專利名稱：一種用于增強腫瘤化療藥物化療效果的表達質粒佐劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種用于增強化療藥物化療效果的 PLK0-anti-miR-23a表達質粒佐劑及其制備方法。
背景技術：
5-氟尿嘧啶(5-FU)廣泛應用于消化道惡性腫瘤的化學治療，由于它療效確切，一 直處于其他化療藥無法替代的地位，但一些病例對該藥物為主的化療并不敏感。5-FU是治 療大腸癌，胃癌，膽管癌常用的藥物，單藥治療的有效率僅20%左右。化療藥的聯合使用 (如5_FU+長春新堿+司莫司汀)，使晚期大腸癌的化療有效率明顯提高，患者中位生存時 間明顯延長。盡管如此，大腸癌化療中原發和獲得性耐藥現象很普遍。基因遺傳多態性，使 患者對化療敏感性存在個體化差異。如何選擇合適的化療方案和選擇增強化療效果的佐劑 使患者從治療中受益，非常重要。細胞凋亡是化療藥物發揮作用的重要途徑。細胞有增殖、分化和凋亡三種特性，在 正常情況下，三者相互協調，保持平衡。腫瘤組織除了具有增殖活性以外，腫瘤細胞凋亡率 減少，將使腫瘤細胞凈生長率提高，預后則更差。根據細胞凋亡發生的過程分為兩條途徑 一條是死亡受體途徑，即通過胞外信號激活細胞內的凋亡酶caspase ；—條是線粒體途徑， 即通過線粒體釋放凋亡蛋白酶激活因子激活caspases。這些活化的caspase蛋白可將細胞 內的重要蛋白降解，引起細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡發生機制中起關鍵作用，它不僅可以 自身釋放細胞色素C等物質介導凋亡，還可以和其他凋亡誘導因子共同作用而改變自身的 活動狀態，從而更好的調節細胞凋亡。APAF-I (凋亡肽誘導因子1)作為調節蛋白主要參與 線粒體途徑的信號轉導。APAF-I廣泛分布于人腦、心、肝、脾、肺、胰、腎、胸腺、小腸、結腸、 骨骼肌、卵巢、睪丸、外周血白細胞等多種組織和細胞內。在化療藥物作用下，線粒體功能障 礙導致細胞色素C釋放；釋放到細胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與APAF-I結 合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結合形成凋亡體，caspase-9隨即被激活；被激 活的caspase-9能激活其它的caspase，如caspase-3等；caspase-3又激活DNA斷裂因子， 導致靜息狀態的核酸內切酶活化，最終引起DNA斷裂，引起細胞凋亡。microRNA(miRNA)是一類長度約21 25堿基的非編碼蛋白質單鏈小分子RNA， 廣泛存在于多細胞生物和病毒體內，主要通過核酸序列互補匹配結合到特定的靶mRNA上， 抑制靶mRNA翻譯過程或降解靶mRNA，是一種起負調控作用的分子。目前越來越多的研究 顯示，miRNA廣泛參與了生物體多種生理過程，且相關研究報道也表明其表達及功能失調 可能影響腫瘤發生、發展和化療等多種病理現象。目前，對于miRNA干預腫瘤化療的報道 逐漸增多。例如FANYIN MENG等人證實在膽管癌的化療中抑制miR-21和miR_200b的 表達可以增強化療藥物的敏感性(FANYIN MENG, R0GERHENS0N, MOLLY LANG, HANIA WEHBE, SHAILMAHESHWARI, JOSHUA Τ. MENDELL, JINMAI JIANG, THOMAS D. SCHMITTGEN, and TUSHAR PATEL GASTR0ENTER0L0GY2006 ; 130 :2113-2129)。Chan JA, Krichevsky AM，等研究者發現
