專利名稱：基于Isthmin基因的免疫脂質體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫脂質體，特別涉及一種基于Isthmin基因的免疫脂質體，還涉及該免疫脂質體的制備方法和應用。
背景技術：
腫瘤是發病率高、預后差的惡性疾病，嚴重威脅著人類健康。繼手術、放療、化療后，生物治療已經成為腫瘤綜合治療中的重要手段。當前，腫瘤生物治療策略主要有腫瘤相 關基因或腫瘤抑制基因的靶向治療、腫瘤相關抗原的免疫治療等，但這些方法由于技術的 成熟性、有效性、經濟性及伴隨的副作用等問題，在實際應用中受到一定限制。研究表明，所有人類腫瘤中90%以上為實體瘤，而實體瘤的生長和轉移需要新生血管形成，抑制腫瘤血管形成能夠有效阻斷腫瘤細胞的營養支持，抑制腫瘤的生長和轉移， 因此是腫瘤生物治療中的一個重要補充策略。該策略不僅具有良好的腫瘤特異性，而且不 受腫瘤類型的限制，更重要的是新生血管內皮細胞是一種基因穩定的細胞。過去十年中，人 們在抑制腫瘤血管生成方面主要致力于各種血管生成抑制劑的研究，但至今尚未取得令人 滿意的療效。Isthmin是從后腦組織中鑒定出的一種分子量約60kDa的分泌性蛋白，目前功能未知。在神經元發育階段，Isthmin在中腦到后腦的分界峽部組織高度表達，此外在軸旁的 中胚葉神經褶發育的晚期階段也有表達。Isthmin的中部具有凝血栓蛋白-II型重復序列 (thrombospondin-1 type 1 repeat, TSR)，羧基末段具有黏附相關蛋白區域。TSR由3組 重復的備解素序列組成，最初被證明是凝血栓蛋白-I(TSP-I)的重要結構域，在TSP-I抑制 血管生成中發揮重要作用；隨后的研究發現，TSR在分泌性或跨膜性蛋白中存在，功能與細 胞黏附、通訊和組織重建相關。脂質體是由一層或多層同心的脂質雙分子膜包封而成的球狀體，可以包裹多種物質(如藥物、核酸等)并將其轉入多種類型的細胞中，具有延長包裹物的作用時間、增加細 胞對包裹物的攝取量、提高療效、減少毒副作用等特點，但其缺乏主動靶向性。免疫脂質體 則是一種表面結合有抗體或抗體片段等物質的脂質體，其借助抗體或抗體片段與靶細胞表 面抗原的特異性結合，可以特異性識別并結合靶細胞，使脂質體在靶區釋放包裹物，具有主 動靶向功能。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種基于Isthmin基因的免疫脂質體，可以主動靶向腫瘤新生血管內皮細胞，在細胞中釋放出Isthmin重組真核表達載體并表達 Isthmin，從而發揮抗腫瘤血管生成的作用，具有高效、低毒等優點；目的之二在于提供所述 基于Isthmin基因的免疫脂質體的制備方法，操作簡便易行；目的之三在于提供所述基于 Isthmin基因的免疫脂質體在醫藥方面的應用。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
1、基于Isthmin基因的免疫脂質體，由包封有Isthmin重組真核表達載體的脂質 體與抗第VIII因子相關抗原單克隆抗體共價結合而成。進一步，所述Isthmin重組真核表達載體是將核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的 Isthmin基因插入真核表達載體p3xFLAG-CMV-14的多克隆位點中而得到；進一步，所述脂質體由卵磷脂和膽固醇組成。2、所述基于Isthmin基因的免疫脂質體的制備方法，包括以下步驟a、Isthmin重組真核表達載體的制備提取小鼠脾臟組織血管內皮細胞總RNA， 逆轉錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3 所示的上、下游引物進行PCR擴增，所得PCR產物經純化后，用Not I和Xba I雙酶切，再 與同樣經Not I和Xba I雙酶切的真核表達載體p3xFLAG-CMV-14在T4DNA連接酶的作用 下連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性 克隆，提取質粒進行鑒定，在p3xFLAG-CMV-14的Not I和Xba I位點之間插入了核苷酸序 列如SEQID No. 1所示的Isthmin基因的陽性克隆質粒即為Isthmin基因重組真核表達 載體 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；將含有 p3xFLAG-CMV_14/Isthmin 的大腸桿菌 DH5 α 接種 于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中進行增菌培養，大量抽提質粒，用超純水溶解，即得 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 溶液；b、Isthmin重組真核表達載體的脂質體包封將卵磷脂和膽固醇溶解于乙醚中， 