免疫原性組合物的制作方法

專利名稱：免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含綴合到載體蛋白上的細菌莢膜糖，尤其是那些腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)糖。其還涉及包含這樣的糖綴合物的疫苗和疫苗試劑盒、制備所述免疫原性組合物和疫苗的方法以及本發明疫苗和免疫原性組合物在治療中的用途。其還涉及使用糖綴合物來抗感染的免疫方法以及糖綴合物在制備藥物方面的用途。腦膜炎奈瑟氏球菌是革蘭氏陰性人感染性病原體，其能夠引起細菌性腦膜炎。以有機體的莢膜多糖為基礎，腦膜炎奈瑟氏球菌的十二個血清群已經得到了鑒定(A，B，C，H，I，K，L，29E，W135，X，Y和Z)。血清群A(MenA)是導致撒哈拉以南非洲地區的流行病的最常見原因。血清群B和C是導致發展中國家的大多數情況的原因，剩余的情況是由W135和Y引起的)。包含綴合到載體蛋白上的腦膜炎奈瑟氏球菌糖的免疫原性組合物是本領域已知的；載體蛋白具有將T細胞非依賴型多糖抗原轉化為能夠引發免疫記憶應答的T細胞依賴型抗原的已知作用。例如W002/58737公開了一種含有純化的莢膜多糖的疫苗，所述純化的莢膜多糖來自于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y并且是綴合到載體蛋白上的。然而，該申請教導，所有的多糖必須基本上以同樣的方式(通過相同的連接基連接到相同的蛋白載體上)進行綴合。仍存在對開發改善的抗奈瑟氏腦膜炎綴合疫苗的需要。本發明涉及提供一種腦膜炎球菌多糖綴合疫苗，其中可以設計每種多糖的綴合方式(而不是統一的)以獲得有效的組合疫苗。特別地，使用連接 分子將某些腦膜炎球菌綴合到它們的蛋白載體上而同時其它的腦膜炎球菌進行直接綴合是有利的。以這種方式，可以將那些是次好的免疫原的多糖通過連接物提供給免疫系統，而那些是非常好的免疫原的多糖則可以被直接地綴合以使得它們不會控制對組合物的免疫應答。因此，本發明的一個方面提供了一種包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA、MenC>MenY和MenW組成的第一組,而一種或多種不同的糖選自由直接綴合到載體蛋白上的MenA> MenC、MenY 和 MenW 組成的第二組。例如，在MenAC疫苗中，MenA可以通過連接物綴合而MenC可以直接地綴合。在MenCY疫苗中，MenC可以通過連接物綴合而MenY可以直接地綴合。在MenACWY疫苗中，MenA可以通過連接物綴合而MenCWY可以直接地綴合，或者MenAC可以通過連接物綴合而MenWY可以直接地綴合。對于含有綴合到相同載體上的多種糖的組合疫苗來說，一個值得考慮的問題是載體的免疫抑制作用:可能使用了太多的載體從而可能抑制了免疫應答。用統一的方法綴合載體將向免疫系統呈現相似的B-和T-細胞抗原表位的混合。然而，如果一種糖和另一種糖的綴合發生在載體蛋白內的不同化學基團上，則蛋白載體在怎樣將它們自身呈現給免疫系統方面可能會有某種程度的不同。因此，在本發 明單獨的實施方案中提供了一種包含至少2種不同糖的免疫原性組合物，所述糖是分別綴合到同類載體蛋白(例如破傷風類毒素)上的，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的第一類化學基團綴合到載體蛋白上的，一種或多種糖是通過蛋白載體上的第二類(不同的)化學基團綴合到載體蛋白上的。第一和第二類化學基團可以存在于蛋白載體中在蛋白載體的互相排斥的第一和第二系列氨基酸(例如一個系列中的某些天冬氨酸/谷胺酸殘基和第二系列中的某些賴氨酸殘基)上。例如可以將一種糖綴合到載體上的羧基上，而將另一種糖綴合到氨基上。這樣的綴合可以包括每種不同綴合物的在單獨的B-和/或T-細胞抗原表位上的綴合。例如在MenAC疫苗中，可以將MenA連接到載體蛋白上的第一類化學基團(例如羧基)上，而將MenC連接到第二類(例如氨基)上。在MenCY疫苗中，可以將MenC連接到載體蛋白上的第一類化學基團(例如羧基)上，而將MenY連接到第二類(例如氨基)上。在MenACWY疫苗中，可以將MenAC連接到載體蛋白上的第一類化學基團(例如羧基)上，而將MenWY連接到第二類(例如氨基)上，或者可以將MenA連接到載體蛋白上的第一類化學基團(例如羧基)上，而將MenCWY連接到第二類(例如氨基)上。根據本發明更進一步的方面，其提供了一種使人宿主對由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病具有免疫性的方法，其包括向宿主給藥以免疫保護劑量的本發明免疫原性組合物或疫苗。根據本發明更進一步的方面，其提供了一種用于治療或預防由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的本發明免疫原性組合物。根據本發明更進一步的方面，其提供了本發明免疫原性組合物或疫苗在制備治療或預防由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的藥物方面的用途。附圖描述

圖1-A-條形圖顯示了在抗-MenY ELISA中的GMC應答。ENYITO12是由天然MenY多糖制備的MenY-TT綴合物。ENYTTO14是由微流化MenY多糖制備的MenY-TT綴合物，其中所述MenY多糖經歷了 40個周期的微流化作用。ENYTT015bis是由微流化MenY多糖制備的MenY-TT綴合物，其中所述MenY多糖經歷了 20個周期的微流化作用。-B-條形圖顯示了在抗-MenY SBA試驗中的GMT應答。ENYITO12是由天然MenY多糖制備的MenY-TT綴合物。ENYTTO14是由微流化MenY多糖制備的MenY-TT綴合物，其中所述MenY多糖經歷了 40個周期的微流化作用。ENYTT015 bis是由微流化MenY多糖制備的MenY-TT綴合物，其中所述MenY多糖經歷了 20個周期的微流化作用。詳細描述本發明的一個方面提供了一種包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種莢膜糖選自由通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第一組,一種或多種不同的糖選自由直接綴合到載體蛋白上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第二組。更具體地說是，第一組可以由MenA和MenC,第二組由MenC、MenY和MenW組成。本發明的一個具體實施方案是下述的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含:通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA莢膜糖和直接綴合到載體蛋白上的MenC莢膜糖；通過連接物綴合到載體蛋白上的MenC莢膜糖和直接綴合到載體蛋白上的MenY莢膜糖；通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA和MenC莢膜糖和直接綴合到載體蛋白上的MenY和MenW莢膜糖；通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA莢膜糖和直接綴合到載體蛋白上的MenC、MenY和MenW莢膜糖。在所有這些實施方案中還可以包括Hib綴合物，它是直接或通過連接物連接到載體蛋白(參見上文或下文中的載體列表，例如TT)上的。在整個本說明書中，術語“糖”可以表示多糖或低聚糖，或者兩者都包含。多糖是從細菌中分離出來的，或者是從細菌中分離出來并通過已知方法(參見例如EP 497524和EP497525)以及任選地通過微流化作用將尺寸調整到某一程度的。可以調整多糖的尺寸從而減少多糖樣品的粘度和/或改善綴合產品的過濾性。低聚糖的重復單元數少(一般地具有5-30個重復單元)，其一般是水解的多糖。各腦膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)莢膜糖可以綴合到獨立地選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上。可用于本發明綴合物的蛋白載體的更加全面的列表呈現于下文中。雖然可以將一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)莢膜糖綴合到與其它糖不同的載體蛋白上，但在一個實施方案中它們是全部綴合到相同載體蛋白上的。例如可以將它們全部綴合到相同的選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上。由于CRM197與DT的區別僅在于一個氨基酸，因此在本文的上下文中認為它們是相同的載體蛋白。在一個實施方案中，將存在的所有腦膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)莢膜糖都綴合到TT上。如果組合物中2種或2種以上糖的蛋白載體是相同的，則可以將所述糖綴合到蛋白載體的相同分子上(有2種以上的不同的糖綴合在載體分子上)[參見例如W004/083251 ;例如可以向單個的載體蛋白上綴合MenA和MenC ；MenA和MenW ；MenA和MenY ；MenC 和 MenW ；MenC 和 MenY ；Menff 和 MenY ;MenA、MenC 和 MenW ;MenA、MenC 和 MenY ；MenA、MenW 和 MenY ;MenC、MenW 和 MenY ;MenA、MenC、MenW 和 MenY ;Hib 和 MenA ;Hib 和 MenC ；Hib和MenW ;或Hib和MenY]。或者可以將各糖分別綴合到蛋白載體的不同分子上(蛋白載體的每種分子僅有一種糖綴合在其上面)。本申請第一方面的免疫原性組合物還可以具有本發明第二方面的任意或全部附加特征，反之亦然。本發明的第二方面提供了一種包含至少2種分別綴合在同類載體蛋白上的不同糖綴合物的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的第一類化學基團綴合到載體蛋白上的，而一種或多種糖是通過蛋白載體上的第二(不同的)類化學基團綴合到載體蛋白上的。在一個實施方案中所述的2種綴合物包含連接在相同載體上的相同的糖，但所述糖是通過不同的綴合化學連接的。在另一個實施方案中所述的2種不同的糖是綴合到蛋白載體的不同基團上的。

“分別綴合到同類載體蛋白上”的意思是指將糖各自綴合到相同的載體上(例如，將MenA通過破傷風類毒素上的氨基綴合到破傷風類毒素上,將MenC通過破傷風類毒素不同分子上的羧酸基團綴合到破傷風類毒素上。)