3miR-21可以通過干擾凋亡相關基因的表達增強神經膠質瘤的耐藥性(Chan JA,Krichevsky AM, Kosik KS. MicroRNA-21is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res. 2005Jul 15 ；65 (14) :6029_33·)。hsa-mir-23a(Mature sequence MIMAT0000078)是一種在人膽管癌、胃癌、結腸 癌和乳腺癌等腫瘤經過化療藥物5-FU處理后高表達的miRNA。目前對于hsa-mir-23a 的報道，例如在膽管癌中，mir-23a的表達顯著上調，(FANYIN MENG，ROGER HENSON， MOLLY LANG, HANIAffEHBE, SHAIL MAHESHWARI, JOSHUA Τ. MENDELL, JINMAI JIANG, THOMAS D. SCHMITTGEN, and TUSHAR PATEL GASTR0ENTER0L0GY2006 ；130 :2113_2129)；在結腸癌經 過 5-FU 化療處理后，miR_23a 的表達明顯升高，(Lorena Rossi,Enzo Bonmassar, Isabella Faraoni, Modification of miRgene expression pattern in human colon cancer cells following exposure to5-fluorouracil in vitro Pharmacological Research 56(2007)248-253) ；miR-23a通過對于LMNBl表達的調節增強神經膠質瘤的形成和髓鞘 形成，從而促進神經膠質瘤細胞的增殖(Shu-Ting Lin，Ying-Hui Fu, miR-23regulation oflamin Bl is crucial foroligodendrocyte development and myelination DiseaseModels & Mechanisms 2，178—188 (2009)doi :10. 1242/dmm. 001065)。至今未見一種用于增強腫瘤化療效果的表達miRNA-23a抑制劑的表達質粒佐劑 的研究和應用來增強腫瘤的化療效果的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用于增強腫瘤化療藥物化療效果的表達質粒佐劑及 其制備方法。本發明設想，miR-23a可與其靶基因APAFl結合，從而降低APAFl基因的表達，降 低因化療引起的線粒體途徑的凋亡。從而增強腫瘤對化療藥物的耐受性。相反，過表達 miR-23a的抑制劑，使體內miR-23a的表達量下降可以引起凋亡細胞數增加，從而增強化療 藥物5-FU的敏感性。因此本發明擬在體內或腫瘤中直接轉入miR-23a的抑制劑表達質粒 可以增強腫瘤的化療敏感性。本發明提供一種用于增強腫瘤化療藥物化療效果的表達質粒佐劑，它以慢病毒載 體質粒PLK0. 1為基本骨架，含有頸環結構的正義鏈5' CCGGTATCACATTGCCAGGGATTTCCCTC GAGGGAAATCCCTGGCAATGTGATTTTTTG 3'和反義鏈5' AATTCAAAAAATCACATTGCCAGGGATTTCC CTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGAT A 3'序列的質粒。上述質粒可穩定表達與miR-23a成熟體序列(AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC)互補的表 達質粒。該表達質粒的表達序列克隆入其他的表達載體中進行表達也可構建其他的表達質 粒佐劑。上述的腫瘤化療藥物是5-氟尿嘧啶(5-FU)或在腫瘤化療中可以引起miR_23a表 達增加的化療藥物。當本發明的表達質粒佐劑與5-FU聯合應用時，可提高腫瘤針對5-FU的敏感性，提 高腫瘤的化療效果。同時該疫苗可以自己引起細胞凋亡增加，故也可以與其他化療藥物聯 合應用來增強化療效果。該疫苗可以作為增強化療效果的表達質粒佐劑來應用。本發明提供了 一種用于增強腫瘤化療藥物化療效果的表達質粒佐劑，是通過瘤內直接注射該質粒或通過局部植入緩釋泵將質粒注入到瘤體內，讓該佐劑在腫瘤體內不斷擴 增并表達miR-23a的抑制劑，從而使抑制劑與腫瘤內部的miR-23a結合，抑制腫瘤內因化療 藥物的壓力而引起miR-23a的過表達，從而在于化療藥物聯合應用時增強腫瘤藥物的敏感 性，增強化療效果。本發明的質粒佐劑的應用方式包括瘤內注射，肌肉注射，皮下注射，靜 脈注射，腹腔注射，粘膜吸收，胃腸道吸收等應用方式。