減壓蒸餾除去有機溶劑，水浴超聲，再加入p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，在42°C水浴和 干冰中反復凍融并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器，未包封入脂質體的p3xFLAG-CMV-14/ Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解，再用瓊脂糖凝膠CL-4B柱分離除去被 核酸酶降解的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；C、包封有Isthmin重組真核表達載體的脂質體與抗第VIII因子相關抗原單克隆 抗體的連接將抗第VIII因子相關抗原單克隆抗體經巰基化修飾后，與包裹Isthmin基因 重組真核表達載體的脂質體在室溫下振搖連接過夜，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去游離的抗 第VIII因子相關抗原單克隆抗體，即得基于Isthmin基因的免疫脂質體。進一步，步驟a中PCR擴增的循環條件參數為95°C預變性10分鐘，然后94°C變 性1分鐘、58 °C退火1分鐘、72 °C延伸4分鐘，共30個循環，最后72°C延伸10分鐘。3、所述基于Isthmin基因的免疫脂質體在制備抗腫瘤血管生成的藥物中的應用。進一步，所述腫瘤為結腸癌。本發明的有益效果在于本發明將Isthmin重組真核表達載體有效地包封在脂 質體中形成納米級顆粒，并且與抗第VIII因子相關抗原單克隆抗體相連接，制成免疫脂質 體。第VIII因子相關抗原(VWF)主要表達于血管內皮細胞，是血管生成標志性抗原。因此， 本發明的免疫脂質體可以主動靶向腫瘤新生血管內皮細胞，在細胞中釋放出Isthmin重組 真核表達載體并表達Isthmin，從而發揮抗腫瘤血管生成的作用，具有高效、低毒、制備方法 簡單等優點，可以用于制備抗腫瘤血管生成的藥物，在抑制腫瘤血管生成方面具有良好的 應用前景。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測Isthmin基因的PCR產物；圖2為Western blot檢測包封有Isthmin重組真核表達載體的脂質體；圖3為透射電子顯微鏡觀察基于Isthmin基因的免疫脂質體；
圖4為各組細胞的增殖抑制率；圖5為各組荷瘤裸鼠的腫瘤生長曲線；圖6為各組荷瘤裸鼠的平均生存率；圖7為免疫組化法檢測各組荷瘤裸鼠的腫瘤新生血管密度。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、基于Isthmin基因的免疫脂質體(Anti-vWF-Lip-Isthmin)的制備1、Isthmin重組真核表達載體的制備與檢測(1) Isthmin重組真核表達載體的制備取小鼠脾臟組織，加入液氮充分研磨后，稱取IOOmg置無RNA酶的離心管中，采用 RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)提取血管內皮細胞總RNA，按照試劑盒說明書操作。根據GenBank登錄號為NM_001126490的Isthmin基因序列設計1對特異性引物， 在每條引物的5’端加上保護堿基，再在其后引入限制性內切酶識別序列，引物序列如下 上游引物5，-gcggccgcatggtgcgcctggctgc-3，(SEQ ID No. 2)，下劃線部分為 Not I 酶切 位點；下游引物5，-tctagattagtactctctggcttcttgg-3，(SEQ IDNo. 3)，下劃線部分為 Xba I酶切位點；設計的引物委托上海生工公司進行合成。采用RT-PCR逆轉錄擴增試劑盒(TaKaRa公司)將血管內皮細胞總RNA逆轉錄 為cDNA，再以該cDNA為模板，采用上述特異性引物進行PCR擴增，按照試劑盒說明書操作； PCR擴增的循環條件參數為95°C預變性10分鐘，然后94°C變性1分鐘、58°C退火1分鐘、 72°C延伸4分鐘，共30個循環，最后72°C延伸10分鐘；PCR產物用濃度為10g/L的瓊脂糖 凝膠電泳進行鑒定(如圖1所示，其中M泳道為DNA分子量標準，1泳道為PCR產物，可見1 泳道在約1400bp處有一特異性條帶，與目的片段的分子量大小相符)，再用膠回收試劑盒 (TIANGEN公司)切膠回收純化目的片段，按照試劑盒說明書操作，即得兩端帶有Not I和 Xba I酶切位點的Isthmin基因。