莢膜糖可以是綴合到相同載體蛋白上的，所述載體蛋白獨立地選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。下文中給出了可用在本發明綴合物中的蛋白載體的更全面的列表。由于CRM197和DT的區別僅在于一個氨基酸，所以在本文的上下文中認為它們是相同的載體蛋白。在一個實施方案中，存在的所有夾膜糖都是綴合到TT上的。在一個實施方案中，蛋白載體上的第一和第二類化學基團是存在于載體蛋白上單獨的B-和/或T-細胞抗原表位上的。也就是說，它們彼此存在于不同系列的B-和/或T-細胞抗原表位上。可以使用已知方法例如以下兩種方法中的任一種或兩種來預測用作載體的B-細胞抗原表位:2D-結構預測和/或抗原指數預測。2D-結構預測可以使用PSIPRED程序進行(來自 David Jones,Brunei Bioinformatics Group,Dept.Biological Sciences,Brunei University, Uxbridge UB83PH, UK) 抗原指數可以以 Jameson 和 Wolf (CABIOS 4:181-186[1988])所描述的方法為基礎進行計算。該程序中所使用的參數是抗原指數和抗原肽的最小長度。在該程序中可以使用對于最少5個連續氨基酸的0.9的抗原指數作為初始值。T-輔助細胞抗原表位是結合在HLA類II型分子上的肽，并且其能夠被T-輔助細胞識別。對有效T-輔助細胞抗原表位的預測可以基于已知技術進行，所述已知技術例如Sturniolo 等人描述的 TEPITOPE 法。(Nature Biotech.17:555-561 [1999])。所述糖可以選自:腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖(MenA)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖(MenY)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W莢膜糖(MenW)、流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae) b型莢膜糖(Hib)、B群鏈球菌(Streptococcus) I群莢膜糖、B群鏈球菌II群莢膜糖、B群鏈球菌III群莢膜糖、B群鏈球菌IV群莢膜糖、B群鏈球菌V群莢膜糖、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 5型莢膜糖、金黃色葡萄球菌8型莢膜糖、來自傷寒殺門氏菌(Salmonella typhi)的Vi糖、腦膜炎奈瑟氏球菌LPS (例如L3和/或L2)、卡他莫拉菌(M.catarrhal is) LPS和來自任意的莢膜肺炎球菌糖例如來自血清型:1、2、3、4、5、6A、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F*33F。在一個實施方案中本發明的免疫原性組合物是由來自同屬細菌(例如，奈瑟氏球菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬或嗜血桿菌屬)的兩種或兩種以上的不同的糖組成的，或者其包含來自同屬細菌的兩種或兩種以上的不同的糖。存在于蛋白載體上的第一和第二化學基團是彼此不同的，并且理想地是可以易于用于綴合目的的天然化學基團。它們可以獨立地選自:羧基、氨基、巰基、羥基、咪唑基、胍基和吲哚基。在一個實施方案中，第一化學基團是羧基，第二化學基團是氨基，或者相反。對于這些基團在下文中有更加詳細的解釋。在一個具體的實施方案中，免疫原性組合物包含至少2種不同的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其中一種或多種選自由MenA和MenC組成的第一組，其中所述MenA和MenC是通過蛋白載體上的第一類化學基團(例如羧基)綴合到載體蛋白上的，一種或多種不同的糖選自由MenC、MenY和MenW組成的第二組,其中所述MenC、MenY和MenW是通過蛋白載體上的第二類化學基團(例如氨基)綴合到載體蛋白上的。在進一步的實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含通過第一類化學基團(例如羧基)綴合的MenA和通過第二類化學基團(例如氨基)綴合的MenC。

在另一個實施方案中，免疫原性組合物包含通過第一類化學基團(例如羧基)綴合的MenC和通過第二類化學基團(例如氨基)綴合的MenY。
在另一個實施方案中，免疫原性組合物包含通過第一類化學基團(例如羧基)綴合的MenA和通過第二類化學基團(例如氨基)綴合的MenC、MenY和MenW。在另一個實施方案中，免疫原性組合物包含通過第一類化學基團(例如羧基)綴合的MenA和MenC，和通過第二類化學基團(例如氨基)綴合的MenY和MenW。在任意以上的實施方案中，還可以存在Hib，其是綴合到同類蛋白載體上的。可以將Hib通過第一或第二類化學基團綴合到載體上。在一個實施方案中其是通過羧基綴合的。本發明各方面的概述包含于本發明藥物(免疫)組合物中的本發明的糖(特別是腦膜炎奈瑟氏球菌糖和/或Hib莢膜糖)是綴合到載體蛋白上的，所述載體蛋白例如破傷風類毒素(TT)、破傷風類毒素片段C、破傷風類毒素的無毒突變株[注意，為了本發明的目的，所有這樣的TT變形株均被認為是同一種載體蛋白]、白喉類毒素(DT)、CRM197、白喉類毒素的其它無毒突變株[例如 RM176、CRM 197、CRM 228、CRM 45 (Uchida 等人，J.Biol.Chem.218 ;3838_3844，1973) ；CRM 9,CRM 45、CRM102、CRM 103 和 CRM107 以及 Nicholls 和 Youle 在 GeneticallyEngineered Toxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc.1992 中描述的其它突變株；Glu-148至丨J Asp的缺失或突變、Gln或Ser和/或Ala 158到Gly的突變以及US 4709017或US4950740中公開的其它突變；殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534中的至少一種或多種的突變以及US 5917017或US 6455673中公開的其它突變；或US 5843711中公開的片段](注意，為了本發明的目的，所有這樣的DT變形株均被認為是同一類載體蛋白)、肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(Kuo等人(1995) Infect Immun 63 ;2706_13)、OMPC (腦膜炎球菌的外膜蛋白-通常提取自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B-EP0372501)、合成肽(EP0378881，EP0427347)、熱休克蛋白(W0 93/17712, WO 94/03208)、百日咳蛋白(W0 98/58668，EP0471177)、細胞因子、淋巴因子、生長因子或激素(W0 91/01146)、包含多個人類⑶4+T細胞抗原表位的人工蛋白，其中所述人工蛋白來自于由抗原衍生的多種病原體(Falugi等人(2001)Eur J Immunol31;3816_3824)例如 N19 蛋白(Baraldoi 等人(2004)InfectImmun72 ；4884-7)肺炎球菌表面蛋白 PspA(W) 02/091998)、鐵吸收蛋白(W0 01/72337)、難辨梭狀芽孢桿菌毒素A或B(W0 00/61761)或蛋白D(EP 594610和WO 00/56360)。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物在其所含有的至少兩種、三種、四種或每種糖(例如腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖和/或Hib)中(獨立地)使用了同一類型的載體蛋白。在一個含有Hib和腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的實施方案中，可以將Hib綴合到與至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖所綴合的載體蛋白相同類型的載體蛋白上。例如，將2、3、或4種腦膜炎奈瑟氏球菌糖(MenA、C、Y、W)獨立地綴合到破傷風類毒素上以制備2、3或4綴合物，并且任選地將Hib也綴合到TT上。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含綴合到選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上的腦膜炎奈瑟氏球菌糖。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含綴合到選自TT 、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上的Hib糖。本發明的免疫原性組合物任選地包含至少一種腦膜炎雙球菌糖(例如，MenA ；MenC ；Menff ；MenY ；MenA 和 MenC ；MenA 和 MenW ；MenA 和 MenY ；MenC 和 MenW ；MenC 和 MenY ；Menff 和 MenY ;MenA、MenC 和 MenW ;MenA、MenC 和 MenY ;MenA、Menff 和 MenY ;MenC、Menff 和MenY或MenA、MenC、MenW和MenY)綴合物,所述綴合物的Men糖與載體蛋白的比例在1: 5至 5: I, I: 2 至5: I, I: 0.5至 1: 2.5或 1: 1.25 至 1: 2.5(w/w)之間。本發明免疫原性組合物任選地包含Hib糖綴合物，所述綴合物的Hib與載體蛋白的比例在1:5至5: 1;1:2至2:1 ；1: I至1:4;1:2至1: 3.5之間；或者在I: 2.5或1: 3左右，或剛好為1: 2.5或1: 3(w/w)。綴合物中糖與載體蛋白的比例((w/w)可以用滅菌后的綴合物來確定。蛋白的量是使用 Lowry 試驗(例如 Lowry 等人(1951) J.Biol.Chem.193,265-275 或者 Peterson等人 Analytical BiochemistrylOO, 201-220 (1979))確定的，糖的量對于 MenA 是使用ICP-OES(感應耦合等離子體-發射光譜)確定的，對于MenC是使用DMAP試驗確定的，對于 MenW 和 MenY 是使用苯二酌■試驗(Resorcinol assay) (Monsigny 等人(1988) Anal.Biochem.175,525-530)確定的。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物和/或Hib糖綴合物，其中所述腦膜炎奈瑟氏球菌糖和/或Hib糖是通過連接物，例如雙官能連接物，綴合到載體蛋白上的。連接物任選地是異雙官能的或同雙官能的，其具有例如反應性氨基基團和反應性羧酸基團、2個反應性氨基基團或者兩個反應性羧酸基團。連接物具有例如4到20，4到12，5到10個碳原子。可能的連接物是ADH。