藍莓中總黃酮含量的測定的制作方法
【專利摘要】本發公開了一種藍莓果實中總黃酮含量測定的一種方法。其技術要點主要包括以下幾個步驟：1)藍莓中總黃酮的提取方法；2)測定總黃酮顯色劑的制備；3)對照品溶液的配制；4)對照品最大吸收波長的確定；5)標準曲線的建立；6)樣品總黃酮含量測定。本發明方法操作簡便，成本較低，檢測時間較短，精密度較高，重現性良好，穩定性較強。
【專利說明】
藍莓中總黃酮含量的測定
技術領域
[0001] 本發明屬于分析化學技術領域，具體涉及一種藍莓果實中總黃酮含量測定的方 法。
【背景技術】
[0002] 藍莓是當今最流行的五大健康食品之一，其果實的品質優劣是由風味和營養價值 來綜合體現。風味主要與含有的有機酸及糖的量及其比例有關，決定著口感。而營養價值主 要體現在藍莓中總黃酮及總酚的含量方面。藍莓的莖、枝葉及果實中含有大量的多酚類物 質，主要包括黃酮醇類、花色素類和酚酸類成分。
[0003] 黃酮類化合物是一大類天然產物，是許多中草藥的有效成分。它的存在形式有兩 種，一種是游離的苷元，另一種是與糖等結合的苷。許多研究已表明黃酮類化合物安全、無 毒，其功效是多方面的，它是大多數氧自由基的清除劑，具有很強的抗氧化作用，能改善血 液循環、降低膽固醇。能降低心肌耗氧量，增加冠脈、腦血管血流量，明顯緩解心絞痛、抗心 律失常等，對防治心肌梗塞、心律失常等也有重要療效等諸多功效，還具有抗癌、防癌的作 用，已列為保健食品的一類功能因子。
【發明內容】
[0004] 本發明提供了一種藍莓中總黃酮含量的測定，采用NaN02-Al(N03)3比色法測定了 總黃酮的含量，具有分析速度快，準確度高，重現性好，精密度高，顯色穩定性好等優點。通 過對藍莓果實中總黃酮含量的測定，為藍莓科學食用、品種選育及優良品種推廣奠定理論 基礎。具體實施方案包括以下幾個步驟：
[0005] 種藍莓中總黃酮含量的測定，其特征在于，包括以下幾個步驟：
[0006] (1)藍莓中總黃酮的提取方法
[0007] 精密稱取藍莓鮮果，組織破碎后按料液比1:10-15比例加入含有體積分數0.1 %鹽 酸80% (V/V)甲醇溶液，40°C超聲提取30-40min，過濾，濾渣按上述方法再提取一次，合并濾 液;取濾液用旋轉蒸發儀濃縮后加入5倍體積乙酸乙酯進行萃取，萃取3-5次，合并乙酸乙酯 層萃取液，回收乙酸乙酯，濃縮物用80%(V/V)甲醇定容，保存備用；
[0008] (2)測定總黃酮顯色劑的制備
[0009] 配制5wt %的亞硝酸鈉溶液;配制10wt %的硝酸鋁溶液;配制4wt %的氫氧化鈉溶 液；
[0010] (3)對照品溶液的配制
[0011]精密稱取蘆丁對照品，用純水定容，配制成濃度為0.2mg/mL溶液；
[0012] (4)最大吸收波長的確定
[0013] 吸取步驟(3)中所配制蘆丁溶液，按照顯色方法顯色，用紫外-可見分光光度計在 400~600nm范圍內掃描，確定最大吸收波長為500nm;
[0014] (5)蘆丁標準曲線的建立
[0015] 分別量取步驟（3)制備的蘆丁對照品溶液Ο、0.5mL、1. OmL、1.5mL、2. OmL、2.5mL于 10mL容量瓶中，上述溶液分別按照顯色方法顯色后，于最大波長處測定吸光度，以未加對照 品的一組做空白對照；以蘆丁對照品濃度為橫坐標X，吸光度為縱坐標y，建立標準曲線； [0016] (6)藍莓樣品中總黃酮的測定
[0017]精確量取步驟（1)中得到的藍莓樣品提取溶液2.OmL于10ml刻度試管中，按照顯色 方法顯色后，以未加蘆丁試管為空白對照，于最大波長處測定吸光度;重復測定三次，所得 數據計算平均值，對照標準曲線（圖2)可得各品種藍莓樣品中總黃酮的濃度，計算當量mg蘆 丁/g果實；
