專利名稱：一種腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物藥物學領域，更具體地講，本發明涉及一種針對腫瘤化學治療的新型增效物質。
背景技術：
多年來經過對腫瘤不懈努力的研究，人們發現腫瘤細胞產生的耐藥性是治療腫瘤的主要絆腳石。統計表明，腫瘤年死亡率中，約90%以上的腫瘤患者死因都與耐藥有關。化學藥物在殺死腫瘤細胞的同時，也存在細胞毒性，損害正常組織器官，降低機體免疫功能等毒副反應，影響化療效果，甚至被迫放棄化療。目前，為了改善化療和放療效果，研究主要集中在逆轉藥物或增敏藥物上，希望通過耐藥的發生機制，尋找可能應用于臨床的腫瘤多藥耐藥逆轉藥物，以期對腫瘤的有效治療取得重大突破。現在，人們已經從基因分子水平研究了若干耐藥的產生機制，盡管目前發現的癌癥治療的潛在靶標不少，但是我們只知道部分在癌癥異常表達的一些分子及其維持癌癥的復雜的途徑交叉，例如生存素(Survivin)就是目前腫瘤治療靶標的典型代表，在各種癌癥中特異性高表達，而在成人終末分化組織中一般不表達或低表達。Survivin參與細胞凋亡的抑制、細胞周期的調控、血管的再生，同時還參與多個途徑中的調節、轉錄和修飾基因直接或間接相互作用，參與腫瘤細胞的耐藥機制，是一個重要的節點蛋白。生物類藥物由于其特異性、低毒、以其對腫瘤耐藥機制的有效干擾，而成為有效解決腫瘤多藥耐藥性的新的希望。公開號CN 1710080A利用質粒構建并重組腺病毒，蛋白質序列53位氨基酸D突變為A，證明該發明可以在多個細胞中強烈誘導細胞凋亡；公開號CN 1869042A利用靶向 survivin基因的siRNA阻斷腫瘤細胞內正常survivin的表達，產生對腫瘤細胞促凋亡能力。以上專利均屬于核酸水平抑制survivin正常功能，在機體內穩定性低，容易被降解，分子水平有可能產生非特異性沉默及脫靶現象，因此我們需要轉染率高、易生產、穩定性高、 風險性低，治療效果強的基因重組藥物克服目前腫瘤治療過程中的瓶頸。作為本發明的前期研究，中國專利200510(^6847. 8 (授權公告號CN 100424096C)公開了生存素Survivin突變體及其制備方法和初步功能，揭示Survivin突變體融合蛋白TmSm對癌細胞有明顯的促凋亡作用，但并沒有涉及其與腫瘤化療藥物聯合使用時的效果。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能夠有效促進腫瘤化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用、 降低化學藥物使用劑量，因此具有化療增敏效果的基因工程蛋白增敏劑。本發明的第二個目的是提供腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑在促進腫瘤化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用中的應用。為實現以上目的，本發明公開以下技術方案一種腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑，所
3述蛋白增敏劑包括Survivin突變體蛋白(本發明中簡稱TmSm)，所述Survivin突變體蛋白通過基因工程制備，與survivin具有90%的同源性，所述Survivin突變體蛋白包括20位、 34位、84位、117位位點單點突變、多點突變、組合突變，以及以上位點同時突變。所述Survivin突變體蛋白優選第34位突變，本發明中第34位突變體代號為 TATm-Survivin(T34A)。所述蛋白增敏劑包括藥學允許的載體系統，所述載體系統指TATm、TAT3;3m或者碳納米管。TATm、TAT3;3m都是指轉導蛋白TAT的不同突變形式，他們分別具有與天然TAT有5 倍和33倍的轉導效果，碳納米管是目前用于轉導藥物的一種常用碳納米材料。所述腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑在促進腫瘤化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用中的應用。所述蛋白增敏劑聯合腫瘤化療藥物使用，所述腫瘤化療藥物是指阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素或者紫杉醇中的一種或幾種；所述腫瘤是指乳腺癌、肝癌、肺癌、上皮細胞癌或者白血病。本發明所述Survivin突變體蛋白的制備方法及其基因序列參照中國專利ZL 200510026847. 8。本發明的優點在于重組蛋白TmSm在本實驗室前期研究中發現其對癌細胞具有快速、顯著的抑生長和促凋亡活性，而不影響正常細胞生長。本發明中根據survivin蛋白在細胞信號通路中的特殊作用以及其對多藥耐藥逆轉的影響，將化療藥物(也稱化學藥物) 與TmSm聯合使用，發現TmSm能有效促進化學藥物的殺傷作用，有效降低化學藥物的使用量，增加化學藥物對細胞的殺傷作用，是一種有效的腫瘤化療的增敏劑。本發明涉及蛋白質藥物TmSm與多種化療藥物的聯合應用，TmSm在較低濃度下表現出良好的對癌癥細胞的增敏效果，可以明顯降低化療藥物的使用濃度；不同的載體系統 TATm, TAT3;3m、碳納米管等都可以有效的靶向腫瘤細胞，是藥學可接受的載體，將藥物傳送給動物或人。