其它連接物包括B-丙酸胺基(W0 00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever 等人(1979)Med.Microbiol.1mmunol.165 ；171-288)、鹵代烷基鹵化物(US4057685)、糖苷鍵(US4673574，US4808700)、己二胺和 6-氨己酸(US4459286)存在于本發明免疫原性組合物中的糖綴合物可以通過任何已知的偶聯技術制備。綴合方法可以借助用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)使糖活化以形成氰酸酯。這樣，活化的糖就可以直接地或通過間隔(連接)基團被偶合到載體蛋白的氨基上。例如，間隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化糖，所述硫醇化糖能夠通過硫醚鍵偶合到載體上，所述硫醚鍵是在與馬來 酰亞胺-活化載體蛋白(例如使用GMBS)或鹵代乙酰化載體蛋白(例如使用碘代乙酰亞胺或溴 乙酸N-琥珀酰亞胺酯)反應后獲得的。任選地，將氰酸酯(任選地是通過⑶PA化學制得的)與己二胺或ADH偶合，并且將氨基-衍生化的糖用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學通過蛋白載體上的羧基綴合到載體蛋白上。這樣的綴合物描述于 PCT 公開申請 WO 93/15760Uniformed Services University 和 WO 96/08348 和 WO96/29094 中。其它合適的技術使用了碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多描述于WO 98/42721中。綴合可以使用羰基連接物，其可以通過使糖的游離羥基基團與CDI反應(Bethell等人J.Biol.Chem.1979,254 ；2572-4，Hearn等人J.Chromatogr.1981.218 ;509_18)后接著與蛋白反應以形成氨基甲酸酯連接而形成。其可以包括將異頭端基還原為伯羥基；任選地進行伯羥基基團的保護/脫保護反應，所述反應為使伯羥基與CDI反應以形成氨基甲酸CDI酯中間體以及使氨基甲酸CDI酯中間體與蛋白上的氨基偶合。綴合物也可以如US 43651了0 (Jennings)和 US 站73574 (Anderson)中所描述的那樣通過直接還原氨化的方法來制備。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508 中。
進一步的方法包括將溴化氰(或CDAP)活化的糖通過碳二亞胺縮合作用(ChuC.等人Infect.1mmunity, 1983 245 256),例如使用EDAC,偶合到蛋白載體上,其中所述糖是用己二酸二酰肼(ADH)衍生化的。在一個實施方案中，將糖上的羥基(任選地為活化的羥基，例如用氰酸酯活化的羥基)直接地或間接地(通過連接物)連接到蛋白上的氨基或羧基上。當存在連接物時，將糖上的羥基任選地連接到連接物上的氨基上，例如通過使用CDAP綴合。可以將連接物(例如ADH)中的其它氨基基團綴合到蛋白上的羧酸基團上，例如通過使用碳二亞胺化學，例如通過使用EDAC。在一個實施方案中，在將連接物綴合到載體蛋白上之前，先將Hib或腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖(或通常所說的糖)綴合到第一連接物上。或者在綴合到糖上之前，可以先將連接物綴合到載體上。通常，蛋白載體上可以用于偶合/綴合的化學基團的類型如下:A)羧基(例如通過天冬氨酸或谷氨酸)。在一個實施方案中將該基團直接連接到糖上的氨基基團上，或者用碳二亞氨化學例如用EDAC連接到連接物上的氨基基團上。B)氨基(例如通過賴氨酸)。在一個實施方案中將該基團直接連接到糖上的羧基基團上，或者用碳二亞氨化學例如用EDAC連接到連接物上的羧基基團上。在一個實施方案中將該基團直接連接到糖上用CDAP或CNBr活化的羥基上，或者連接到連接物上的上述基團上；連接到具有醛基的糖或連接物上；連接到具有琥珀酰亞胺酯基的糖或連接物上。C)巰基(例如通過半胱氨酸)。在一個實施方案中將該基團連接到溴或氯乙酰化的糖上，或者用馬來酰亞胺化學連接到連接物上。在一個實施方案中該基團是用雙二重氮聯苯胺(bis diazobenzidine)活化/修飾的。D)羥基(例如通過酪氨酸)。在一個實施方案中該基團是用雙二重氮聯苯胺活化/改性的。E)咪唑基(例如通過組氨酸)。在一個實施方案中該基團是用雙二重氮聯苯胺活化/改性的。F)胍基(例如通過精氨酸)。G)吲哚基(例如通過色氨酸)。在糖上，能夠用于偶合的通常是以下基團:0H、COOH或順2。醛基能夠在本領域已知的不同處理后產生，所述處理例如用高碘酸鹽、酸解、過氧化氫等。直接偶合法:糖-OH+CNBr 或 CDAP----->氰酸酯 +NH2_Prot—— >綴合物糖-醛+NH2_Prot> 西佛堿 +NaCNBH3-----> 綴合物糖-COOH+ME-Prot+EDAC-----> 綴合物糖-ME+COOH-Prot+EDAC-----> 綴合物通過間隔物(連接物)的間接偶合法:糖-OH+ CNBr 或 CDAP-----> 氰酸酯 +NH2----NH2----->
糖——NH2+C00H-Prot+EDAC------> 綴合物糖-OH+CNBr或 CDAP—— >氰酸酯 +NH2-----SH----->糖-----SH+SH-Prot (具
有暴露的半胱氨酸的天然 蛋白，或是通過例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的)——>糖-S-S-Prot
糖-OH+CNBr或CDAP----->氰酸酯+NH2——SH----->糖---SH+馬來酰亞
胺-Prot (氨基的改性物)------> 綴合物糖-C00H+EDAC+NH2——NH2----->糖——NH2+EDAC+C00H-Prot----->綴合物糖-C00H+EDAC+NH2——SH----->糖-----SH+SH-Prot (具有暴露的半胱氨酸的
天然蛋白，或是通過例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的)----->糖-S-S-Prot 糖-C00H+EDAC+NH2——SH----->糖——SH+馬來酰亞胺-Prot (氨基的改性
物)------> 綴合物糖-醛+NH2——NH2----->糖——NH2+EDAC+C00H-Prot-----> 綴合物注意:除了以上的EDAC，還可以使用任何合適的碳二亞胺。總之，通常可以用于與糖偶合的蛋白載體化學基團的類型是氨基(例如賴氨酸殘基上的)、C00H基團(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基上的)和SH基團(如果能夠獲得的話)(例如半胱氨酸殘基上的)。在一個實施方案中，將Hib糖，當存在時，用CNBr、或CDAP、或CDAP與碳二亞胺化學Hf^nEDAC)的結合、或CNBr與碳二亞胺化學Hf^BEDAC)的結合而綴合到載體蛋白上。任選地Hib是用CNB r和碳二亞胺化學綴合的，其中所述碳二亞胺化學任選地為EDAC。例如，用CNBr連接糖和連接物，接著用碳二亞胺化學連接連接物和蛋白載體。在一個實施方案中，至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖(或通常所說的糖)是直接綴合到載體蛋白上的；任選地將MenW和/或MenY和/或MenC糖直接綴合到載體蛋白上。例如將 MenW ；MenY ；MenC ；Menff 和 MenY ；Menff 和 MenC ；MenY 和 MenC ;或 MenW、MenY 和MenC直接連接到載體蛋白上。任選地，腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖中的至少一種是通過CDAP直接綴合的。例如將 MenW ；MenY ；MenC ；Menff 和 MenY ；Menff 和 MenC ；MenY 和 MenC ;或 MenW、MenY和MenC通過CDAP直接連接到載體蛋白上(參見WO 95/08348和W096/29094)。在一個實施方案中，將所有的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均綴合到破傷風類毒素上。在一個實施方案中，MenW和/或Y糖與載體蛋白的比例是1: 1.05到1: 2 (w/w)，和/或MenC糖與載體蛋白的比例是1: 0.5到1: 4或1: 0.5到1: 1.5(w/w)，尤其是當這些糖是直接連接到所述蛋白上的時，其中所述連接任選地使用了 CDAP。在一個實施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖(或通常所說的糖)中的至少一種是通過連接物，例如雙官能連接物，綴合到載體蛋白上的。所述連接物任選地是異雙官能的或是同雙官能的，其具有例如反應性氨基基團和反應性羧酸基團、2個反應性氨基基團或者2個反應性羧酸基團。連接物具有例如4到20，4到12，5到10個碳原子。可能的連接物是ADH。在一個實施方案中，MenA ;MenC ;或MenA和MenC是通過連接物綴合到載體蛋白(例如破傷風類毒素)上的。在一個實施方案中，至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是通過連接物用CDAP和EDAC綴合到載體蛋白上的。例如，如上所述地將MenA ；MenC ;或MenA和MenC通過連接物(例如那些在其端基上具有兩個肼基的連接物如ADH)用CDAP和EDAC綴合到蛋白上。例如，用CDAP將糖綴合到連接物上，用EDAC將連接物綴合到蛋白上。任選地，對于MenA ；MenC ；或MenA和MenC來說，通過連接物的綴合導致糖與比載體蛋白的比例在1: 0.5到1: 6;I: I到1: 5或1: 2到1: 4之間。
在一個實施方案中，MenA莢膜糖，當存在時其至少是部分0-乙酰化的，從而使得至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的重復單元在至少一個位置上是0-乙酰化的。0-乙酰化例如出現在至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的重復單元的至少