[0018] 所述步驟（4)、步驟（5)、步驟（6)中，顯色方法為：在待測溶液中加入0.5mL 5 % NaN〇2溶液，混勾放置6min，加入0 · 5mL 10%A1 (N〇3)3溶液，混勾放置6min;加入4 · OmL 4% NaOH溶液，混勻后用80%甲醇溶液稀釋至刻度，混勻放置15min。
[0019] 進一步地，在上述技術方案中，步驟(1)中，藍莓鮮果質量與定容體積的比例為3~ 5g:10mL〇
[0020] 進一步地，在上述技術方案中，步驟(3)中，對照品溶液的配制:精密稱取10.0 mg蘆 丁對照品，用純水定容至50mL容量瓶中。
[0021 ]進一步地，在上述技術方案中，步驟（5)中，標準曲線的線性回歸方程為：y = 10 · 82x-0 · 0038，R2 = 0 · 9995，線性濃度范圍為0 · 01-0 · 05mg/mL。
[0022]進一步地，在上述技術方案中，步驟（2)中，測定總黃酮顯色劑的制備：精密稱取 2.500(^亞硝酸鈉似^)2(分析純），用純水定容至5〇11^容量瓶中，配制成5%亞硝酸鈉溶液； 精密稱取8.8207g硝酸鋁A1(N03)3 · 9H20(分析純），用純水定容至50mL容量瓶中，配制成 10%硝酸鋁溶液;精密稱取4.0000g氫氧化鈉Na0H(分析純），用純水定容至100mL容量瓶中， 配制成4%氫氧化鈉溶液；
[0023]發明有益效果
[0024]優化的方法具有分析速度快，準確度高，重現性好，精密度高，顯色穩定性好等優 點，是一種測定藍莓果實中黃酮含量的理想方法，并可為其他原料中總黃酮含量的測定提 供參考依據。
【附圖說明】
[0025]圖1是對照品蘆丁標準溶液在400~600nm范圍內掃描所得的吸光度值曲線。
[0026]圖2是蘆丁的標準曲線。
【具體實施方式】
[0027]下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以 任何方式限制本發明。下述實施例中所用試劑，如無特殊說明，均為商業途徑獲得;下述實 施例中所用試驗方法，如無特殊說明，均為本領域技術人員熟知的常規實驗方法。
[0028] 實施例1
[0029] -種測定藍莓中總黃酮含量的方法，具體實施方案如下：
[0030] 1.主要儀器
[0031] 紫外可見分光光度計（756MC)，上海菁華科技儀器有限公司；超聲波清洗機（SB- 5200DTD)，寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉蒸發儀(EYELA N-1100)，上海愛朗儀器有 限公司；低溫冷卻液循環栗(DLSB-5/20)，鄭州長城科工貿有限公司；電子天平(ME204/02)， 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。
[0032] 2.方法
[0033] (1)藍莓中總黃酮的提取方法精密稱取藍金藍莓鮮果5.0g，組織破碎后按料液比 1:15比例加入含有體積分數0.1%鹽酸的80%(V/V)甲醇溶液，40°C超聲提取30min，過濾， 濾渣按上述方法再提取一次，合并濾液。取濾液用旋轉蒸發儀濃縮后加入5倍體積乙酸乙酯 進行萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯層萃取液，回收乙酸乙酯，濃縮物用80% (V/V)甲醇定容 至10mL容量瓶，保存備用。
