性質。從未輻照和輻照2D2和9F1組織中獲取打孔活檢，將其浸沒于0. 2mL無菌水。將活檢在37°C孵育M小時，收集上清液，并通過BCA測定法定量洗提的蛋白。如圖 8所示，在包裝在營養凝膠室上的組織中，總水溶性蛋白隨輻照劑量的增大而減少，與上文所述研究一致。相比之下，將輻照組織包裝在不粘連紗布上使蛋白可及性恢復至近于對照水平的蛋白可及性。因此，輻照前將組織包裝在紗布上可通過提供更不允許蛋白交聯的環境來降低輻照組織中蛋白損傷的水平。實施例7工程皮膚等同物的冷凍干燥如實施例1所述制備工程皮膚等同物。完成時，將包含皮膚等同物的TRANSWELL內眼板無菌轉移入塑料TRANSWELL皿中，加蓋，并置于維持在20°C的VIRTIS Genesis冷凍干燥機(Gardiner，NY)的層架上。如下來冷凍組織通過在2100mT壓力下以-1. 33°C /分鐘的速率將溫度從20°C降至_20°C，以及在2IOOmT壓力下以-0. 67°C /分鐘的速率從_20°C 降至-60°C。應用真空以降低壓力至OmT，且以+0. 250C /分鐘將組織從_60°C加熱至20°C。通過將樣品保持在OmT 20°C至少16小時來完成干燥。實施例8工程皮膚等同物的真空干燥如實施例1所述制備工程皮膚等同物。將包含皮膚等同物的TRANSWELL內眼板無菌轉移入塑料TRANSWELL皿中，加蓋，并置于維持在25°C的VIRTIS Genesis冷凍干燥機小室的層架上。以八分鐘的間隔將小室壓力降至下列壓力900mT、830mT、760mT、690mT、 620mT、550mT、490mT、430mT、370mT、310mT、250mT、200mT、150mT、100mT、50mT、25mT。將樣品保持在25mT至少16小時以完成干燥。實施例9工程皮膚等同物的干質量制備工程皮膚等同物并在冷凍干燥之前和之后獲得濕組織質量。冷凍干燥之后獲得的組織質量范圍為原始濕組織質量的11. 7% -13. %。(表1)。表1.工程皮膚組織的干質量測定
權利要求
1.一種用作傷口敷料的器官型培養的皮膚等同物的保存方法，所述方法包括提供所述器官型培養的皮膚等同物和包裝；處理所述皮膚等同物以致使該皮膚等同物中的細胞非活；和包裝所述皮膚等同物以提供包裝的皮膚等同物。
2.權利要求1的方法，其中所述處理步驟包括輻照所述皮膚等同物以致使所述皮膚等同物無菌和非活。
3.權利要求2的方法，其中所述輻照用γ輻照進行。
4.權利要求1的方法，其中所述處理步驟包括在使得所述皮膚等同物中的細胞非活的條件下干燥所述皮膚等同物。
5.權利要求4的方法，其中所述干燥通過選自真空干燥和冷凍干燥的方法來進行。
6.權利要求1的方法，其中所述處理在包裝之前進行。
7.權利要求1的方法，其中所述處理在包裝之后進行。
8.權利要求1的方法，其中所述處理包括在使得組成所述皮膚等同物的細胞非活的條件下干燥所述皮膚等同物，以及在使得所述皮膚等同物無菌的條件下輻照所述皮膚等同物。
9.權利要求8的方法，其中所述干燥步驟在所述包裝之前進行，所述輻照步驟在所述包裝步驟之后進行。
10.權利要求1的方法，其中所述器官型培養的皮膚等同物包含NIKS細胞。
11.權利要求10的方法，其中所述NIKS細胞包含編碼抗微生物多肽的外源核酸序列。
12.權利要求11的方法，其中所述抗微生物多肽選自人β-防衛素1、人β -防衛素2、 人β-防衛素3和組織蛋白酶抑制素。
13.權利要求11的方法，其中以10-500ng抗微生物多肽/毫升表面提取液的量，提供所述抗微生物多肽。
14.權利要求4的方法，其中將所述皮膚等同物干燥至最終質量小于濕皮膚等同物的 50%。
15.權利要求4的方法，其中所述皮膚等同物再水化之后具有的初始DPM值為20-300， DPM變化值為5-400。
16.權利要求4的組合物，其中所述皮膚等同物再水化之后具有的抗張強度為 0. 1-5. OMPa0
17.權利要求1的方法，其中所述包裝可熱密封。
18.—種通過權利要求1的方法制備的包裝人皮膚等同物。
19.一種通過權利要求8的方法制備的經包裝的無菌人皮膚等同物。
20.一種組合物，所述組合物包含經分離的非活的體外人皮膚等同物。
21.權利要求20的組合物，其中所述皮膚等同物為無菌的。
22.權利要求21的組合物，其中所述無菌皮膚等同物為經輻照的。
23.權利要求20的組合物，其中所述皮膚等同物為經干燥的。
24.權利要求20的組合物，其中皮膚等同物具有的質量小于濕皮膚等同物質量的 50%。
25.權利要求20的組合物，其中所述皮膚等同物包含NIKS細胞。
26.權利要求25的組合物，其中所述NIKS細胞包含編碼外源多肽的外源核酸序列。
27.權利要求沈的組合物，其中所述外源多肽為抗微生物多肽。
28.權利要求27的組合物，其中所述抗微生物多肽選自人β-防衛素1、人β-防衛素 2、人β -防衛素3、組織蛋白酶抑制素及其組合。
29.權利要求觀的組合物，其中以10-500ng抗微生物多肽/毫升表面提取液的量，提供所述抗微生物多肽。
30.權利要求對的組合物，其中所述皮膚等同物再水化后具有的初始DPM值為 20-300，DPM 變化值為 5-400。
31.權利要求對的組合物，其中所述皮膚等同物再水化后具有的抗張強度為 0. 1-5. OMPa0
32.權利要求20的組合物，其中所述組合物為經包裝的。
33.一種用于治療傷口的方法，所述方法包括 提供權利要求20的組合物；和在使得所述皮膚等同物接觸所述傷口的條件下施用所述皮膚等同物至傷口。
34.權利要求33的方法，其中將所述皮膚等同物暫時施用至所述傷口。
35.一種試劑盒，所述試劑盒包含含有權利要求20的皮膚等同物的包裝。
36.權利要求35的試劑盒，其中所述皮膚等同物具有的保存期限為約一個月至約六個月。
37.一種組合物，所述組合物包含非活的、經分離的、體外器官型培養的皮膚等同物，該皮膚等同物具有的質量小于濕皮膚等同物質量的50%。
38.權利要求37的組合物，其中所述皮膚等同物包含至少一種由整合至所述皮膚等同物的細胞表達的外源抗微生物多肽。
39.權利要求20所述的組合物在治療受試者中的用途。
40.權利要求20所述的組合物在治療受試者的傷口中的用途。
全文摘要
本發明主要涉及制備、儲存、運送和使用通過器官型培養制得的皮膚等同物的體系和方法。具體而言，本發明涉及在降低的溫度(優選低于環境溫度2-8攝氏度)下制備、運輸、儲存和使用通過器官型培養制得的皮膚等同物的體系和方法。所述方法包括無菌包裝移植物，使得維持所述包裝的無菌度和完整性直至用于移植目的之時。
文檔編號A61N5/10GK102271634SQ200980154244
公開日2011年12月7日 申請日期2009年11月4日 優先權日2008年11月4日
發明者A·R·科默, B·L·艾倫-霍夫曼, B·施泰格利茨 申請人:斯特拉塔特克公司