一種淡竹葉精制總黃酮的制備方法

專利名稱：：一種淡竹葉精制總黃酮的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種總黃酮的提取分離方法，具體涉及一種從淡竹葉中提取分離得到精制總黃酮的制備方法。
背景技術：
：中藥淡竹葉(HerbaLophatheri)為禾本科(Gramineae)植物淡竹葉(LophatherumgracileBrongn.)的干燥莖葉。本品性寒，味甘、淡，歸心、胃、小腸經，有清熱除煩，利尿的功效，用于熱病煩渴，小便赤澀淋痛，口舌生瘡。淡竹葉中含有大量的黃酮、多糖、內酯、葉綠素、氨基酸、維生素和微量元素等成分，淡竹葉中的黃酮類化合物具有較高的生物活性，可用于治療心血管疾等疾病。目前，在淡竹葉的研究方面檢索到3項發明創造，分別為申請號為02114071.5的淡竹葉飲料，該發明公開了一種竹子和淡竹葉的營養成分，是一種清涼飲料，適合高血壓、高血脂、糖尿病、痔瘡和肥胖人士飲用；申請號為200910059831.5的中國專利公開了一種絞股藍淡竹葉SOD抗癌保健飲料及其制備方法，將生物技術與中草藥相結合，發現絞股藍皂苷、竹葉黃酮、茶葉多酚及超強抗氧化自由基清除劑超氧化物歧化酶協同抗癌作用，還具有防治心腦血管疾病、糖尿病、美容、健身等多功效；申請號為200910023279.4的中國專利公開了淡竹葉黃酮在制備治療低血壓的藥物用途，發現淡竹葉黃酮有明顯的收縮動脈和升高血壓的作用，并通過實驗證明了其具有治療低血壓的功效。現有技術中淡竹葉黃酮的提取純化分離技術尚無專利報道，雖然現有技術中分離純化黃酮的方法較多，主要有色譜法，但是不同植物中含有的黃酮種類和結構都存在很大的差別，從而化學性質存在差異，在提取純化過程中套用一般的提取純化方法，得到的黃酮的純度不高，如要達到很高的純度，其分離效率較低，成本較高，目前針對淡竹葉提取純化高純度的黃酮的方法沒有報道，且淡竹葉里含有的特有結構類型的黃酮，由于其活性強很有利用價值，因此為了充分利用資源，滿足市場需求，很有必要研發出一套提取純化效率高、成本低、且黃酮含量高的制備方法。
發明內容發明目的本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種淡竹葉精制總黃酮的制備方法。技術方案為了實現以上目的，本發明提供的淡竹葉精制總黃酮的制備方法，具體包括以下步驟(1)取新鮮淡竹葉揀選、洗凈、干燥后放入提取罐中，加510倍量的水，加熱回流13次，過濾、合并提取液，濃縮，得淡竹葉的水提液備用；(2)取步驟(1)得到的淡竹葉水提液加入乙醇使淡竹葉水提液中乙醇的濃度達到65%75%，靜置、沉淀，濾出溶液，濃縮，得淡竹葉水提液的醇沉液待用；(3)取步驟(2)得到的淡竹葉醇沉液上大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50%55%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識、收集50%55%乙醇洗脫液、3濃縮、減壓干燥得到淡竹葉總黃酮的粗提物，備用；(4)取步驟(3)得到的淡竹葉總黃酮的粗提物干法上聚酰胺柱，先分別用水和20%乙醇洗脫，再用濃度為50%55%乙醇洗脫，薄層色譜檢識、并收集50%55%乙醇洗脫液，濃縮，經減壓干燥得到淡竹葉總黃酮；(5)取步驟(4)得到的淡竹葉總黃酮采用制備液相進一步富集總黃酮，得到總黃酮含量為90%99%的淡竹葉精制總黃酮。以上所述的制備方法，作為優選方案，步驟(1)中提取條件為加10倍量水，加熱到80°C持續回流2小時，此操作步驟在加熱回流提取過程中以80°C持續回流2小時，可以確保總黃酮提取較完全的同時不會破壞淡竹葉中活性黃酮的結構，經成分結構研究和藥理活性表明在110°C左右高溫下淡竹葉中部分活性黃酮的結構會發生變化，如由原來的黃酮變成查兒酮，從而活性降低，因此本發明在提取總黃酮就嚴格控制提取的溫度可以保證黃酮結構的穩定性。