0-3位置上。在一個實施方案中，MenC莢膜糖，當存在時其至少是部分0-乙酰化的，從而使得至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 98% 的(a 2-> 9)-連接 NeuNAc 重復單元在至少一或兩個位置上是0-乙酰化的。0-乙酰化例如出現在至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復單元的0_7和/或0_8位置上。在一個實施方案中，Menff莢膜糖，當存在時其至少是部分0_乙酰化的，從而使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復單元在至少一或兩個位置上是0-乙酰化的。0-乙酰化例如出現在至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復單元的0-7和/或0-9位置上。在一個實施方案中，MenY莢膜糖，當存在時其至少是部分0-乙酰化的，從而使得至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復單元在至少一或兩個位置上是0-乙酰化的。0-乙酰化出現在至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復單元的7和/或9位上。0-乙酰化的百分比是指含有0-乙酰化基團的重復單元的百分比。可以在綴合前和/或綴合后在糖中對其進行測量。在本發明的一個實施方案中，免疫原性組合物中所存在的糖或者所存在的各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是綴合到TT上的。在進一步的實施方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是分別綴合到不同的載體蛋白上的。在進一步的實施方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物的糖:載體比是1: 5-5:1或1: 1-1: 4(w/w)0在進一步的實施方案中，至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物是直接綴合到載體蛋白上的。在進一步的實施方案中，Menff和/或MenY、Menff和/或MenC、MenY和/或MenC、或者MenW和MenC和MenY是直接綴合到載體蛋白上的。在進一步的實施方案中，至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物是通過CDAP化學直接綴合的。在進一步的實施方案中，Menff和/或Y糖與載體蛋白的比例在1: 0.5到1: 2 (w/w)之間。在進一步的實施方案中,MenC糖與載體蛋白的比例在1: 0.5到1: 2 (w/w)之間。在進一步的實施方案中，至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是通過連接物(其可以是雙官能的，例如具有兩個反應性氨基(例如ADH)或兩個反應性羧基或者一端具有反應性氨基而另一端具有反應性羧基)綴合到載體蛋白上的。連接物能夠具有4到12個碳原子。在進一步的實施方案中，所述的或每種通過連接物綴合的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖都是用CDAP化學綴合到連接物上的。在進一步的實施方案中，載體蛋白是使用碳二亞胺化學例如使用EDAC綴合到連接物上的。在進一步的實施方案中，所述的或每個腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖都是在將載體蛋白綴合到連接物上之前綴合到連接物上的。在進一步的實施方案中，MenA是通過連接物綴合到載體蛋白上的(MenA糖與載體蛋白的比例可以在1: 2到1: 5(w/w)之間)。在進一步的實施方案中，MenC是通過連接物綴合到載體蛋白上的(MenC糖與載體蛋白的比例可以在1: 2 到 1: 5 (w/w)之間)。

本發明人還注意到本領域的焦點曾經是使用低聚糖以便于產生綴合物。本發明人發現通過使用天然的或稍微調整過尺寸的多糖綴合物可以獲得以下優點中的一種或多種:I)具有高免疫原性的綴合物，并且所述綴合物是可通過0.2微米過濾器過濾的；2)免疫記憶可以得到提高(如實施例三所示)；3)能夠改變綴合物中多糖與蛋白的比例從而可以增加綴合物中多糖與蛋白的比例(w/w)(這能夠導致載體抑制作用的減少)；4)通過使用較大的多糖進行綴合可以使易于水解的免疫原性綴合物(例如MenA綴合物)得到穩定化。使用較大的多糖能夠導致與綴合物載體進行更多的交聯并且可以減少游離糖從綴合物上的脫離。現有技術中所描述的綴合疫苗傾向于在綴合之前將多糖解聚以改善綴合作用。本發明人發現，保留了較大尺寸的糖的腦膜炎球菌(或糖)綴合疫苗能夠提供良好的對腦膜炎球菌疾病的免疫應答。因此本發明的免疫原性組合物可以包含一種或多種糖綴合物，其中各糖在綴合前的平均尺寸大于50kDa、75kDa、IOOkDa, IIOkDa, 120kDa或130kDa。在一個實施方案中，綴合后的綴合物能夠容易地過濾通過0.2微米的過濾器使得與過濾前的樣品相比，過濾后能夠獲得大于50、60、70、80、90或95%的收率。特別是，本發明的免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或四種，其中至少一種、兩種、三種或四種或者每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖的平均尺寸(重均分子量；Mw)在50kDa、60kDa、75kDa、IOOkDaU 10kDa、120kDa 或 130kDa 以上。免疫原性組合物可以包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或四種，其中至少一種、兩種、三種或四種或者每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是天然糖，或者是相對于天然多糖重均分子量用直到X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9或XlO的因子調整過尺寸的。為了本發明的目的，“天然多糖”是指已經經歷過以減小糖的尺寸為目的的方法的糖。在通常的純化過程中，多糖的尺寸會稍微地減小。這樣的糖仍然是天然的。只有當多糖已經用調整尺寸的技術調整過尺寸后才認為所述多糖不再是天然的。

為了本發明的目的，“用直到X2的因子調整尺寸”的意思是指用下述方法處理過的糖，所述方法試圖減小糖的尺寸但卻將其尺寸保持在天然多糖尺寸的一半以上。X3、X4等也是以同樣的方式解釋的，即，糖是用下述方法處理過的，所述方法試圖減小多糖的尺寸但卻將其尺寸保持在天然多糖尺寸的三分之一、四分之一以上。在本發明的一個方面，免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或四種，其中至少一種、兩種、三種或四種或者每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖。在本發明的一個方面，免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖來自綴合在載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或四種，其中至少一種、兩種、三種或四種或者每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是用XL 5、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9或XlO的因子調整過尺寸的。本發明的免疫原性組合物任選地包含綴合物:腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)、血清群A莢膜糖(MenA)、血清群Wl35莢膜糖(MenW)、血清群Y莢膜糖(MenY)、血清群C和Y莢膜糖(MenCY)、血清群C和A莢膜糖(MenCA)、血清群C和W莢膜糖(MenCW)、血清群A和Y莢膜糖(MenAY)、血清群A和W莢膜糖(MenAW)、血清群W和Y莢膜糖(MenWY)、血清群A、C和W莢膜糖(MenACff)、血清群A、C和Y莢膜糖(MenACY)、血清群A、W135和Y莢膜糖(MenAffY)、血清群C、W135和Y莢膜糖(MenCffY);或血清群A、C、W135和Y莢膜糖(MenACffY)。這是本文所提到的“一種、兩種、三種或四種”，或者血清群A、C、W和Y中或各腦膜炎奈瑟氏球菌糖中的“至少一種”的定義。在一個實施方案中，至少一種、兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖的通過 MALLS 確定的平均尺寸在 50kDa 到 1500kDa、50kDa 到 500kDa、50kDa 到 300kDa、IOlkDa到 1500kDa、IOlkDa 到 500kDa、IOlkDa 到 300kDa 之間。在一個實施方案中，MenA糖，如果存在，其分子量為50-500kDa、50-100kDa、100-500kDa、55-90kDa、60-70kDa 或 70_80kDa 或 60_80kDa。在一個實施方案中，MenC糖，如果存在，其分子量為100-200kDa、50_100kDa、100-150kDa、101-130KDa、150-210kDa 或 180_210kDa。在一個實施方案中，MenY糖，如果存在，其分子量為60-190kDa、70_180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa 或 110-140kDa、50-100kDa、100_140kDa、140-170kDa 或150-160kDa。在一個實施方案中，MenW糖，如果存在，其分子量為60-190kDa、70_180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa 或 110-140kDa、50_100kDa、120_140kDa。本文中的糖的分子量或平均分子量是指在綴合前測量的糖的重均分子量(Mw)，其是通過MALLS測量的。MALLS技術是本領域所熟知的，其一般是如實施例2中所描述的那樣進行的。對于腦膜炎球菌糖的MALLS分析，可以聯合使用`兩個塔(TSKG6000和5000PWxl)，并且糖是在水中洗脫的。糖是使用光散射檢測器(例如裝有488nm的IOmW氬激光器的Wyatt Dawn DSP)和干涉測量折光計(例如裝有PlOO管和498nm紅色濾光片的Wyatt Otilab DSP)檢測的。在一個實施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖，或者是在通常的提取過程中減小了尺寸的天然多糖。在一個實施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌糖是通過機械切割，例如通過微流化作用或超生處理調整過尺寸的。微流化作用和超生處理具有能夠將較大天然多糖的尺寸減小到足以提供可過濾綴合物(例如通過0.2微米的過濾器)的尺寸的優勢。尺寸調整是用最高達 X20、X10、X8、X6、X5、X4、X3、X2 或 XL 5 的因子進行的。在一個實施方案中，免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌綴合物，所述綴合物是由天然多糖和用最高達X20的因子調整過尺寸的糖的混合物制成的。例如，來自MenC和/或MenA的糖是天然的。例如，來自MenY和/或MenW的糖是用最高達X20、X 10、X8、X6、X5、X4、X3或X2的因子調結過尺寸的。例如，免疫原性組合物含有由MenY和/或MenW和/或MenC和/或MenA制成的綴合物，其中所述MenY和/或Menff和/或MenC和/或MenA是用最高達X 10的因子調整過尺寸的和/或是微流化的。例如，免疫原性組合物含有由天然的MenA和/或MenC和/或MenW和/或MenY制成的綴合物。例如，免疫原性組合物包含由天然MenC制成的綴合物。例如，免疫原性組合物包含由天然MenC和用最高達X 10的因子調整過尺寸的和/或微流化的MenA制成的綴合物。例如，免疫原性組合物包含由天然MenC和用最高達X 10的因子調整過尺寸的和/或微流化的MenY制成的綴合物。
