專利名稱：：中藥復方灌注液的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種中藥灌注液的制備方法，具體為一種中藥復方提取物制備灌注液的制備工藝及其在治療表淺性膀胱癌上的用途。
背景技術：
：膀胱癌是較常見的腫瘤之一，約占所有惡性腫瘤的10%左右，是我國泌尿系統最常見的惡性腫瘤。本病男性多發，男女發病率的比例約為41，發病年齡多在40歲以上，且隨年齡增大而發病率增加。但近年來30歲以下發病者有所增加，20歲左右的患者也時有所見，總的發病率有上升趨勢。初次就診的患者中70%-80%為表淺性膀胱癌(SuperficialTransitionalCellCarcinoma,STCC)。表淺性膀胱癌是指包括原位癌(Tis)、Ta及Tl期的所有膀胱腫瘤，不論腫瘤分化程度的高低，都未侵及膀胱肌層。經尿道切除術或者膀胱部分切除術雖然可以切除原發腫瘤，但由于STCC的多中心性和多發性特點，復發率高達30%-85%，且絕大多數術后一年內復發。復發的患者中有30%-40%會進展為浸潤性膀胱癌。為了預防腫瘤的術后復發，目前普遍采用的方式是在手術切除原發病灶后，給予持續的膀胱抗腫瘤藥物灌注治療。膀胱灌注治療的主要目的如下1、抗癌藥物可以在膀胱內較長時間高濃度直接作用于腫瘤。2、可以殺滅膀胱內術后殘余的腫瘤細胞，防止腫瘤細胞種植，降低復發的可能。3、可以減少全身用藥的毒副作用。4、可以保留膀胱，不僅生活方便，且可保留性功能。5、阻止腫瘤惡性程度的進展。常用的術后膀胱灌注治療的藥物分為兩大類化療藥物和免疫調節劑類藥物。化療藥主要包括絲裂霉素(MMC)、表阿霉素和吡柔比星等，是目前國內的一線用藥，國外多中心前瞻性對照研究證明都能夠不同程度降低近期2年)復發率，但對遠期復發率(>5年)及生存率的改善不明顯。分析影響效果的重要原因之一就是腫瘤細胞的耐藥性，包括原發性耐藥和獲得性耐藥，降低甚至消除了藥物效果。現國外應用較多的藥物為卡介苗(BCG)，是目前治療和預防表淺性膀胱癌最有效的藥物之一。其優勢在于能夠降低近期復發率，同時阻止腫瘤進展，從而提高了遠期療效。但由于BCG毒副作用大，不能在腫瘤切除后立即使用，從而影響了預防腫瘤細胞種植的作用。目前還沒有發現關于這種中藥提取物在治療膀胱癌方面的研究報道。
發明內容本發明為了解決提高蘇木類中藥提取物在治療腫瘤方面的應用效果而提供了一種中藥復方提取物制備灌注液的制備工藝及其在作為治療膀胱癌藥物方面的應用。本發明是由以下技術方案實現的，一種中藥復方提取物制備灌注液，是由二種中藥制成，三七1-5質量份，蘇木5-9質量份，生產工藝為水煮提取，石油醚脫脂，乙酸乙脂淬取，減壓干燥，水溶過濾，凍干處理。該提取物對膀胱腫瘤細胞有很好的殺傷作用。能夠作為制備治療膀胱癌藥物方面的應用。可用于膀胱腫瘤切除術后創面清洗，能起到殺死殘留膀胱腫瘤細胞，促進創面愈合，降低術后膀胱腫瘤復發的作用。三七為五加科植物三七(Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen)的根，含有多種化學成分，其中三七總皂苷(PNS)為主要有效活性成分之一，其藥理作用非常廣泛。三七水溶性成分能縮短小鼠的凝血時間，使血小板數量顯著增加(中國野生植物資源，2000，19(1)10)。還能通過改善血管內皮功能，改善血流狀態，改善血液成分，達到抑制血小板粘附和聚集，防止血栓形成的目的(三七總皂苷干預血栓形成研究概況，云南中醫中藥雜志，2003，24(5):46-47)。三七皂苷RG3能抑制前列腺癌LNCaP細胞的增生，對lewis肺癌也有明顯的抑制作用。此外三七總皂苷還有顯著的抗炎鎮痛作用，能減輕組織水腫、炎癥、變性壞死，加快病灶清除和組織修復，對機體起到保護作用，是一種常用的創傷外用藥，適合于術后清創，力口速創傷修復。蘇木(LignumSappan)為豆禾斗(Leguminosae)云實屬植物蘇木(CaesalpiniasappanL.)的干燥心材，產于我國廣西、云南等地，有行血祛瘀、消腫止痛的功能，其水提物對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用。