將兩端帶有Not I和Xba I酶切位點的Isthmin基因用Not I和Xba I (TaKaRa 公司)雙酶切，雙酶切產物經純化后，與同樣經Not I和Xba I雙酶切的真核表達載體 p3xFLAG-CMV-14 (Sigma-Aldrich公司)在T4DNA連接酶(TaKaRa公司)的作用下連接，連接 產物轉化大腸桿菌DH5 α (TIANGEN公司)感受態細胞，用含有氨芐青霉素(AMP)的LB平板 篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落，接種于含有AMP的LB液體培養基中，溫度37°C振搖培 養12小時，用質粒小量提取試劑盒(TIANGEN公司)提取質粒，按照試劑盒說明書操作，所 得質粒采用雙酶切法和PCR法鑒定并委托上海生工公司進行測序驗證，在p3xFLAG-CMV-14 的Not I和Xba I位點之間插入有與SEQ ID No. 1所示核苷酸序列完全一致的DNA片段的陽性克隆質粒即為Isthmin重組真核表達載體p3xFLAG-CMV-14/Isthmin。取含有p3xFLAG-CMV_14/Isthmin的大腸桿菌DH5 α (陽性克隆)，接種于含有AMP的LB液體培養基中，溫度37°C振搖培養過夜，待培養液的光吸收值0D490nm達到1 1.5 時，采用超純質粒抽提試劑盒(TIANGEN公司)大量抽提質粒，按照試劑盒說明書操作，所得質粒用超純水溶解，即得p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，用紫外分光光度計測定其A260值和A280值，根據A260/A280值估算其純度約1. 0，根據A260值計算其質量濃度約1. Omg/
mLo(2) Isthmin重組真核表達載體的檢測Western blot檢測將cos_7細胞接種于6孔板中，用PRIM 1640培養基在溫度為37°C、CO2氣體體積分數為5 %的條件下培養24小時，待細胞融合率達到約80 %時，采用脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000 將 p3xFLAG_CMV_14/Isthmin 轉染入 cos_7 細胞，按照試劑說明書操作，同時設空載體對照，轉染4小時后，將培養液更換為I3RIM 1640培養基，繼續培養48小時，收集細胞，用PBS洗滌并重懸，超聲裂解細胞，離心收集上清液，采用His Bind融合蛋白純化試劑盒純化帶有His標簽的Isthmin，按照試劑盒說明書操作。取純化蛋白溶液，采用質量百分濃度為5%的濃縮膠、質量百分濃度為12.5%的分離膠進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后電轉印PVDF膜，用脫脂奶封閉1小時后，加入兔抗小鼠Isthmin多克隆抗體，37°C孵育1小時，PBST洗膜后，再加入羊抗兔IgG，37°C孵育1小時，PBST洗膜后，再加入發光底物，37°C孵育1分鐘，暗室中用X光片曝光，顯影，定影，觀察p3XFLAG-CMV-14/Isthmin在真核細胞中的表達。結果見圖2，其中1泳道為從p3xFLAG-CMV-14/Isthmin轉染的cos-7細胞中提取并純化的蛋白溶液，2泳道為從p3xFLAG-CMV-14轉染的cos-7細胞中提取并純化的蛋白溶液；從圖可知，1泳道有一特異的蛋白質條帶，與Isthmin的預期分子量大小一致，而2泳道無相應條帶，表明p3xFLAG-CMV-14/Isthmin可以在真核細胞中正確表達Isthmin。2、包封有Isthmin重組真核表達載體的脂質體(Lip-Isthmin)的制備與檢測(I)Lip-Isthmin 的制備采用逆向蒸發法制備將卵磷脂2g和膽固醇0. 4g溶解于乙醚60mL中，減壓蒸餾除去有機溶劑，水浴超聲5分鐘，再加入濃度為0. 5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液20mL，在42°C水浴和干冰中反復凍融，并連續數次通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器(上海光健公司)，未包封入脂質體的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III (上海亞培公司)于37°C作用1小時后用乙二胺四乙酸終止反應，用瓊脂糖凝膠CL-4B柱(北方偉業公司)分離Lip-Isthmin和被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin(由于脂質體比p3xFLAG-CMV-14/Isthmin大，因此可通過凝膠過濾色譜將二者分離)。(2) Lip-Isthmin 的檢測透射電鏡觀察將Lip-Isthmin用濃度為3g/L的磷鎢酸溶液負染后，滴至專用銅網上，自然風干，置透射電子顯微鏡下觀察脂質體的形態結構和粒徑分布。結果如圖3所示，所得Lip-Isthmin為球形或近球形小囊泡，粒徑分布范圍為50 120nm，平均粒徑低于 IOOnm0瓊脂糖凝膠電泳檢測將相同質量的p3XFLAG-CMV-14/ISthmin、經反復凍融的脂質體、通過IOOnm薄膜擠出器的脂質體以及經核酸酶消化的脂質體同時進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，可見經核酸酶Dnase I和exonuclease III處理后，未包封入脂質體的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin已經被降解，而脂質體能夠抵抗核酸酶的降解。