[0034] (2)測定總黃酮顯色劑的制備精密稱取2.5000g分析純亞硝酸鈉(NaN02)，用純水 定容至50mL容量瓶中，配制成5%亞硝酸鈉溶液。精密稱取8.82078分析純硝酸鋁[八1 (Nosh · 9H20]，用純水定容至50mL容量瓶中，配制成10%硝酸鋁溶液。精密稱取4.0000g分 析純氫氧化鈉(NaOH)，用純水定容至100mL容量瓶中，配制成4%氫氧化鈉溶液。
[0035] (3)對照品溶液的配制精密稱取10.0 mg蘆丁對照品，用純水定容至50mL容量瓶中， 配制成濃度為〇. 2mg/mL溶液。
[0036] (4)最大吸收波長的確定吸取步驟（3)中所配制的蘆丁標準溶液2.5mL，加入 0 · 5mL5%NaN02溶液，混勻放置6min，加入0 · 5mL 10 %A1 (N〇3)3溶液，混勻放置6min。加入 4. OmL 4%Na0H溶液，混勻后用80%甲醇溶液稀釋至刻度，混勻放置15min，用紫外-可見分 光光度計在400~600nm范圍內掃描，確定最大吸收波長為500nm(掃描結果見圖1) 〇 [0037] (5 )蘆丁標準曲線的建立分別量取步驟（3)制備的蘆丁對照品溶液0、0.5mL、 1. OmL、1.5mL、2. OmL、2.5mL于1 OmL容量瓶中，分別在上述溶液加入0.5mL 5 % NaN02溶液，混 勻放置6min，加入0 · 5mL 10 % A1 (N〇3)3溶液，混勻放置6min。加入4 · OmL 4 % NaOH溶液，混勻 后用80%甲醇溶液稀釋至刻度，混勻放置15min，于最大波長處測定吸光度，以未加對照品 的一組做空白對照。以蘆丁對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立標準曲線，其線性 回歸方程為:y = 10.82x-0.0038，R2 = 0.9995，線性濃度范圍為0.01-0.05mg/mL(見圖 2)。 [0038] (6)藍莓樣品中總黃酮的測定精確量取藍莓樣品提取溶液2. OmL于10ml刻度試管 中，加入0.5mL5%NaN02溶液，混勻放置6min，加入0.5mL 10%A1 (N〇3)3溶液，混勻放置6min， 加入4.OmL 4%NaOH溶液，混勻后用80%甲醇溶液稀釋至刻度，混勻放置15min，以未加蘆丁 試管為空白對照，于最大波長處測定吸光度，重復測定三次，所得數據依次為〇. 283，0.280， 0.285,計算平均值為0.283,對照標準曲線（圖2)可得藍金樣品中總黃酮的濃度為0.054mg/ mL，當量為1.082mg蘆丁/g果實。
[0039] (7)根據上述實驗步驟，所測得部分藍莓品種其總黃酮含量如下表1:
[0040] 表1新鮮成熟藍莓果實中總黃酮的含量
[0042] 2、測定方法學考察
[0043] (1)精密度實驗
[0044] 精密稱取0.1mg/mL蘆丁標準品溶液，按以上方法顯色，分別測定其吸光度值，重復 6次，測得RSD吸光度為0.54%。（見表2)。
[0045] 表2精密度實驗結果
[0047] (2)重現性實驗
[0048]取藍金果實按照上述提取方法重復提取6次，按以上方法顯色，分別測定其吸光度 值，求得吸光度RSD值為1.74% (見表3)。
[0049]表3總黃酮重現性實驗結果
[0051 ] (3)穩定性實驗
[0052] 取藍莓樣品提取溶液，按以上方法顯色，測定0，20，40，60，80min的吸光度，求得吸 光度RSD值為2.89 % (見表4)。
[0053]表4總黃酮穩定性實驗結果
[0055] (4)加樣回收率實驗
[0056]取提取后的藍莓樣品溶液5份，分別加入相同體積已知濃度的蘆丁標準品（0.2mg/ mL)，混合后按以上方法顯色，測定平均回收率為97.23 %，RSD為2.96 % (見表5)。