我們曾就此申報了名為“具有抗腫瘤作用的灌洗液的制備方法”的專利，申請號=200910074345.0。在之后的研究中我們發現一定比例的三七與蘇木的混合提取物具有更為有效的抗腫瘤作用。兩者合用能起到減毒增效的作用。膀胱腫瘤術后使用具有消炎止痛，活血止血，促進創傷組織修復，降低術后腫瘤復發率的作用。制備工藝為1、將兩種藥材粉碎，按比例稱取；2、加入4-5倍重量的純化水浸泡2-3小時；3、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；4、合并三次提取液，減壓濃縮(60-80°C)到干藥材重量的1.5-1.6倍；5、將濃縮后的藥液置4°C，放置24-36小時，過濾，去掉沉渣；6、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；7、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取。8、減壓揮去乙酸乙脂(30_40°C)，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時；9、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用(液體型)或過濾除去沉淀后冷凍干燥；無菌分裝，封口，即成(干粉型)。使用時用蒸餾水融化即可成為灌注液直接使用。細胞學研究資料不同比例混合提取物對膀胱癌細胞株T24的殺傷作用比較本實驗采用活細胞拒染法檢測藥物對靶細胞的殺傷作用，其原理是正常活細胞對臺盼蘭染料有拒染性，細胞死亡后可以被染成蘭色。藥物與細胞混合培養一定時間后，細胞與染液混合，顯微鏡下觀察，可以根據細胞是否著色來判斷細胞的死活。材料1、靶細胞人膀胱癌細胞株T24，購于中科院上海生命科學院。2、染液臺盼蘭染料(TrypanBlue)，sigma公司產品，以生理鹽水配制成含量為0.4%的溶液。3、藥物組方(1)三七50g、蘇木50g。(2)三七40g蘇木60g。(3)三七30g、蘇木70g。(4)三七20g、蘇木80g。(5)三七10g、蘇木90g。(6)三七0g、蘇木100g。4、藥物提取方法藥材適當粉碎，加水浸泡2小時，煮沸提取3次，每次加水量分別是藥材總量的4倍、3倍、3倍，合并提取液，濃縮成含量為100%的水提取液，加等量石油醚淬取一次，取水相，加等量乙酸乙脂淬取5次，合并乙酸乙脂相，減壓干燥，收集干粉，用生理鹽水配制成含量為2mg/ml的溶液，用于細胞實驗。5、實驗方法消化收集處于對數生長期的靶細胞，以不含血清的RPMI1640調整細胞密度為ιχIOVml。取細胞懸液0.Iml加入24孔細胞培養板中，加入各種待測藥液0.9ml，對照組不加藥，每組藥液均設4個復孔，置37°C，5%C02飽和溫度恒溫培養箱中，分別于0、20、40、60、80、100分鐘時，取細胞懸液0.1ml，加等量臺盼蘭染液，輕輕混勻，滴加到細胞計數板上，置100倍光學顯微鏡下計數4個大格內(約150-200個)的細胞總數，分別計數活細胞(未著色的細胞)和死細胞(染成蘭黑色的細胞)數，按公式(細胞總數_活細胞數)/細胞總數X100，求出細胞殺傷百分率。按不同時間點繪制細胞殺傷率曲線圖，進行比較。6、結果對照組細胞活性良好，平均活細胞率大于98%，實驗各組按照對靶細胞的殺傷作用由強到弱排列依次為5#、6#、4#、3#、2#、1#，綜合比較，以5#、6#、4#、組方對靶細胞的殺傷作用較好(見表1、圖1)表1各組藥物不同時間對靶細胞的殺傷作用(X士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>動物實驗研究資料復方洗液對荷瘤小鼠的生命延長作用1、細胞株小鼠肝癌細胞H22購自河北醫科大學實驗動物中心，小鼠肉瘤S180購自中國藥品生物制品鑒定所，細胞株置液氮中冷凍保存。2、動物清潔級KM小鼠，雌雄兼用，體重18_22g，購自山西醫科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(晉)2009-0001。動物實驗在山西省腫瘤研究所動物實驗室內進行，實驗室許可證號SYXK(晉)2007-0002。