可以與化療藥物聯合應用也可以在 腫瘤局部瘤內注射。本發明還提供了一種用于增強腫瘤化療藥物化療效果的質粒佐劑的制備方法，具 體步驟如下具有頸環結構的表達miR_23a抑制劑序列正義鏈5'CCGGTATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGATTTTTT G 3' (SEQ ID NO 1)反義鏈5‘ AATTCAAAAAATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGAT A 3' (SEQ ID NO 2)在序列的兩端加上能與載體末端匹配結合酶切位點的粘性末端，將帶有頸環結構 的序列經人工合成后，將核苷酸序列重懸于雙蒸水中，濃度為lug/ul。將此管核苷酸序列退 火合成雙聯。退火體系為-5ul of Sense oligo-5ul of Antisense oligo-5ul of IOx NEB buffer 2-35ul ddH20共50ul體系，于95°C水浴中孵育4分鐘，在盛有1500ml水的燒杯中于70°C孵育 10分鐘，然后自然降至室溫，形成雙鏈結構。將慢病毒載體質粒PLK0. 1經酶切位點AgeI和 EcoRI酶切后，將雙鏈寡核苷酸序列克隆入酶切后的PLK0. 1載體中。轉化入大腸桿菌感受 態中，大量擴增目的序列。經測序鑒定正確后進行下一步的應用檢測。本發明經動物實驗結果表明1.在體外轉染人結腸癌細胞系中通過轉染表達 后，進一步通過realtime PCR鑒定miR-23a的表達改變情況，進一步確定該質粒表達的 miRNA-23a抑制劑序列在體外穩定表達(如圖3所示)。2.在免疫缺陷鼠中接種移植瘤，通 過直接瘤內注射該佐劑或通過建立穩轉PLK0-anti-miR23a的結腸癌細胞株，并接種在免 疫缺陷鼠中進一步觀察對化療效果的改變的影響。再次證明該疫苗佐劑在體內穩定表達， 并對腫瘤的化療起到了增強作用。因此證明了 PLK0-anti-miR23a可以作為疫苗佐劑在腫 瘤化療中發揮明顯的抗腫瘤作用。3.本發明提供的通過大腸桿菌大量擴增表達miR23a抑 制劑的質粒，為成熟的質粒體外擴增的方法，目前有成熟的體外擴增技術和分離純化方法。 4.用大腸桿菌體外擴增miR23a抑制劑的質粒，生產簡單，成本低廉，給病人體內注射操作 方便，植入緩釋泵后可以反復注入質粒，對病人創傷性小。5.與其他腫瘤化療藥物相比，直 接瘤內注射副作用小。
圖1 是PLK0-anti_miR23a表達質粒重組戰略5
圖2 是重組質粒測序結果圖。圖3 體外轉染重組質粒后經realtime PCR鑒定miR-23a表達改變的統計圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述，但本發明的實施不僅限于此。實施例1 重組質粒PKL0-anti_miR23a的構建設計具有頸環結構的表達miR-23a抑制劑序列正義鏈5'CCGGTATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGATTTTTT G 3'反義鏈5'AATTCAAAAAATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGAT A 3'在序列的兩端加上能與載體末端匹配結合酶切位點的粘性末端，將帶有頸環結構 的序列經人工合成后，將核苷酸序列重懸于雙蒸水中，濃度為lug/ul。將此管核苷酸序列退 火合成雙聯。退火體系為-5ul of Sense oligo-5ul of Antisense oligo-5ul of IOx NEB buffer 2-35ul ddH20共50ul體系，于95°C水浴中孵育4分鐘，在盛有1500ml水的燒杯中于70°C孵育10 分鐘，然后自然降至室溫，形成雙鏈結構。將慢病毒載體質粒PLK0. 1 (Openbiosystems USA) 經酶切位點AgeI和EcoRI酶切后，將雙鏈寡核苷酸序列克隆入酶切后的PLK0. 1載體中(如 圖1所示)。轉化入大腸桿菌感受態中，挑單克隆進一步擴增目的序列。委托Irwitrogen 公司測序鑒定正確后進行下一步的應用檢測(如圖2所示)。實施例2 重組質粒PKL0-anti-miR23a的大量制備(采用碧云天生物技術公司的 質粒大抽試劑盒)1.