作為優選方案，步驟(2)中淡竹葉水提液加入高濃度的乙醇后淡竹葉水提液中乙醇的濃度為75%，此步驟操作的目的是為了除去淡竹葉水提液中的大分子化合物如多糖，鞣質等成分，便于后面的純化工藝，可以大大提高純化效率，當然最后淡竹葉水提液中乙醇的濃度不能太高也不能太低，如果濃度過高，會使一部分極性很大的黃酮苷成分沉淀，從而降低總黃酮的含量。以上所述的制備方法，作為優選方案，步驟(3)中所述的大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂，作為更優的方案，所述的非極性大孔吸附樹脂采用DlOl型大孔吸附樹月旨，本發明通過正交實驗篩選不同極性不同型號的大孔樹脂、不同濃度(10%、20%、40%、50%,60%)的乙醇洗脫劑，以總黃酮的含量為指標，采用紫外比色法測定總黃酮的含量，實驗結果表明以非極性大孔吸附樹脂DlOl型大孔吸附樹脂除雜效果比較好，且實驗結果表明濃度為10%的乙醇可以洗脫大部分極性稍大的雜質，但是對黃酮成分的洗脫能力弱，紫外檢測結果表明黃酮含量很低僅1%，而濃度為50%的乙醇對總黃酮的洗脫能力最好，基本可以洗脫吸附的所有黃酮類成分，但是隨著乙醇濃度的增加，雖然能夠洗脫出黃酮，但是同時也會把一些其它雜質一起洗脫下來，使黃酮的純度降低，因此本發明經正交實驗篩選結果確定出最佳的吸附材料為DlOl型大孔吸附樹脂和洗脫劑為濃度為50%的乙醇；且步驟(3)先用純水沖洗大孔樹脂可以洗脫掉大部分極性大的水溶性雜質，有利于后續的純化。本發明在用50%乙醇洗脫黃酮類成分時以薄層色譜作為檢識手段，所用的薄層板為聚酰胺薄層板，展開劑由體積比為2.24.82.51.00.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水組成，該展開劑具有很好分離淡竹葉水提液成分，展開后薄層色譜斑點清晰，分離效果好，Rf值適中，顯色劑為10%三氯化鋁，并在365nm紫外燈下檢視，合并具有黃酮類成分的流份，去除不含黃酮類成分的流份，因此分離的目的性強。以上所述的制備方法，作為優選方案，步驟(4)中所述的聚酰胺樹脂色譜純化黃酮所用的聚酰胺樹脂的粒徑為60-80目，聚酰胺樹脂對淡竹葉中的黃酮類化合物是一種很好的分離材料，可以選著性的分離淡竹葉中含有的黃酮，淡竹葉中含有的黃酮大多含有酚羥基可以和聚酰胺樹脂形成較強的氫鍵吸附作用，從而可以和其它不具黃銅結構的成分分離，本發明也考察了10%、20%、40%、50%、60%不同濃度乙醇對黃酮類化合物在聚酰胺樹脂柱上的解吸附能力，以總黃酮的含量為指標，采用紫外比色法測定總黃酮的含量，實驗結果表明20%以下乙醇對黃酮的洗脫能力較弱，但是可以去除大部分極性大的雜質，因此本發明首先采用20%乙醇去雜，實驗結果表明濃度為5060%的乙醇對淡竹葉中黃酮化合物具有很好的洗脫能力，幾乎可以洗脫所有黃酮類化合物，同樣實驗結果發現隨著乙醇濃度的增加，雖然能夠洗脫出黃酮，但是同時也會把一些其它雜質一起洗脫下來，使黃酮的純度降低，最終選用5060%的乙醇洗脫聚酰胺柱，并用薄層色譜作為檢識手段，所用的薄層板為聚酰胺薄層板，展開劑由體積比為2.24.82.51.00.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水組成，該展開劑具有很好分離淡竹葉水提液成分，展開后薄層色譜斑點清晰，分離效果好，Rf值適中，顯色劑為10%三氯化鋁，并在365nm紫外燈下檢視，合并具有黃酮類成分的流份，去除不含黃酮類成分的流份，以上所述的制備方法，經過醇沉、大孔吸附樹脂和聚酰胺聯合樹脂除雜后得到淡竹葉總黃酮，以三氯化鋁作為顯色劑紫外比色法檢測總黃酮的含量已達到了60%以上，為了進一步純化總黃酮，除去成分不明的雜質，保證總黃酮的質量，本發明繼續通過制備液相方法富集總黃酮，其色譜條件為色譜柱選用安捷倫反相C18柱，流動相經方法學考察以甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，作為優選，梯度洗脫的條件為0至30分