同時通過Gel pro analyzer 4. O software軟件比較凝膠圖中DNA的條帶亮度，計算總DNA量和未包封入脂 質體的DNA量，再根據公式包封率=[(總DNA量-未包封入脂質體的DNA量)/總DNA 量]X 100%，計算得到 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 的包封率約為 82. 3%。3, Anti-vffF-Lip-Isthmin 的制備與檢測(l)Anti-vffF-Lip-Isthmin 的制備將小鼠抗人vWF單克隆抗體(SantaCruz公司)經巰基化修飾后，與Lip-Isthmin 在室溫下輕搖連接過夜，用瓊脂糖凝膠CL-4B柱分離Anti-vWF-Lip-Isthmin和未連接的抗 vWF單克隆抗體(由于免疫脂質體比抗體大，因此可通過凝膠過濾色譜將二者分離)。(2)Anti-vWF-Lip-Isthmin 的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測分別向收集到的Anti-vWF-Lip-Isthmin和未連接的抗 vWF單克隆抗體中，加入濃度為5g/L的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(SDS能破壞脂質體 的膜表面結構，從而使脂質體釋放內部的包裹物)，同時設置不加入SDS的空白對照，混 勻靜置，取上清液進行濃度為5g/L的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，可見加入SDS的 Anti-vWF-Lip-Isthmin有一明亮的DNA條帶，而加入SDS的抗vWF單克隆抗體無相應條帶 出現。酶聯免疫吸附(ELISA)檢測將收集到的Anti-vWF-Lip-Isthmin和未連接的抗 vWF單克隆抗體分別包被96孔板，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG為一抗做 直接ELISA實驗，以確定脂質體表面是否已連接上抗體，結果Anti-vWF-Lip-Isthmin和未 連接的抗vWF單克隆抗體都呈陽性反應，說明脂質體表面已連接上抗體。二、基于Isthmin基因的免疫脂質體抗腫瘤血管生成作用檢測1、體外抗血管生成作用MTT比色法檢測分別將處于指數生長期的正常細胞DC2. 4和人臍靜脈血管內皮 細胞HUVEC用含有濃度為100g/L的新生牛血清的完全培養基制成細胞密度為1 X 106/mL的 懸液，接種至96孔板，每孔100 μ L，分成兩組對照組和實驗組，每組設3個復孔，對照組每 孔加入完全培養液100 μ L ；實驗組每孔加入終濃度為1 μ g/mL的基于Isthmin基因的免疫 脂質體100 μ L ；在溫度為37°C、C02氣體體積分數為5%的條件下培養72小時，每孔再加入 濃度為5g/L的MTT 20 μ L，繼續培養4小時，吸去上清，每孔再加入二甲基亞砜150 μ L，輕 搖10分鐘，用酶標儀在波長490nm處測定各孔OD值，計算細胞增殖抑制率。結果如圖4所示，基于Isthmin基因的免疫脂質體對DC2. 4細胞的增殖抑制率為 9%，對HUVEC細胞的增殖抑制率為74%，表明本發明的免疫脂質體能夠有效抑制血管內皮 細胞的增殖。2、體內抗血管生成作用將荷瘤(結腸癌細胞CT-26)裸鼠隨機分為三組對照組I、對照組II和實驗組， 對照組I尾靜脈注射生理鹽水；對照組II尾靜脈注射包封有P3XFLAG-CMV-14的免疫脂質 體；實驗組尾靜脈注射基于Isthmin基因的免疫脂質體；每次100 μ L，每周1次，連續給藥 3次；觀察60天內各組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；同時，取小鼠體內腫 瘤組織，用免疫組化法檢測腫瘤新生血管密度(以抗⑶31單克隆抗體為一抗)。
各組荷瘤裸鼠的腫瘤生長曲線如圖5所示，第30天時，對照組I和對照組II 的小鼠腫瘤體積分別為2000mm3和1800mm3，而實驗組小鼠腫瘤生長緩慢，腫瘤體積僅為 1200mm3 ；各組荷瘤裸鼠的生存率如圖6所示，對照組I和對照組II的小鼠分別于第30天 和第35天全部死亡，而實驗組小鼠60天的生存率為60%，與對照組I和對照組II相比，實 驗組小鼠生存率高；各組荷瘤裸鼠的腫瘤新生血管密度檢測結果如圖7所示，第30天時，對 照組I和對照組II的小鼠⑶31陽性細胞數為35個，而實驗組小鼠的⑶31陽性細胞數為 12個，與對照組I和對照組II相比，實驗組小鼠的腫瘤新生血管密度低。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明 的精神和范圍。
權利要求
基于Isthmin基因的免疫脂質體，其特征在于由包封有Isthmin重組真核表達載體的脂質體與抗第VIII因子相關抗原單克隆抗體共價結合而成。