取過夜菌至50毫升離心管內，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清。再重 復一次，每管共收集100毫升過夜菌沉淀。2.每管加入5毫升溶液I，重懸細菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊。 確認溶液I中已添加了 RNase A。最高速度渦旋10_20秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充 分混勻，對著光亮處觀察應呈均勻的懸濁液，無明顯細菌團塊或絮塊。如果沒有渦旋儀，可 以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開。3.每管加入5毫升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，室溫放置3_5分鐘，使細菌完 全裂解，溶液透明。4.每管加入5毫升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生。5.最高速(> 5，OOOrpm)室溫離心10_20分鐘。如果速度較高例如10，OOOrpm左 右，一般離心10分鐘已經足夠。離心時可以準備好質粒純化柱，自制漏斗等，并在純化柱上 標上記號。6.將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內。最高速離心2分鐘，倒棄收集管內液體。質粒倒入質粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體 后，保留收集管繼續使用。7.在質粒純化柱內加入7毫升溶液IV，最高速離心2分鐘，洗去雜質，倒棄收集管 內液體。加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼 續使用。8.最高速再離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發。注意倒棄收集 管內液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。9.將質粒純化柱置于50毫升離心管上，加入2毫升溶液V至管內柱面上，放置2 分鐘。也可以用重蒸水或MiliQ級純水替代溶液V，但是水的pH應不小于6. 5。溶液V加 入后放置時間稍長，對于增加質粒產量會略有幫助。10.最高速離心2分鐘，所得液體中加 入10毫升溶液VI，混勻后加到原質粒純化柱內。加入溶液VI后必須混勻！可顛倒混勻，混 勻后切勿離心。11.最高速離心2分鐘，倒棄收集管內液體。12.在質粒純化柱內加入15毫升溶液IV，最高速離心2分鐘，進一步洗去雜質，倒 棄收集管內液體。加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留 收集管繼續使用。13.最高速再離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發。注意倒棄收集 管內液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。14.將質粒純化柱置于50毫升離心管上，加入2毫升溶液V至管內柱面上，放置2 分鐘。15.最高速離心2分鐘，所得液體即為超純質粒。16. DNA定量分析，用適量體積的TE緩沖液稀釋DNA溶液。用紫外分光光度計測量 器 OD260 和 OD280,計算 DNA 的含量。OD260/OD280 = 1. 82DNA 的含量 300ng/ul。實施例3 :PLK0-anti-miR23a增強化療藥5_FU對結腸癌移植瘤的化療效果一、人結腸癌細胞株HCT116移植瘤模型的建立將收集1父107個!10116細胞(購自中科院細胞庫)用無血清培養基重懸，接種 于6-8周免疫缺陷鼠右側背部皮下，接種10天后腫瘤長出，待小鼠體制為IOOmm3時，將小 鼠隨機分為三組。A 尾靜脈注射60 μ 1/只PBS ；B 尾靜脈注射60 μ 1/只5-FU+瘤內注射 PLK0. 