圖1為T47-D對阿霉素和阿霉素與TmSm聯合使用的增敏效果研究。圖2為Bcap-37對阿霉素和阿霉素與TmSm聯合使用的增敏效果研究。圖3為MCF-7對阿霉素和阿霉素與TmSm聯合使用的增敏效果研究。圖4為不同乳腺癌細胞在阿霉素單獨作用和阿霉素與TmSm聯合使用下的IC50。圖5為不同時間、不同TmSm加入劑量對增敏效果影響研究。圖 6 為阿霉素(DOX)單獨處理 KB-3-1 30h 時，DOX 的 IC50=0. 537 士0. 66。圖 7 為 TAT-survivin(T34A)處理KB-3-1 30h 時，目標蛋白的 IC50=34. 74士 1. 05。圖 8 為 5ug/ml TAT-survivin (T34A)與 DOX 共同處理 KB-3-1 細胞 30h 時，DOX 的 IC50=0. 24士 1. 91。圖9為不同乳腺癌細胞株在阿霉素單獨作用、TmSm單獨作用、阿霉素與TmSm聯合使用細胞形態變化。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做詳細說明，實施例的作用僅是解釋而非限定本發明。
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實施例一比較阿霉素(ADM)對三株乳腺癌細胞MCF-7，T47-D，Bcap-37的細胞毒性作用。MCF-7，T47-D，Bcap-37由本實驗室保存，該三株細胞皆屬于乳腺癌研究中常用細胞株，均能通過市場購買獲得。將阿霉素用高糖DMEM培養基等比例稀釋成適當濃度，采用噻唑藍(MTT)快速比色法測定阿霉素對MCF-7，T47-D，Bcap-37的細胞毒性作用。將對數生長期的MCF-7，T47-D，Bcap-37細胞以廣5*104個/孔加入九十六孔板中， 過夜培養至貼壁，然后分別用含有相應濃度的阿霉素高糖DMEM培養基培養48h，在各個梯度的ADM加入量基礎上再加入無細胞毒性劑量的TmSm培養4 觀察結果。4 后，每孔加入20ulMTT (5mg/ml)，37°C，5%C02及飽和濕度的培養箱中孵育4h，吸出培養基，加入150ul 的DMSO，IOmin后490nm酶標儀檢測。從圖1、圖2、圖3中可以看到陽性化學藥物阿霉素對細胞的明顯殺傷作用，伴隨著加入無細胞毒性劑量的TATm-Survivin (T34A)，各個梯度的ADM對各株乳腺癌細胞抑制率都有顯著的增加，證明TmSm能有效增加腫瘤細胞對化藥的敏感性。實施例二 =TATm-Survivin(T34A)與阿霉素聯合作用，以及阿霉素單獨作用IC50 的比較。 采用MTT法(具體實驗步驟參照實施例一)測得阿霉素4 對乳腺癌細胞株MCF-7， T47-D，Bcap-37的細胞毒性作用，以及聯合用藥的細胞毒性作用，利用SPSS18. 0確定細胞的半數抑制濃度(IC50)，每次試驗重復三次以上(P<0. 05)，以Survivin突變體蛋白(TmSm) 34位突變體(TATm-Survivin (T34A))為例，計算結果見圖4。從圖4中可以清晰的看到，TATm-Survivin(T34A)的加入降低了阿霉素化學藥物的使用劑量，進而可以降低癌癥患者對阿霉素等化學藥物的耐受性以及相應產生的毒副作用，明顯增加了乳腺癌細胞對阿霉素等化學藥物的敏感性。實施例三乳腺癌MCF-7細胞對TATm-Survivin (T34A)的增敏作用有時間和劑量依賴性。將對數生長期的MCF-7細胞分別以廣5*104個/孔接種于96孔培養板板中， 每孔加入低劑量的阿霉素，還需加入無細胞抑制率的三個梯度(0.05-15ug/ml)的 TATm-Survivin (T34A)，每組設置五個平行孔，37°C，5%C02及飽和濕度的培養箱中培箱Mh， 48h，72h，實驗終止后，加入20ulMTT(5mg/ml)，37°C，5%C02及飽和濕度的培養箱中孵育4h， 吸出培養基，加入150ul的DMSO，IOmin后490nm酶標儀檢測。