2.根據權利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質體，其特征在于所述Isthmin 重組真核表達載體是將核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的Isthmin基因插入真核表達載體 p3xFLAG-CMV-14的多克隆位點中而得到。
3.根據權利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質體，其特征在于所述脂質體 由卵磷脂和膽固醇組成。
4.權利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質體的制備方法，其特征在于包括 以下步驟a、Isthmin重組真核表達載體的制備提取小鼠脾臟組織血管內皮細胞總RNA，逆轉 錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3所示 的上、下游引物進行PCR擴增，所得PCR產物經純化后，用Not I和Xba I雙酶切，再與同 樣經Not I和Xba I雙酶切的真核表達載體p3xFLAG-CMV-14在T4DNA連接酶的作用下連 接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克 隆，提取質粒進行鑒定，在p3xFLAG-CMV-14的Not I和Xba I位點之間插入了核苷酸序 列如SEQID No. 1所示的Isthmin基因的陽性克隆質粒即為Isthmin基因重組真核表達 載體 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；將含有 p3xFLAG-CMV_14/Isthmin 的大腸桿菌 DH5 α 接種 于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中進行增菌培養，大量抽提質粒，用超純水溶解，即得 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 溶液；b、Isthmin重組真核表達載體的脂質體包封將卵磷脂和膽固醇溶解于乙醚中，減壓 蒸餾除去有機溶劑，水浴超聲，再加入p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，在42°C水浴和干 冰中反復凍融并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器，未包封入脂質體的p3xFLAG-CMV-14/ Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解，再用瓊脂糖凝膠CL-4B柱分離除去被 核酸酶降解的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；c、包封有Isthmin重組真核表達載體的脂質體與抗第VIII因子相關抗原單克隆抗體 的連接將抗第VIII因子相關抗原單克隆抗體經巰基化修飾后，與包裹Isthmin基因重組 真核表達載體的脂質體在室溫下振搖連接過夜，再用瓊脂糖凝膠柱分離除去未連接的抗第 VIII因子相關抗原單克隆抗體，即得基于Isthmin基因的免疫脂質體。
5.根據權利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質體的制備方法，其特征在于 步驟a中PCR擴增的循環條件參數為95°C預變性10分鐘，然后94°C變性1分鐘、58°C退 火1分鐘、72 °C延伸4分鐘，共30個循環，最后72°C延伸10分鐘。
6.權利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂質體在制備抗腫瘤血管生成的藥物中 的應用。
7.根據權利要求6所述的基于Isthmin基因的免疫脂質體的應用，其特征在于所述 腫瘤為結腸癌。
全文摘要
本發明公開了一種基于Isthmin基因的免疫脂質體及其制備方法和應用，該免疫脂質體由包封有Isthmin重組真核表達載體的脂質體和抗第VIII因子相關抗原單克隆抗體共價結合而成；其制備方法包括Isthmin重組真核表達載體的制備、Isthmin重組真核表達載體的脂質體包封、包封有Isthmin重組真核表達載體的脂質體與抗第VIII因子相關抗原單克隆抗體的連接共3個步驟；該免疫脂質體可以主動靶向腫瘤新生血管內皮細胞，在細胞中釋放出Isthmin重組真核表達載體并表達Isthmin，從而發揮抗腫瘤血管生成的作用，具有高效、低毒、制備方法簡單等優點，可用于制備抗腫瘤血管生成的藥物。
文檔編號A61K9/127GK101797229SQ20101010295
公開日2010年8月11日 申請日期2010年1月29日 優先權日2010年1月29日
發明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學