在一個實施方案中，糖的多分散性是1-1.5、1-1.3、1-1.2、1-1.1或1-1.05，在綴合到載體蛋白上以后，綴合物的多分散性是1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5、1.0-1.2、1.5-2.5、
1.7-2.2或1.5-2.0。所有的多分散性都是通過MALLS測量的。任選地調整糖的尺寸直到其是從細菌中分離出多糖的尺寸的1.5、2、4、6、8、10、
12、14、16、18 或 20 倍。在一個實施 方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌糖或者是天然多糖，或者是用最高達X 10的因子調整過尺寸的。在進一步的實施方案中，每種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均是天然多糖。在進一步的實施方案中，至少一種、兩種、三種或四種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是通過微流化作用調整過尺寸的。在進一步的實施方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是用最高達X 10的因子調整過尺寸的。在進一步的實施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌綴合物是由天然多糖和用最高達Xio的因子調整過尺寸的糖的混合物制成的。在進一步的實施方案中，來自血清群Y的莢膜糖是用最高達XlO的因子調整過尺寸的。在進一步的實施方案中，來自血清群A和C的莢膜糖是天然的多糖，而來自血清群W135和Y的糖是用最高達X 10的因子調整過尺寸的。在進一步的實施方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的平均尺寸在50kDa到300KDa或50kDa到200kDa之間。在進一步的實施方案中，免疫原性組合物包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、IOOkDa或者平均尺寸在50_100kDa或55_90kDa或60_80kDa之間的MenA莢膜糖。在進一步的實施方案中，免疫原性組合物包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、IOOkDa 或者在 100-200kDa、100-150kDa、80-120kDa、90-110kDa、150-200kDa、120-240kDa、140-220kDa、160-200kDa或190-200kDa之間的MenC莢膜糖。在進一步的實施方案中，免疫原性組合物包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、IOOkDa或者在60_190kDa或70_180kDa或 80-170kDa 或 90_160kDa 或 100_150kDa，、110_145kDa 或 120_140kDa 之間的 MenY 莢膜糖。在進一步的實施方案中，免疫原性組合物包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、IOOkDa或者在 60-190kDa 或 70_180kDa 或 80_170kDa 或 90_160kDa 或 100_150kDa、140_180kDa、150-170kDa 或 110_140kDa 之間的 MenW 莢膜糖。本發明的免疫原性組合物可以包含綴合到載體蛋白上的b型流感嗜血桿菌(H.1nf Iuenzaeb)莢膜糖(Hib)。其可以綴合到選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上，例如綴合到TT上。可以將Hib糖綴合到與至少一種、兩種、三種或全部腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物相同的載體蛋白上，例如綴合到TT上。在Hib莢膜糖綴合物中Hib與載體蛋白的比例可以在1: 5到5: I (w/w)之間，例如在1:1到1: 4、I: 2到I: 3.5之間，或者在1: 3(w/w)左右。Hib莢膜糖可以是通過連接物(參見上面)綴合到載體蛋白上的。連接物可以是雙官能的(具有兩個反應性氨基，例如ADH，或者具有兩個反應性羧酸基團，或者一端具有反應性氨基另一端具有反應性羧酸基團)。其可以具有4到12各碳原子。可以將Hib糖綴合到載體蛋白上，或者使用CNBr或CDAP綴合到連接物上。載體蛋白可以通過連接物并使用包括碳二亞胺化學，例如EDAC化學(因此使用了載體上的羧基化學基團)的方法而綴合到Hib糖上。Hib糖綴合物的劑量可以在0.1到9iig、l到5iig或2到3iig糖之間。在進一步的實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含Hib糖綴合物和至少兩種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物，其中Hib綴合物以比所述至少兩種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物的平均糖劑量低的糖劑量存在。或者，所述Hib綴合物以比所述至少兩種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物中的每一種的糖劑量低的糖劑量存在。例如，Hib綴合物的劑量可以比所述至少兩種其它腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物的平均或最低糖劑量低至少10 %、20 %、30 %、40%、50%、60%、70% 或 80%。平均劑量是通過將所有的其它糖的劑量相加再除以其它糖的數目而確定的。所述其它糖是指免疫原性組合物中除Hib以外的所有的糖，其能夠包括腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖。“劑量”是向人給予的免疫原性組合物或疫苗的量。Hib糖是b型流感嗜血桿菌的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP)莢膜糖，或者是由其衍生的低聚糖。除Hib綴合物以外的兩種其它細菌糖綴合物意味著至少包括兩種其它細菌糖綴合物。兩種其它細菌綴合物可以包括腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物。本發明的免疫原性組合物可以包含由腦膜炎奈瑟氏球菌、肺炎鏈球菌、A組鏈球菌、B組鏈球菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌中的一種或多種衍生的其它糖綴合物。在一個實施方案中，免疫原性組合物包含由腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y中的一種或多種衍生的莢膜糖。一個進一步的實施方案包含由肺炎鏈球菌衍生的莢膜糖。所述肺炎球菌莢膜糖抗原任選地選自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F(任選地選自血清型 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。一個進一步的實施方案包含金黃色葡萄球菌的5型、8型或336莢膜糖。一個進一步的實施方案包含表皮葡萄球菌的I型、II型或III型莢膜糖。一個進一步的實施方案包含來自傷寒沙門氏菌的Vi糖。一個進一步的實施方案包括B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型、III型或V型莢膜糖。一個進一步的實施方案包含A組鏈球菌的莢膜糖，任選地進一步包含至少一種M蛋白和任選地多種類型的M蛋白。本發明的免疫原性組合物還可以包含DTPa或DTPw疫苗(例如含有DT、TT以及全細胞百日咳(Pw)疫苗或無細胞百日咳(Pa)疫苗(包含例如百日咳類毒素、FHA、pertactin和任選地agglutinogins 2 和3)的疫苗)。這樣的組合還可以包含抗乙型肝炎的疫苗(例如其可以包含乙型肝炎表面抗原[HepB]，其任選地是吸附在磷酸鋁上的)。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含DTPwH印BHibMenAC疫苗，其中的HibMenAC組分是如上所述的。本發明的免疫原性組合物任選地還包含另外的病毒抗原，所述病毒抗原能夠賦予組合物抵抗由麻疹和/或流行性腮腺炎和/或風疹和/或水痘所引起的疾病的功能。例如，本發明的免疫原性組合物含有來自麻疹、流行性腮腺炎和風疹(MMR)或者麻疹、流行性腮腺炎、風疫和水痘(MMRV)的抗原。在一個實施方案中,這些病毒抗原任選地存在于與腦膜炎球菌和/或Hib糖綴合物相同的容器中。在一個實施方案中。這些病毒抗原是凍干的。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物進一步包含來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的抗原。所述抗原任選地是來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B (MenB)或調整過尺寸的多糖或由其衍生的低聚糖的莢膜多糖，其可以是綴合到蛋白載體上的。所述抗原任選地是如 EP301992、W0 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 和 WO 04/14419 中所描述的那些來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜囊制備物。通常，本發明免疫原性組合物所包含的每種糖綴合物的劑量可以在0.1到20y g、2到10 y g、2到6 ii g或4到7 ii g糖之間。