從圖5中可以看到隨著TATm-Survivin (T34A)劑量的增力卩(局限在 TATm-Survivin (T34A)的無細胞毒性范圍內)，增敏作用顯著的提升，由此可以得知這種作用不僅是因為TATm-Survivin(T34A)量的增加而增加增敏效果；并且隨著時間的延長，化學藥物阿霉素和TATm-Survivin (T34A)對乳腺癌細胞MCF-7聯合抑制作用也隨之增加，我們可以得出結論TmSm在化學藥物療效方面有顯著的促進作用。實施例四TATm-Survivin (T34A)與阿霉素(DOX)對人上皮細胞癌KB-3-1的聯合用藥和增敏作用。研究結果顯示，當DOX單獨處理KB-3-1 30h時，IC50=0. 537士0. 66(見圖6)，而采用非常低、甚至是多細胞單獨作用無活性的目標蛋白濃度5ug/ml條件下TAT-survivin (T34A)處理 KB-3-1 30h, IC50=34. 74士 1· 05 (見圖 7)，與 DOX 共同處理 KB—3—1 細胞，DOX的IC50=0. M士 1. 91 (見圖8)，使DOX的劑量減少一倍以上，可見，目標TATm-Survivin (T34A)不僅對乳腺癌，而且在人上皮細胞癌KB-3-1對DOX也同樣以極低的劑量便具有較強的增敏效果，這將具有重要的應用價值。實施例五不同乳腺癌細胞株在阿霉素單獨作用、TmSm單獨作用、阿霉素與TmSm 聯合使用細胞形態變化。將對數期的MCF-7，T47-D, Bcap-37細胞接種于六孔板，貼壁后加入實施例一中有效劑量，370C，5%C02及飽和濕度的培養箱中孵育48h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。如圖9所示，ADM單獨作用組和聯合TmSm處理組均出現明顯細胞脫落，拉絲，皺縮現象，而經PBS處理的正常細胞組、TmSm單獨作用組均未出現脫落、拉絲、皺縮等病變。以上結果表明ADM對腫瘤細胞有明顯的殺傷作用，聯合使用TmSm及低劑量的化學藥物ADM對乳腺癌細胞株MCF-7，T47-D，Bcap-37有比ADM單獨作用的更明顯細胞毒性。綜上所述聯合用藥效果最為顯著，所以聯合增敏劑的使用具有令人鼓舞的發展前景。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑，其特征在于，所述蛋白增敏劑包括Survivin突變體蛋白，所述Survivin突變體蛋白通過基因工程制備，與survivin具有90%的同源性，所述Surv i ν in突變體蛋白包括20位、34位、84位、117位位點單點突變、多點突變、組合突變， 以及以上位點同時突變。
2.根據權利要求1所述的一種腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑，其特征在于，所述 Survivin突變體蛋白優選第34位突變。
3.根據權利要求1所述的一種腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑，其特征在于，所述蛋白增敏劑包括藥學允許的載體系統，所述載體系統指TATm、TAT33m或者碳納米管。
4.權利要求1一3任一所述的腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑在促進腫瘤化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述蛋白增敏劑聯合腫瘤化療藥物使用， 所述腫瘤化療藥物是指阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素或者紫杉醇中的一種或幾種。
6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述腫瘤是指乳腺癌、肝癌、肺癌、上皮細胞癌或者白血病。
全文摘要
本發明公開一種腫瘤化療藥物的蛋白增敏劑及其應用，所述蛋白增敏劑包括Survivin突變體蛋白，通過基因工程制備，與survivin具有90%的同源性，包括20位、34位、84位、117位位點單點突變、多點突變、組合突變，以及以上位點同時突變。蛋白增敏劑聯合腫瘤化療藥物使用，腫瘤化療藥物指阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素或者紫杉醇中的一種或幾種。本發明根據survivin蛋白在細胞信號通路中的作用以及其對多藥耐藥逆轉的影響，將化療藥物與TmSm聯合使用，發現TmSm能有效促進化學藥物的殺傷作用，有效降低化學藥物的使用量，增加化學藥物對細胞的殺傷作用，是一種有效的腫瘤化療的增敏劑。
文檔編號A61K38/17GK102366627SQ201010608978
公開日2012年3月7日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者朱玲, 許玉馨, 鄭文云, 馬興元 申請人:華東理工大學