[0057]表5蘆丁的加樣回收率實驗結果
【主權項】
1. 一種藍莓中總黃酮含量的測定，其特征在于，包括以下幾個步驟： (1)藍莓中總黃酮的提取方法 精密稱取藍莓鮮果，組織破碎后按料液比1:10-15比例加入含有體積分數0.1 %鹽酸的 80%甲醇溶液，40°C超聲提取30-40min，過濾，濾渣按上述方法再提取一次，合并濾液;取濾 液用旋轉蒸發儀濃縮后加入5倍體積乙酸乙酯進行萃取，萃取3-5次，合并乙酸乙酯層萃取 液，回收乙酸乙酯，濃縮物用80%甲醇定容，保存備用； ⑵測定總黃酮顯色劑的制備 配制5wt %的亞硝酸鈉溶液；配制10wt %的硝酸鋁溶液；配制4wt %的氫氧化鈉溶液； (3)對照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對照品，用純水定容，配制成濃度為0.2mg/mL溶液； (4) 最大吸收波長的確定 吸取步驟(3)中所配制蘆丁溶液，按照顯色方法顯色，用紫外-可見分光光度計在400~ 600nm范圍內掃描，確定最大吸收波長為500nm; (5) 蘆丁標準曲線的建立 分別量取步驟（3)制備的蘆丁對照品溶液0、0.5mL、1. OmL、1.5mL、2. OmL、2.5mL于1 OmL 容量瓶中，上述溶液分別按照顯色方法顯色后，于最大波長處測定吸光度，以未加對照品的 一組做空白對照；以蘆丁對照品濃度為橫坐標X，吸光度為縱坐標y，建立標準曲線；（6)藍莓 樣品中總黃酮的測定 精確量取步驟（1)中得到的藍莓樣品提取溶液2. OmL于10ml刻度試管中，按照顯色方法 顯色后，以未加蘆丁試管為空白對照，于最大波長處測定吸光度;重復測定三次，所得數據 計算平均值，對照標準曲線可得各品種藍莓樣品中總黃酮的濃度，計算當量mg蘆丁/g果實； 所述步驟(4)、步驟(5)、步驟(6)中，顯色方法為:在待測溶液中加入0.5mL 5 % NaN02溶 液，混勾放置6min，加入0 · 5mL 10%A1 (N〇3)3溶液，混勾放置6min;加入4 · OmL 4%NaOH溶液， 混勻后用80%甲醇溶液稀釋至刻度，混勻放置15min。2. 根據權利要求1所述藍莓中總酚含量的測定，其特征在于:步驟（1)中，藍莓鮮果質量 與定容體積的比例為3~5g: 10mL。3. 根據權利要求1所述藍莓中總酚含量的測定，其特征在于:步驟(3)中，對照品溶液的 配制:精密稱取10. 〇mg蘆丁對照品，用純水定容至50mL容量瓶中。4. 根據權利要求1所述藍莓中總酚含量的測定，其特征在于:步驟(5)中，標準曲線的線 性回歸方程為:y = 1 〇 · 82x-0 · 0038，R2 = 0 · 9995，線性濃度范圍為0 · 01-0 · 05mg/mL。5. 根據權利要求1所述藍莓中總酚含量的測定，其特征在于:步驟(2)中，測定總黃酮顯 色劑的制備:精密稱取2.5000g亞硝酸鈉 NaN02分析純，用純水定容至50mL容量瓶中，配制成 5%亞硝酸鈉溶液;精密稱取8.8207g硝酸鋁A1 (Nods · 9H20分析純，用純水定容至50mL容量 瓶中，配制成10 %硝酸鋁溶液;精密稱取4.0000g氫氧化鈉 NaOH分析純，用純水定容至100mL 容量瓶中，配制成4 %氫氧化鈉溶液。
【文檔編號】G01N21/31GK106018296SQ201610341098
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】弓曉杰, 李珂珂, 楊莉, 徐玉濤
【申請人】大連大學