鐘，甲醇的含量由5%上升到50%，30至60分鐘甲醇的含量由50%上升到88%，在此流動相條件下，經聚酰胺柱色譜純化后淡竹葉總黃酮在色譜柱上能夠完全分離，重復性好，能夠很好分段收集所需部位，大大提高純化效率，且檢測波長選用283nm和331nm，流速為5ml/min，檢測器為二極管陳列檢測器，本發明在選用檢測波長上，根據淡竹葉含有黃酮的結構類型，經全波長掃描后，通過3D吸收線觀測，發現淡竹葉含有的總黃酮在283nm和331nm的檢測波長下都有很大吸收，因此本發明以在283nm和331nm的檢測波長下都有很大吸收的峰作為黃酮類化合物特征吸收峰，本發明利用二極管陳列檢測器，采用雙波長同時檢測的方法確定黃酮類化合物的峰，有目的，有針對性的收集流份，去除非黃酮類化合物的流份，最后合并得到純度高的淡竹葉精制總黃酮，含量檢測總黃酮的含量可以達到9099%。有益效果本發明提供的淡竹葉精制總黃酮的制備方法和現有技術相比具有以下優點(1)本發明提供的制備方法可操作性強，提取分離效率高，分離得到的淡竹葉總黃酮含量高，并且制備工藝中能量消耗少，生產成本低，對環境無污染。(2)本發明提供的淡竹葉精制總黃酮的制備方法的制備方法，較系統的考察了，提取溫度對總黃酮質量的影響，確定題卻溫度80°C；在分離過程中本發明首次采用大孔樹脂和聚酰胺樹脂聯用的方法純化總黃酮，確定最佳的大孔樹脂材料和聚酰胺材料，尤其在洗脫劑方面，重點考察了不同濃度的乙醇的洗脫能力，確定洗脫工藝，先用20%乙醇除雜，再用對總黃酮洗脫能力強對雜質洗脫能力弱的50%乙醇洗脫，可以最大程度得到純度高的總黃酮，使純化效率提高，另外本發明再用制備液相純化總黃酮，用方法學考察確定流動相，并采用淡竹葉中黃酮類化合物特有吸收波長，有針對性、高效率的分離純化總黃酮，能得到純度達9099%的總黃酮，且通過對照品確定所得到的精制淡竹葉總黃酮中日當藥黃素含量較高。具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1一種淡竹葉精制總黃酮的制備方法，具體包括以下步驟(1)取新鮮淡竹葉15千克揀選、洗凈、干燥后放入放入多功能提取罐中，加10倍量的水，在80°C下加熱回流2次，過濾、合并提取液，濃縮，得淡竹葉的水提液備用；(2)取步驟(1)得到的淡竹葉水提液加入95%乙醇使淡竹葉水提液中乙醇的濃度達到75%，靜置過夜、沉淀，濾出溶液，濃縮，得淡竹葉水提液的醇沉液待用；(3)取步驟(2)得到的淡竹葉醇沉液上DlOl型大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫樹脂柱，再用濃度為50%的乙醇洗脫，用聚酰胺薄層板點樣，以體積比為2.24.82.51.00.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水組成的展開劑展開，再用10%三氯化鋁顯色劑顯色，并在365nm紫外燈下檢視、收集合并50%乙醇洗脫液中含有黃酮的流份、濃縮、減壓干燥得到淡竹葉總黃酮的粗提物1200克，紫外比色法檢測總黃酮含量為31%，備用；(4)取步驟(3)得到的淡竹葉總黃酮的粗提物干法上6080目的聚酰胺柱，先分別用水和20%乙醇洗脫除雜，再用濃度為50%乙醇洗脫，用步驟(3)相同的薄層色譜檢識、并收集合并50%乙醇洗脫液中含有黃酮成分的流份，濃縮，經減壓干燥得到淡竹葉總黃酮600克，紫外比色法檢測總黃酮含量為62%；(5)取步驟(4)得到的淡竹葉總黃酮采用制備液相進一步富集總黃酮，其色譜條件為色譜柱選用安捷倫反相C18柱，流動相以甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，梯度洗脫的條件為0至30分鐘，甲醇的含量由5%上升到50%，30至60分鐘甲醇的含量由50%上升到88%，檢測波長選用283nm和331nm雙波長檢測，流速為5ml/min，檢測器為二極管陳列檢測器，有目的，有針對性的收集黃酮類化合物流份，最后合并得到純度為99%的淡竹葉精制總黃酮330克。