3、實驗方法無菌抽取接種后第7-8天小鼠腹水，以PBS調整細胞密度為5XIO7/ml,臺盼蘭檢測活細胞率大于98%，每只動物腹腔內接種0.2ml細胞懸液。接種后動物隨機分組，每組10只，分別設空白對照組、順鉬組、復方高劑量組(簡稱復方高)、復方中劑量組(簡稱復方中)、復方低劑量組(簡稱復方低)。藥物按實驗1方法提取，制備成含量為2%的灌注液使用。接種后24小時開始腹腔注射給藥，每天給藥一次，連續給藥6天，給藥劑量見表2，觀察動物生存時間，每隔3天記錄體重，觀察時間為60天，生存時間大于60天者按60天統計，分別計算各組動物平均生存時間，進行組間比較。4、結果(1)對荷肝癌H22小鼠的生命延長作用對照組動物平均生存時間為17.3士5.1天，各給藥組動物按生命延長率由高到低依次為復方高一順鉬一復方中一復方低。綜合比較復方高劑量組對H22腫瘤細胞有較好的抑制作用(見表2)。表2復方灌注液對H22荷瘤小鼠生命延長率作用(X士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對照組比較，#P<0.001(2)對荷肉瘤S180小鼠的生命延長作用對照組動物平均生存時間為19.2士4.1天，各給藥組按照生存時間由長到短依次為復方高一順鉬一復方中一復方低。綜合比較復方高效果較好，復方中、低效果較差(見表3)，表明復方洗液在適當劑量下對S180有顯著的抑制作用。表3復方灌注液對S180荷瘤小鼠生命延長率作用(X士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對照組比較，#P<0.001臨床研究資料本灌注液在臨床使用過程中，采用與傳統方療藥物相同的灌注方式，即表淺性膀胱癌術后6-8小時開始灌注，每次40ml，藥液在膀胱內保留80-100分鐘，然后自行排出。術后連續灌注6-8次，然后改為每周灌注一次，連續灌注8周，然后改為每月灌注一次，連灌8次，即總計一年內灌注22-24次。灌注期間每隔3月作一次膀胱鏡檢查，如果發現復發即改用其它藥物灌注，同時按復發記錄，并記錄不良反應發生情況，共觀察患者50例，觀察時間為12個月，結果如下(見表4)。表4復灌注液的初步臨床療效觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>觀察結果表明，復方灌注液對表淺性膀胱癌術后復發有顯著的治療效果，用藥后初發組一年的復發率僅為3.4%，復發組為10.7%。兩組合計術后1年的復發率僅為13.56%，明顯低于傳統治療方法的35-45%年復發率，而且患者的不良反應發生率也較化療藥物組明顯降低，是一種有很好臨床應用價值的藥物。圖1為各組藥物不同時間對靶細胞的殺傷作用具體實施例方式實施例1、一種中藥復方提取物制備灌注液，是由二種中藥制成，三七1份，蘇木9份，制備工藝為1、將兩種藥材粉碎，按比例稱取；2、加入5倍重量的純化水浸泡2小時；3、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加4倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；4、合并三次提取液，減壓濃縮(60-80°C)到干藥材重量的1.5-1.6倍；5、將濃縮后的藥液置4°C，放置36小時，過濾，去掉沉渣；6、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；7、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取。8、減壓揮去乙酸乙脂(30_40°C)，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時；9、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用(液體型)或過濾除去沉淀后冷凍干燥；無菌分裝，封口，即成(干粉型)。