在一個實施方案中，本發明免疫原性組合物所含有的每種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的劑量可以在0.1-20 u g ；1-10 u g ；2-10 u g ；2.5-5 u g之間，或者在5 u g左右或恰好為5u g ;或者在2.5 ii g左右或恰好為2.5 ii g。在一個實施方案中，本發明免疫原性組合物所包含的MenA、MenC、MenW和MenY (任選地綴合在破傷風類毒素上)的劑量分別為2.5、2.5、
2.5和2.5 ii g,分別為5、5、5和5 ii g或者分別為5、5、2.5和2.5 y g。在一個實施方案中，本發明免疫原性組合物所含有的Hib糖綴合物的糖劑量例如可以在0.1到9 ii g ;1到5 ii g或2到3 ii g之間，或者在2.5 ii g左右或恰好為2.5 ii g。在進一步的實施方案中，本發明的免疫原性組合物所含有的Hib糖綴合物的糖劑量例如在0.1至IJ 9 ii g ;1到5 ii g或2到3 ii g之間，或者在2.5 ii g左右或恰好為2.5 ii g，所含有的每種腦膜炎奈瑟氏球菌多糖綴合物的糖劑量在2到20 ii g、3到10 ii g或4到7 ii g之間，或者在5 U g左右或恰好為5 y g。為了本發明的目的，“左右”或“大約”被定義為在所給出范圍的10%上下以內。在一個實施方案中，本發明免疫原性組合物所含有的Hib糖綴合物的糖劑量例如小于至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物平均糖劑量的90%、80%、75%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%。Hib糖的糖劑量例如是至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物平均糖劑量的20 %到60 %、30 %到60 %、40 %到60 %或者是50%左右或恰好為50%。在一個實施方案中，本發明免疫原性組合物所含有的Hib糖綴合物的糖劑量例如小于至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物最低糖劑量的90%、80%、75%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%。Hib糖的糖劑量例如是至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖 綴合物最低糖劑量的20 %到60 %、30 %到60 %、40 %到60 %或者是50%左右或恰好為50%。在本發明的一個實施方案中，所述至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物中的每一種的糖劑量任選地是相同的或近似相同的。本發明免疫原性組合物的實例是由以下物質組成或含有以下物質的組合物:Hib綴合物和MenA綴合物和MenC綴合物，任選地各糖的劑量比為1: 2: 2，I: 2: 1,1: 4: 2,1: 6: 3,1: 3: 3,1: 4: 4,1: 5: 5,1: 6: 6 (w/w)。任選地，MenA的糖劑量大于MenC的糖劑量。Hib綴合物和MenC綴合物和MenY綴合物，任選地各糖的劑量比為1: 2: 2，I: 2: 1,1: 4: 2,1: 4: 1,1: 8: 4,1: 6: 3,1: 3: 3,1: 4: 4,1: 5: 5,1:6: 6 (w/w) o任選地，MenC的糖劑量大于MenY的糖劑量。Hib綴合物和MenC綴合物和MenW綴合物，任選地各糖的劑量比為1: 2: 2，I: 2: 1,1: 4: 2,1: 4: 1,1: 8: 4,1: 6: 3,1: 3: 3,1: 4: 4,1: 5: 5,1:6: 6 (w/w) o任選地，MenC的糖劑量大于MenW的糖劑量。Hib綴合物和MenA綴合物和MenW綴合物，任選地各糖的劑量比為1: 2: 2，I: 2: 1,1: 4: 2,1: 4: 1,1: 8: 4,1: 6: 3,1: 3: 3,1: 4: 4,1: 5: 5,1:6: 6 (w/w) o任選地，MenA的糖劑量大于MenW的糖劑量。Hib綴合物和MenA綴合物和MenY綴合物，任選地各糖的劑量比為1: 2: 2，I: 2: 1,1: 4: 2,1: 4: 1,1: 8: 4,1: 6: 3,1: 3: 3,1: 4: 4,1: 5: 5,1: 6: 6 (w/w) o任選地，MenA的糖劑量大于MenY的糖劑量。Hib綴合物和MenW綴合物和MenY綴合物，任選地各糖的劑量比為1: 2: 2，I: 2: I,I: I: 2,1: 4: 2,1: 2: 4.1: 4: I, I: I: 4,1: 3: 6,1: I: 3,I: 6: 3,1: 3: 3,1: 4: 4,1: 5: 5,1: 6: 6 (w/w)。任選地，MenY 的糖劑量大于MenW的糖劑量。MenA、MenC、MenW 和 MenY，其糖劑量比為 1:1:1:1 或 2:1:1:1 或1:2:1:1 或 2:2:1:1 或 1:3:1:1 或 1:4:1:1 (w/w)。本發明進一步的方面是包含本發明免疫原性組合物和藥學上可接受賦形劑的疫苗。在一個實施方案中，將本發明的免疫原性組合物調節到或緩沖到pH7.0到8.0或pH7.2到7.6之間或pH7.4左右或恰好為pH7.4。本發明的免疫原性組合物或疫苗任選地是在穩定劑例如多元醇如蔗糖或海藻糖的存在下進行凍干的。任選地，本發明的免疫原性組合物或疫苗含有足以使對免疫原的免疫應答加強的量的助劑。合適的助劑包括，但不限于，鋁鹽(磷酸鋁或氫氧化鋁)、角鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁肽、皂草苷衍生物、分枝桿菌細胞壁制品、單磷酰脂質A、霉菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂毒素B亞單位、聚磷腈及其衍生物、和免疫刺激復合物(ISCOMs)例如Takahashi等人，(1990) Nature 344:873-875中所描述的那些免疫刺激復合物。對于以上所討論的腦膜炎奈瑟氏球菌或HibMen組合來說，不使用任何鋁鹽助劑，或者根本不使用任何助劑是 有利的。對于所有的免疫原性組合物或疫苗來說,免疫原的免疫有效量必須是憑經驗確定的。所考慮的因素包括免疫原性、免疫原是否將會被復合到或共價附著到助劑或載體蛋白或其它載體上，給藥途徑和給藥的致免疫劑量的數量。本發明的藥物組合物或疫苗中可以存在不同濃度的活化劑。一般地，物質的最低濃度是獲得其使用目所必須的量，而最高濃度是能夠保留在溶液中的最大量，或者是能夠保持均勻地懸浮在初始混合物內的最大量。例如，治療劑的最小量任選地是能夠提供單一治療有效劑量的量。對于生物活性物質來說，其最低濃度是在重組過程中具有生物活性所必需的量，最高濃度是不能夠再保持均勻懸浮的點處的濃度。在單劑單位的情況下，所述量即為單一治療使用量。通常，可以預期每種制劑能夠包含1-1OOiig的蛋白抗原，任選地為5-50iig*5-25iig。例如，綴合物中細菌糖的劑量是10-20i! g、5-10i! g、2.5-5i! g或
1-2.g 糖。通過對所述疫苗進行全身或粘膜途徑的給藥，本發明的疫苗制品可以用于保護或治療易受感染的哺乳動物(例如人類患者)。所述人類患者任選地是嬰兒(12個月以下)、初學走路的孩子(12-24、12-16或12-14個月)、兒童(2_10、3_8或3-5歲)、青少年(21-21、14-20或15-19歲)或成人。這些給藥可以包括經由肌內、腹膜內、皮內或皮下路線的注射；或者通過粘膜給藥到達口腔/消化系統、呼吸系統、泌尿生殖系統處。疫苗的產期內給藥對于治療肺炎或中耳炎來說是優選的(因為這樣能夠更有效地預防鼻咽部攜帶肺炎球菌，并因此能夠在其最初階段減少感染)。雖然本發明的疫苗可以作為單劑給藥，但也可以將其各組分一起進行同時或不同時的共同給藥(例如如果疫苗中存在糖，則可以同時對這些糖進行單獨給藥，或者是在給藥以細菌蛋白疫苗1-2周后再對這些糖進行給藥以彼此獲得免疫應答的最佳協調)。除了單一的給藥途徑以外，還可以使用2種不同的給藥途徑。例如，可以對病毒抗原進行ID (皮內)給藥，而對細菌蛋白進行IM(肌內)或IN(產期內)給藥。如果存在糖，則可以對它們進行頂(或ID)給藥，并對細菌蛋白進行IN(或ID)給藥。此外，對于初種制劑，本發明的疫苗可以用頂的方式給藥，對于加強制劑可以用IN的方式。疫苗制品通常描述于Vaccine Design ( “The subunit and adjuvantapproach，，(Powell M.F.&Newman M.J.編輯)(I995)Plenum Press New York)中。脂質體內的膠囊化描述于Fullerton，美國專利4，235,877中。本發明進一步的方面是一種用于伴隨或順序給藥的免疫試劑盒，其包含兩種多價免疫原性組合物以用于在宿主內提供保護作用從而抵抗由百日咳桿菌(Bordetellapertussis)、破傷風桿菌(Clostridium tetani)、白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)以及任選地流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)引起的疾病。例如,所述試劑盒任選地包含第一容器,所述第一容器中包含一種或多種:破傷風類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)JP全細胞或無細胞百日咳組分和第二容器，所述第二容器中包含:如上所述的本發明免疫原性組合物(例如那些包含Men或HibMen糖綴合物組合的免疫原性組合物)。本發明進一步的方面是一種用于伴隨或連續給藥的免疫試劑盒，其包含兩種多價免疫原性組合物以用于 在宿主內提供保護作用從而抵抗由肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonias)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)以及任選地流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)引起的疾病。例如,所述試劑盒任選地包含第一容器,所述第一容器中包含:載體蛋白與來自肺炎鏈球菌的莢膜糖[其中所述莢膜糖任選地來自選自1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F 和 33F 的肺