實施例2—種淡竹葉精制總黃酮的制備方法，具體包括以下步驟(1)取新鮮淡竹葉50千克揀選、洗凈、干燥后放入放入多功能提取罐中，第一次用10倍量的水，在80°C下加熱回流，第二次用6倍量的水，在80°C下加熱回流，過濾、合并二次的提取液，濃縮，得淡竹葉的水提液備用；(2)取步驟(1)得到的淡竹葉水提液加入95%乙醇使淡竹葉水提液中乙醇的濃度達到70%，靜置過夜、沉淀，濾出溶液，濃縮，得淡竹葉水提液的醇沉液待用；(3)取步驟(2)得到的淡竹葉醇沉液上DlOl型大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫樹脂柱，再用濃度為55%的乙醇洗脫，用聚酰胺薄層板點樣，以體積比為2.24.82.51.00.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水組成的展開劑展開，再用10%三氯化鋁顯色劑顯色，并在365nm紫外燈下檢視、收集合并55%乙醇洗脫液中含有黃酮的流份、濃縮、減壓干燥得到淡竹葉總黃酮的粗提物4000克，紫外比色法檢測總黃酮含量為32%，備用；(4)取步驟(3)得到的淡竹葉總黃酮的粗提物干法上6080目的聚酰胺柱，先分別用水和20%乙醇洗脫除雜，再用濃度為55%乙醇洗脫，用步驟(3)相同的薄層色譜檢識、并收集合并55%乙醇洗脫液中含有黃酮成分的流份，濃縮，經減壓干燥得到淡竹葉總黃酮2100克，紫外比色法檢測總黃酮含量為60%；(5)取步驟(4)得到的淡竹葉總黃酮采用制備液相進一步富集總黃酮，其色譜條件為色譜柱選用安捷倫反相C18柱，流動相以甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，梯度洗脫的條件為0至30分鐘，甲醇的含量由5%上升到50%，30至60分鐘甲醇的含量由50%上升到88%，檢測波長選用283nm和331nm雙波長檢測，流速為5ml/min，檢測器為二極管陳列檢測器，有目的，有針對性的收集黃酮類化合物流份，最后合并得到純度為99.5%的淡竹葉精制總黃酮850克。實施例3不同濃度乙醇洗脫大孔樹脂吸附的黃酮類化合物的能力比較本實驗考察了10%、20%、40%、50%、60%不同濃度的乙醇洗脫黃酮化合物的能力和洗脫下來黃酮化合物的純度，以總黃酮的含量為指標，采用紫外比色法，以吸光度對濃度做標準曲線Y=236.5X+112.4測定總黃酮的百分含量，具體實驗結果如表1所示表1不同濃度的乙醇洗脫黃酮化合物的能力情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實驗結果表明濃度為10%的乙醇可以洗脫大部分極性稍大的雜質，但是對黃酮成分的洗脫能力弱，紫外檢測結果表明黃酮含量很低僅1%，而濃度為50%的乙醇對總黃酮的洗脫能力最好，基本可以洗脫吸附的所有黃酮類成分，但是隨著乙醇濃度的增加，雖然能夠洗脫出黃酮，但是同時也會把一些其它雜質一起洗脫下來，使黃酮的純度降低，因此本發明經實驗篩選結果確定大孔樹脂柱的最佳洗脫劑為濃度為50%的乙醇。實施例4不同濃度乙醇洗脫聚酰胺樹脂吸附的黃酮類化合物的能力比較本實驗考察了10%、20%、40%、50%、60%不同濃度的乙醇洗脫黃酮化合物的能力和洗脫下來黃酮化合物的純度，以總黃酮的含量為指標，采用紫外比色法，以吸光度對濃度做標準曲線Y=236.5X+112.4測定總黃酮的百分含量，具體實驗結果如表2所示表2不同濃度的乙醇洗脫黃酮化合物的能力情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實驗結果表明濃度為20%的乙醇可以洗脫大部分極性稍大的雜質，但是對黃酮成分的洗脫能力弱，紫外檢測結果表明黃酮含量很低僅5%左右，而濃度為50%的乙醇對總黃酮的洗脫能力最好，基本可以洗脫吸附的所有黃酮類成分，但是隨著乙醇濃度的增加，雖然能夠洗脫出黃酮，但是同時也會把一些其它雜質一起洗脫下來，使黃酮的純度降低，因此本發明經實驗篩選結果確定聚酰胺樹脂柱的最佳洗脫劑為濃度為50%的乙醇。