實施例2、一種中藥復方提取物制備灌注液，是由二種中藥制成，三七5份，蘇木5份，制備工藝為1、將兩種藥材粉碎，按比例稱取；2、加入4倍重量的純化水浸泡3小時；3、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加4倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；4、合并三次提取液，減壓濃縮(60-80°C)到干藥材重量的1.5-1.6倍；5、將濃縮后的藥液置4°C，放置24小時，過濾，去掉沉渣；6、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；7、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取。8、減壓揮去乙酸乙脂(30_40°C)，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時；9、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用(液體型)或過濾除去沉淀后冷凍干燥；無菌分裝，封口，即成(干粉型)。實施例3、一種中藥復方提取物制備灌注液，是由二種中藥制成，三七4份，蘇木8份，制備工藝為1、將兩種藥材粉碎，按比例稱取；2、加入5倍重量的純化水浸泡3小時；3、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加3倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；4、合并三次提取液，減壓濃縮(60-80°C)到干藥材重量的1.5-1.6倍；5、將濃縮后的藥液置4°C，放置24-36小時，過濾，去掉沉渣；6、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；7、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取。8、減壓揮去乙酸乙脂(30_40°C)，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時；9、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用(液體型)或過濾除去沉淀后冷凍干燥；無菌分裝，封口，即成(干粉型)。權利要求一種中藥復方提取物制備灌注液，作為制備治療膀胱癌藥物方面的應用。2.—種中藥復方提取物制備灌注液，其特征在于是由二種中藥，三七1-5份，蘇木5-9份，通過水提取制成。3.根據權利要求2所述的中藥復方提取物制備灌注液，其特征在于制備工藝為(1)、將兩種藥材粉碎，按比例稱取；(2)、加入4-5倍重量的純化水浸泡2-3小時；(3)、煮沸提取60分鐘后，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持50分鐘，傾出提取液，再加3-4倍體積量純化水煮沸保持40分鐘，傾出提取液；(4)、合并三次提取液，減壓濃縮到干藥材重量的1.5-1.6倍；(5)、將濃縮后的藥液置4°C，放置24-36小時，過濾，去掉沉渣；(6)、濃縮液中加入等體積量石油醚，充分搖勻，靜置，取水相；(7)、分5次加入等體積量的乙酸乙脂淬取；(8)、減壓揮去乙酸乙脂，加入與藥材等重量的純化水溶解，置4°C放置24小時；(9)、過濾除去沉淀，加入1.5倍藥材重量的純化水混勻，灌裝，高壓滅菌后即可使用或過濾除去沉淀后冷凍干燥。全文摘要本發明涉及一種中藥灌注液的制備方法，具體為一種中藥復方提取物制備灌注液的制備工藝及其在治療表淺性膀胱癌上的用途。解決提高蘇木類中藥提取物在治療腫瘤方面的應用效果。是由二種中藥制成，三七1-5份，蘇木5-9份，生產工藝為水煮提取，石油醚脫脂，乙酸乙脂淬取，減壓干燥，水溶過濾，凍干處理。該提取物對膀胱腫瘤細胞有很好的殺傷作用。能夠作為制備治療膀胱癌藥物方面的應用。可用于膀胱腫瘤切除術后創面清洗，能起到殺死殘留膀胱腫瘤細胞，促進創面愈合，降低術后膀胱腫瘤復發的作用。文檔編號A61P35/00GK101822711SQ20101018363公開日2010年9月8日申請日期2010年5月22日優先權日2010年5月22日發明者任連生,張蕻,王晉芬申請人:山西省腫瘤醫院