炎球菌血清型]的一種或多種綴合物。和第二容器，所述第二容器中包含:如上所述的本發明免疫原性組合物(例如那些包含Men或HibMen糖綴合物組合的免疫原性組合物)。Hib綴合物和腦膜炎奈瑟氏球菌多糖綴合物的例子如上所述。一般地，本發明免疫試劑盒中的(或者任意以上描述的本發明免疫原性組合物中的)肺炎鏈球菌疫苗包含糖抗原(任選地是綴合的)，其中所述糖衍生自選自1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A, 11A, 12F, 14，15B, 17F, 18C, 19A, 19F，20，22F，23F 和 33F 的肺炎球菌血清型中的至少四種。任選地，所述的四種血清型包括6B、14、19F和23F。任選地，組合物中包括至少7種血清型，例如那些衍生自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的。任選地，組合物中包括大于7種的血清型，例如包括至少10、11、12、13或14種血清型。例如一個實施方案中的組合物包含衍生自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F和任選地3 (所有均任選地是綴合的)的10或11莢膜糖。在本發明的一個實施方案中包含了至少13種糖抗原(任選地是綴合的)，雖然其它的糖抗原，例如23元(例如血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A, 11A, 12F, 14，15B, 17F, 18C, 19A, 19F，20，22F，23F 和 33F)也能夠通過本發明預期到。能夠將肺炎球菌糖獨立地綴合到任何已知的載體蛋白上，所述載體蛋白例如CRM197、破傷風類毒素、白喉類毒素、蛋白D或以上提到的任何其它載體蛋白。任選地，本發明的免疫試劑盒還包含第三部分。例如，所述試劑盒任選地包含第一容器，所述第一容器內含有一種或多種:破傷風類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)JP全細胞或無細胞百日咳組分和第二容器，所述第二容器中包含:載體蛋白與來自肺炎鏈球菌的莢膜糖[其中所述莢膜糖任選地來自選自1、2、3、
4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14，15B,17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺
炎球菌血清型]的一種或多種綴合物。
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和第三容器，所述第三容器中包含:如上所述的本發明免疫原性組合物(例如那些包含Men或HibMen糖綴合物組合的免疫原性組合物)。本發明進一步的方面是一種制備本發明免疫原性組合物或疫苗的方法，其包括混合本發明的糖的步驟，例如將腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖與藥學上可接受的賦形劑進行混合，所述腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或全部四種。本發明進一步的方面是一種對人類宿主進行免疫以抵抗由細菌所引起的疾病的方法，例如抵抗腦膜炎奈瑟氏球菌和任選地流感嗜血桿菌感染，所述方法包括向宿主給藥以免疫保護劑量的本發明免疫原性組合物或疫苗或試劑盒，任選地使用單劑。本發明的一個獨立的方面是一種用免疫原性組合物使人類宿主免疫的方法，所述免疫原性組合物包含至少2種選自血清群A、C、W和Y(任選地為MenA、C、W和Y)的不同的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物，其中單劑給藥(任選地對少年、成人或孩子)導致在給藥一個月后進行的血液檢查中給出在測量對MenA、MenC、MenW和/或MenY的應答水平的SBA試驗中應答者超過50%、60%、70%、80%、90%或95%的結果。任選地SBA試驗是如實施例9中所描述的，并如實施例9中所描述的那樣對應答者進行評價。本發明一個進一步獨立的方面是一種包含MenA、MenC、MenW和/或MenY綴合物的免疫原性組合物，其能夠在單劑使用后弓I發免疫應答，從而使超過50 %、60 %、70 %、80 %、90%或95%的接種人類受試者(兒童、少年或成人)在對接種后一個月時抽取的血液進行的SBA試驗中能夠歸為應答者一類(任選地使用實施例9中所描述的標準)。這樣的免疫原性組合物任選地具有本文所描述的進一步的結構特征。本發明的一個進一步的方面是本發明免疫原性組合物在治療或預防由細菌引起的疾病，例如腦膜炎奈瑟氏球菌和任選地流感嗜血桿菌感染，方面的用途。
本發明的一個進一步的方面是本發明免疫原性組合物或疫苗或試劑盒在制備用于治療或預防由細菌引起的疾病的藥物方面的用途，所述疾病例如腦膜炎奈瑟氏球菌和任選地流感嗜血桿菌感染。根據發明人的意圖，在所有情況中，本文中的術語“包含”、“含有”和“包括”是分別與術語“由...組成”、“由...組成的”和“由...組成地”可任選地替換的。本專利說明書中所引用的全部參考文獻或專利申請均在此弓I入作為參考。所附的實施例解釋說明了本發明。除另外詳細描述的那些以外，以下實施例均是采用標準技術進行的，其對于本領域技術人員來說是熟知的并且是常規的。實施例是解釋說明性的，其不用于限定本發明。
實施例實施例1-多糖綴合物的制備通過由Chu等人開發的偶合化學方法(Infection and Immunity 1983,40 (I)；245-256)實現流感嗜血桿菌(Hib) PRP多糖到TT上的共價鍵合。通過加入CNBr并在pH10.5下培養6分鐘對Hib PRP多糖進行活化。將pH降低到pH 8.75并加入己二酸二酰肼(ADH)，繼續培養90分鐘。通過使用1-乙基-3-(3- 二甲基-氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)的碳二亞胺縮合將活化的PRP連接到純化的破傷風類毒素上。向活化的PRP中加入EDAC以達到0.6mg EDAC/mg活化PRP的最終比例。將pH調節到5.0并加入純化的破傷風類毒素以達到2mg TT/mg活化PRP。在溫和的攪拌下將所產生的溶液放置三天。在通過0.45 y m膜的過濾之后，將綴合物在用在0.2M NaCl中平衡過的s印hacryl S500HR(Pharmacia，瑞典)柱上進行純化。MenC-TT綴合物是 使用天然多糖(通過MALLS測量超過150kDa的)制備的或者是被輕微微流化過的。MenA-TT綴合物是用超過60kDa的天然多糖或輕微微流化多糖制備的，所述超過60kDa是通過實施例2中的MALLS法測量的。MenW和MenY-TT綴合物是用100-200kDa左右的調整過尺寸的多糖制備的，其中所述100-200kDa左右是通過MALLS (參見實施例2)測量的。通過使用勻漿器Emulsiflex C-50裝置的微流化作用來調整尺寸。然后將多糖通過0.2 ii m過濾器進行過濾。活化和偶合是如WO 96/29094和WO 00/56360中所描述的那樣進行的。簡單地說是，將2M NaCl中的pH5.5-6.0且濃度為10_20mg/ml的多糖與CDAP溶液(100mg/ml，在乙If/WFI, 50/50中新制備的)進行混合以達到0.75/1或1.5/1的最終CDAP/多糖比例。1.5分鐘后，用氫氧化鈉將PH升高到pH 10.0。三分鐘后，加入破傷風類毒素以達到以下蛋白/多糖比例，所述比例對MenW來說為1.5/1，對MenY來說為1.2/1，對MenA來說為1.5/1或者對MenC來說為1.5/1。繼續反應一到兩個小時。偶合步驟之后，加入甘氨酸以達到7.5/1的最終甘氨酸/PS (w/w)比例，并將pH調節到pH9.0。將混合物放置30分鐘。使用10 ii m的Kleenpak過濾器澄清綴合物，然后將其裝載到S印hacryl S400HR柱上，所述柱子使用的洗脫緩沖液是的150mM NaClUOmM或5mMTris pH7.5。將臨床批次在Opticap 4滅菌膜上過濾。所產生的綴合物具有1: 1_1: 5 (w/w)的平均糖:蛋白比例。實施例1a-本發明MenA和MenC多糖綴合物的制各
MenC-TT綴合物是使用天然多糖(通過MALLS測量超過150kDa的)制備的，或者是被輕微微流化過的。MenA-TT綴合物是使用超過60kDa的天然多糖或輕微微流化過的多糖制備的，其中所述超過60kDa是通過實施例2中的MALLS方法測量的。通過使用勻漿器Emulsiflex C-50裝置的微流化作用來調整尺寸。然后將多糖通過0.2 y m的過濾器進行過濾。為了將MenA莢膜多糖通過間隔物綴合到破傷風類毒素上，使用了以下的方法。通過偶合化學方法來實現多糖與間隔物(ADH)的共價鍵合，所述偶合化學方法使多糖在控制條件下通過氰基化試劑，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)得到活化。間隔物通過其肼基來與氰基化的PS進行反應，從而在間隔物與多糖之間形成穩定的異脲連接。用新制備的100mg/ml CDAP的乙腈/水(50/50(v/v))溶液處理10mg/ml的MenA溶液(pH 6.0) [3.5g]以獲得0.75的CDAP/MenA比例(w/w)。1.5分鐘后，將pH升高到pH
10.0。三分鐘后，加ADH以獲得8.9的ADH/MenA比例。將溶液的pH降低到8.75并且保持該PH繼續反應2小時(溫度保持在25°C )。將PSAAH溶液濃縮到其初始體積的四分之一，然后使用截點為IOkDa的FiltixmOmega膜用30體積的0.2M NaCl進行滲濾(diaf iltered),過濾滯留物。在綴合(碳二亞胺縮合)反應之前，對純化TT溶液和PSAAH溶液進行稀釋以達到10mg/ml 的 PSAAH 濃度和 10mg/ml 的 TT 濃度。為了達到0.9mg EDAC/mg PSAAH的最終比例，向PSAH溶液(2g糖)中加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)。將pH調節到5.0。用蠕動泵(在60分鐘內)加入純化的破傷風類毒素以達到2mg TT/mg PSAAH。在+25°C在攪拌下將所產生的溶液放置60分鐘以達到120分鐘的最終偶合時間。通過加入pH 7.5的IM Tris-Hcl (最終體積的1/10)對溶液進行中和并在+25°C下放置30分鐘，然后在+2°C到+8°C下放置過夜。使用10 y m的過濾器澄清綴合物，并使用Sephacryl S400HR柱(Pharmacia,瑞典)進行純化。該柱是在IOmM Tris-HCl (pH7.0)中平衡過的，將0.075M NaCl和綴合物(大約660mL)載樣到所述柱子上(+2°C到+8°C )。洗脫池(elution pool)是作為280nm下光密度的函數選擇的。當吸光度增加到0.05時開始收集。持續收集直到Kd達到0.30。將綴合物在+20°C下過濾消毒，然后在+2°C到+8°C下儲存。所產生的綴合物具有1: 2-1: 4(w/w)的糖:蛋白比例。為了將MenC莢膜多糖通過間隔物綴合到破傷風類毒素上，使用了以下的方法。通過偶合化學方法來實現多糖與間隔物(ADH)的共價鍵合，所述偶合化學方法使多糖在控制條件下通過氰基化試劑，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)得到活化。間隔物通過其肼基與氰基化的PS進行反應，從而在間隔物與多糖之間形成了穩定的異脲連接。用新制備的100mg/ml CDAP的乙腈/水(50/50(v/v))溶液處理20mg/ml的MenC溶液(pH6.0) [3.5g]以獲得(w/w) 1.5的CDAP/MenC比例。1.5分鐘后，將pH升高到pH10.0。在活化過程中加入pH5M NaCl以獲得2M NaCl的最終濃度。三分鐘后，加入ADH以獲得8.9的ADH/MenC比例。將溶液的pH降低到8.75并且保持該pH繼續反應2小時(溫度保持在25 0C )。