1空質粒；C 尾靜脈注射60 μ 1/只5-FU+瘤內注射PLK0-anti_miR23a表達質粒。每周測量腫瘤長寬，應用公式V = O. 4XLff2來計算腫瘤體積，尾靜脈注射質粒和 化療藥物5-FU均為每周一次。結果表明，瘤內注射PLK0-anti-miR23a表達質粒+5-FU尾靜脈注射組明顯抑制腫 瘤生長，其抑制腫瘤生長的效果明顯比單獨應用5-FU尾靜脈注射組強。二、人結腸癌細胞株HT29移植瘤模型的建立將收集1 X IO7個HT29細胞(購自中科院細胞庫)用無血清培養基重懸，接種于 6-8周免疫缺陷鼠右側背部皮下，接種10天后腫瘤長出，待小鼠體制為IOOmm3時，將小鼠隨 機分為三組。A 尾靜脈注射60 μ 1/只PBS ；B 尾靜脈注射60μ 1/只5-FU+瘤內注射PLK0. 1 空質粒；C 尾靜脈注射60 μ 1/只5-FU+瘤內注射PLK0-anti-miR23a表達質粒。每周測量腫瘤長寬，應用公式V = O. 4XLff2來計算腫瘤體積，尾靜脈注射質粒和
7化療藥物5-FU均為每周一次。 結果表明，瘤內注射PLK0-anti-miR23a表達質粒+5-FU尾靜脈注射組明顯抑制腫 瘤生長，其抑制腫瘤生長的效果明顯比單獨應用5-FU尾靜脈注射細強。
權利要求
一種用于增強腫瘤化療藥物化療效果的質粒佐劑，它以慢病毒載體質粒PLKO.1為基本骨架，含有頸環結構的如SEQ ID NO1所示的正義鏈序列和如SEQ ID NO2所示的反義鏈序列的質粒。
2.根據權利要求1所述的用于增強腫瘤化療藥物化療效果的質粒佐劑，其中所述的腫 瘤化療藥物是5-氟尿嘧啶或在腫瘤化療中可以引起miR-23a表達增加的化療藥物。
3.—種如權利要求1或2所述的用于增強腫瘤化療藥物化療效果的質粒佐劑的制備方 法，具體步驟如下具有頸環結構的表達miR-23a抑制劑序列正義鏈5 ‘ CCGGTATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGATTTTTTG 3' (SEQ ID NO 1)反義鏈5 ‘ AATTCAAAAAATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGAT A 3' (SEQ ID NO:2)在序列的兩端加上能與載體末端匹配結合酶切位點的粘性末端，將帶有頸環結構的序 列經人工合成后，將核苷酸序列重懸于雙蒸水中，濃度為lug/ul。將此管核苷酸序列退火合 成雙聯。退火體系為-5ul of Sense oligo-5ul of Antisense oligo-5ul of IOx NEB buffer 2-35ul ddH20共50ul體系，于95°C水浴中孵育4分鐘，在盛有1500ml水的燒杯中于70°C孵育10分 鐘，然后自然降至室溫，形成雙鏈結構。將慢病毒載體質粒PLK0. 1經酶切位點AgeI和EcoRI 酶切后，將雙鏈寡核苷酸序列克隆入酶切后的PLK0. 1載體中。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域。5-FU廣泛應用于消化道惡性腫瘤的化學治療，但在大腸癌化療中原發和獲得性耐藥現象很普遍；細胞凋亡是化療藥物發揮作用的重要途徑，APAF-1作為調節蛋白主要參與凋亡的線粒體途徑的信號轉導。miR-23a可與其靶基因APAF1結合，從而降低APAF1的表達，降低因化療通過線粒體途徑引起的凋亡，從而增強腫瘤對化療藥物的耐受性；若能使體內miR-23a的表達量下降可以引起凋亡細胞數增加，從而增強化療藥物的敏感性。本發明提供一種用于增強化療藥物特別是5-FU化療效果的PLKO-anti-miR-23a疫苗佐劑，經體外實驗證明可以明顯增強因化療藥物5-FU引起的結腸癌細胞的凋亡水平，體內試驗表明可以明顯增強5-FU的化療效果，抑制腫瘤生長，增強免疫缺陷鼠的生存期。
文檔編號A61K31/513GK101954077SQ20101028065
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月14日 優先權日2010年9月14日
發明者商京麗, 孫樹漢, 魏偉 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學