權利要求一種淡竹葉精制總黃酮的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)取新鮮淡竹葉揀選、洗凈、干燥后放入提取罐中，加5～10倍量的水，加熱回流1～3次，過濾、合并提取液，濃縮，得淡竹葉的水提液備用；(2)取步驟(1)得到的淡竹葉水提液加入乙醇使淡竹葉水提液中乙醇的濃度達到65％～75％，靜置、沉淀，濾出溶液，濃縮，得淡竹葉水提液的醇沉液待用；(3)取步驟(2)得到的淡竹葉醇沉液上大孔樹脂柱，先分別用水和濃度為10％乙醇洗脫，再用濃度為50％～55％的乙醇洗脫，薄層色譜檢識、收集50％～55％乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到淡竹葉總黃酮的粗提物，備用；(4)取步驟(3)得到的淡竹葉總黃酮的粗提物干法上聚酰胺柱，先分別用水和20％乙醇洗脫，再用濃度為50％～55％乙醇洗脫，薄層色譜檢識、并收集50％～55％乙醇洗脫液，濃縮，經減壓干燥得到淡竹葉總黃酮；(5)取步驟(4)得到的淡竹葉總黃酮采用制備液相進一步富集總黃酮，得到總黃酮含量為90％～99％的淡竹葉精制總黃酮。2.根據權利要求1所述的淡竹葉精制總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟(1)中提取條件為加10倍量水，加熱到80°C持續回流2小時。3.根據權利要求1所述的淡竹葉精制總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟(2)中淡竹葉水提液加入乙醇后淡竹葉水提液中乙醇的濃度為75%。4.根據權利要求1所述的淡竹葉精制總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂。5.根據權利要求4所述的淡竹葉精制總黃酮的制備方法，其特征在于，所述的非極性大孔吸附樹脂為D101型大孔吸附樹脂。6.根據權利要求1所述的淡竹葉精制總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的聚酰胺樹脂的粒徑為60-80目。7.根據權利要求1所述的淡竹葉精制總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟(3)和步驟(4)中所述的薄層色譜檢識所用的薄層板為聚酰胺薄層板，展開劑由體積比為2.24.82.51.00.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水組成，顯色劑為10%三氯化鋁。8.根據權利要求1所述的淡竹葉精制總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述的制備液相富集總黃酮的色譜條件為色譜柱為安捷倫反相C18柱，流動相為甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測波長為283nm和331nm，流速為5ml/min，檢測器為二極管陳列檢測器o全文摘要本發明公開了一種淡竹葉精制總黃酮的制備方法，該制備方法確定了最佳提取溫度，分離材料，洗脫劑濃度，首次采用大孔樹脂和聚酰胺樹脂聯用的方法純化總黃酮，然后采用制備液相精制總黃酮，用方法學考察確定流動相，并采用淡竹葉中黃酮類化合物特有的雙吸收波長，有針對性、高效率的分離純化總黃酮，能得到純度達90～99％的總黃酮，本發明提供的總黃酮的制備方法可操作性強，較傳統的分離純化方法分離效率更高，且分離得到的淡竹葉總黃酮含量高，并且制備工藝中能量消耗少，生產成本低，對環境無污染。文檔編號A61K36/899GK101797344SQ20101014803公開日2010年8月11日申請日期2010年4月16日優先權日2010年4月16日發明者劉明,吳啟南,周婧,梁僑麗,鄔云霞,邵瑩申請人:南京中醫藥大學