將PSCAH溶液濃縮到150mL的最小體積,然后使用截點為IOkDa的Filtron Omega膜用30體積的0.2M NaCl進行滲濾，過濾滯留物。在綴合反應之前，將純化TT溶液和PSCAH溶液(2g規模的)在0.2M NaCl中進行稀釋以達到15mg/ml的PSCAH濃度和20mg/ml的TT濃度。為了達到2mg TT/mg PSCAH，向PSCAH溶液中加入純化的破傷風類毒素。將pH調節到5.0。用蠕動泵(在10分鐘內)加入EDAC(16.7mg/ml Tris0.1M pH7.5中的)以達到0.5mg EDAC/mg PSCAH的最終比例。在+25°C，在攪拌和pH調節下將所產生的溶液放置110分鐘以達到120分鐘的最終偶合時間。然后通過加入pH9.0的IM Tris-Hcl (最終體積的1/10)對溶液進行中和并在+25°C下放置30分鐘，然后在+2°C到+8°C下放置過夜。使用10 y m的過濾器澄清綴合物，并使用Sephacryl S400HR柱(Pharmacia,瑞典)進行純化。該柱是在IOmM Tris-HCl (pH7.0)中平衡過的，將0.075M NaCl和綴合物(大約460mL)載樣到所述柱子上(+2°C到+8°C )。洗脫池是作為280nm下光密度的函數選擇的。當吸光度增加到0.05時開始收集。持續收集直到Kd達到0.20。將綴合物在+20°C下過濾消毒，然后在+2°C到+8°C下儲存。所產生的綴合物具有1: 2-1: 4(w/w)的糖:蛋白比例。
_3] 實施例2-使用MALLS確定分子暈將檢測器與HPLC排阻柱連接，樣品從所述排阻柱中得到洗脫。一方面，激光散射檢測器測量了大分子溶液在16度角散射的光強度，另一方面，在線設置的干涉測量折光計(interferometric refractometer)提供了對洗脫樣品的量的測量。由此可以確定溶液中大分子的密度、尺寸和形狀。重均分子量(Mw)的定義是所有物質重量與它們各自分子量的乘積的總和，再除以所有物質的重量和。

a)重均分子量:_Mw-
權利要求
1.種包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種糖選自由通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第一組,而一種或多種不同的糖選自由直接綴合到載體蛋白上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第二組。
2.權利要求1所述的包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種糖選自由通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA和MenC組成的第一組，而一種或多種不同的糖選自由直接綴合到載體蛋白上的MenC、MenY和MenW組成的第二組。
3.權利要求2所述的免疫原性組合物，其包含通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA莢膜糖，和直接綴合到載體蛋白上的MenC莢膜糖。
4.權利要求2所述的免疫原性組合物，其包含通過連接物綴合到載體蛋白上的MenC莢膜糖，和直接綴合到載體蛋白上的MenY莢膜糖。
5.權利要求2所述的免疫原性組合物，其包含通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA和MenC莢膜糖，和直接綴合到載體蛋白上的MenY和MenW莢膜糖。
6.權利要求2所述的免疫原性組合物，其包含通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA莢膜糖，和直接綴合到載體蛋白上的MenC、MenY和MenW莢膜糖。
7.種包含至少2種分別綴合到同類載體蛋白上的不同糖的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的第一類化學基團綴合到載體蛋白上的，一種或多種糖是通過蛋白載體上的第二類化學基團綴合到載體蛋白上的。
8.權利要求7所述的免疫原性組合物，其中通過蛋白載體上第一類化學基團綴合到載體蛋白上的一種或多種糖與通過蛋白載體上第二類化學基團綴合到載體蛋白上的一種或多種糖不同。
9.權利要求7或8所述的包含至少2種分別綴合到同類載體蛋白上的不同糖的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的羧基基團綴合到載體蛋白上的，一種或多種糖是通過蛋白載體上的氨基基團綴合到載體蛋白上的。
10.權利要求7-9所述的免疫原性組合物，其中蛋白載體上的第一和第二類化學基團存在于載體蛋白上的單獨的B-和/或T-細胞抗原表位上。
11.權利要求7-10所述的免疫原性組合物，其中所述糖選自:腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖(MenA)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖(MenY)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W莢膜糖(MenW)、B群鏈球菌I群莢膜糖、B群鏈球菌II群莢膜糖、B群鏈球菌III群莢膜糖、B群鏈球菌IV群莢膜糖、B群鏈球菌V群莢膜糖、金黃色葡萄球菌5型莢膜糖、金黃色葡萄球菌8型莢膜糖、來自傷寒殺門氏菌的Vi糖、腦膜炎奈瑟氏球菌LPS(例如L3和/或L2)、卡他莫拉菌LPS、流感嗜血桿菌LPS和來自任意的莢膜肺炎球菌糖，例如來自血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
12.前述權利要求任意一項所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均是綴合到載體蛋白上的，所述載體蛋白獨立地選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D0
13.前述權利要求任意一項所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均是綴合到相同載體蛋白上的，所 述載體蛋白選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。
14.前述權利要求任意一項所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均是綴合到TT上的。
15.前述權利要求任意一項所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是分別綴合到單獨的載體蛋白上的。
16.前述權利要求任意一項所述的免疫原性組合物，其中至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是直接綴合到載體蛋白上的。
17.權利要求16所述的免疫原性組合物，其中MenW和/或MenY，MenW和/或MenC，MenY和/或MenC，或者MenW和MenC和MenY是直接綴合到載體蛋白上的。
18.權利要求16或17所述的免疫原性組合物，其中至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是用CDAP化學直接綴合的。
19.權利要求1-18任意一項所述的免疫原性組合物，其中至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是通過連接物綴合到載體蛋白上的。
20.權利要求19所述的免疫原性組合物，其中所述連接物是雙官能性的。
21.前述權利要求任意一項所述的免疫原性組合物，其包含來自血清群A、C、W135和Y中的至少兩種的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖是綴合到載體蛋白上的以產生腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌糖的平均尺寸在50kDa、75kDa、IOOkDaU 10kDa、120kDa 或 130kDa 以上。
22.前述權利要求任意一項所述的免疫原性組合物，其進一步包含綴合到載體蛋白上的b型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜糖，所述載體蛋白任選地選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。
23.權利要求22所述的免疫原性組合物，其包含Hib糖綴合物和至少兩種其它的細菌糖綴合物，其中Hib綴合物所存在的劑量低于所述的至少兩種其它細菌糖綴合物的平均劑量。
24.種疫苗，其包含如權利要求1-23任意一項所述免疫原性組合物和藥學上可接受的賦形劑。
25.種用于伴隨或順序給藥的免疫試劑盒，其包含兩種多價免疫原性組合物以用于在宿主內提供保護作用從而抵抗由百日咳桿菌、破傷風桿菌、白喉棒桿菌、流感嗜血桿菌以及腦膜炎奈瑟氏球菌所引起的疾病，所述試劑盒包含第一容器，所述第一容器中包含: 破傷風類毒素(TT)， 白喉類毒素(DT)JP 全細胞或無細胞百日咳組分 和第二容器，所述第二容器中包含: 如權利要求1-23任意一項所述的免疫原性組合物。
26.種如權利要求24所述的疫苗的制備方法，其包括將權利要求1-23任意一項所述的免疫原性組合物與藥學上可接受的賦形劑相混合的步驟。
27.種對人類宿主進行免疫以抵抗由腦膜炎奈瑟氏球菌感染引起的疾病的方法，其包括向宿主給藥以免疫保護劑量的如權利要求1-23所述的免疫原性組合物或疫苗。
28.于治療或預防由腦膜炎奈瑟氏球菌感染所引起的疾病的如權利要求1-23所述的免疫原性組合物。
29.權利要求1-23任意一項所述的免疫原性組合物在制備用于治療或預防由腦膜炎奈瑟氏球菌感 染所引起疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本申請公開了一種包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第一組，而一種或多種不同的糖選自由直接綴合到載體蛋白上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第二組。
文檔編號A61K39/095GK103083657SQ20131002329
公開日2013年5月8日 申請日期2006年6月23日 優先權日2005年6月27日
發明者R.L.比曼斯, D.布特里奧, C.卡皮奧, P.德內爾, P.迪維維耶, J.普爾曼 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司