基于fmn2基因的細胞增殖和分化失調的診斷和治療的制作方法

專利名稱：：基于fmn2基因的細胞增殖和分化失調的診斷和治療的制作方法
技術領域：
：本發明提供用于診斷細胞增殖和/或分化失調的方法，用于治療所述失調的化合物和方法以及用于鑒定可能有效用于治療細胞增殖和/或分化失調的藥劑的方法。
背景技術：
：ARF腫瘤抑制劑是哺乳動物中對抗癌基因活化的細胞防御的重要成分。高百分比的人白血病(leukaemia)和黑素瘤(melanoma)患者具有ARF突變。ARF敲除小鼠高頻率地發展腫瘤。ARF通過HDM2的抑制來穩定蛋白質，從而激活p53，HDM2是p53的E3泛蛋白連接酶。然而，對P53和ARF敲除小鼠的研究表明還存在p53不依賴性的ARF腫瘤抑制劑通路(圖1)。ARF蛋白集中在細胞核中，并且在核中定位于核仁和核質。發明_既述本發明是基于以下的發現在誘導ARF腫瘤抑制劑時，人成蛋白-2(R)rmin-2，FMN2)基因的表達顯著上調，并且能夠調節細胞周期調控蛋白p21的表達——這是一種導致細胞周期停滯的相互作用。本發明人使用基于質譜的細胞器蛋白質組學和穩定的同位素標記，S卩，SILAC，Ong,S.E.等，Stableisotopelabellingbyaminoacidsincellcultures，silac，asasimpleandaccurateapproachtoexpressionproteomics(通過細胞培養物中的氨基酸的穩定同位素標記，silac，作為表達蛋白質組學的簡單且精確的方法)，Mol.Cell.Proteomics(分子和細胞蛋白質組學)1，376-386(2002)，分析了ARF對核仁蛋白質動力學的影響。結果表明FMN2基因表達水平通過ARF誘導而得到提高，與p53無關。因此，認為FMN2基因和/或蛋白質可以作為用于治療各種細胞增殖和/或分化失調的有用標記物和藥物。此外，觀察到FMN2抑制具有細胞毒性作用，并且因此FMN2可以作為有用的藥物靶標。FMN2基因首先是通過全基因組同源性搜索鑒定出的。因此，通過搜索EST數據庫的FMN同源物，探測小鼠cDNA文庫和進一步搜索人EST數據庫，Leaser和Leder(2000)鑒定出編碼FMN2的小鼠cDNA和部分人cDNA。序列分析預測出1，567個氨基酸的小鼠蛋白，并且鑒定出的與人蛋白質同源的部分序列在其N端享有大約79%的同一性，在其C端享有90%的同一性。它們與果蠅(Drosophila)“cappucciono”蛋白也具有高同源性。FMN2的FHl結構域含有11個脯氨酸重復。Northern印跡分析揭示了在所有中樞神經系統組織和胎兒大腦中6-至7-1ΛFMN2轉錄產物的表達。全標本包埋(wholemount)原位雜交分析檢測到在9.5至10.5天時，小鼠胚胎脊髓和大腦中明顯的FMN2表達。存在很少描述FMN2分析的出版物，例如，到2010年3月為止，僅有15篇涉及FMN2的手稿可以通過NCBIPubMed找到。這些出版物中的大部分報道了小鼠減數分裂中FMN2和紡錘體重新定位之間的關聯性的分析。不存在報道人或小鼠研究中癌癥/腫瘤抑制劑活性和FMN2之間的關聯性的出版物。因此，本發明的第一個方面提供診斷細胞增殖和/和分化失調或對其易感性的方法，所述方法包括檢測成蛋白2(FMN》基因和/或蛋白表達的調節的步驟，其中FMN2基因/蛋白表達的調節指示細胞增殖和/或分化失調。應當理解術語調節包括FMN2基因和/或蛋白表達的提高和/或降低，包括FMN2基因產物活性的變化，這種變化由影響FMN2基因產物的同種型比例或轉錄后和/或翻譯后修飾事件的變化引起。FMN2基因/蛋白表達水平的提高可能與應答異常癌基因激活的ARF腫瘤抑制劑的誘導相關。因此，本領域技術人員將認識到FMN2基因/蛋白表達水平的提高可能進一步與例如由一種或多種癌基因的異常激活或缺乏活性P53引起的細胞增殖和/或分化失調(如，癌癥)相關。術語“細胞增殖和/或分化失調”可以用來包括各種疾病、病癥和/或癥狀，包括例如腫瘤病癥，如癌癥。在這點上，應當理解本發明提供的方法不限于特定類型的癌癥的診斷，并且因此可以診斷所有形式的癌、肉瘤或淋巴瘤。例如，可以診斷肺癌、乳腺癌、結腸直腸癌和皮膚癌的情況，以及例如如白血病(leukaemia)的癌癥。自體免疫和/或炎性病癥，如銀屑病(psoriasis)、過敏癥(allergy)等，也包括在該定義內。除了減數分裂失調以外，例如，術語“細胞增殖和分化失調”還包括，涉及生殖細胞增殖的可能導致不育的失調，或如肝炎(h印atitis)、肝硬化(livercirrhosis)、腎衰竭(renalfailure)、急性肺炎(acutepneumonia)、胃饋蕩(stomachulcer)、心肌梗死(cardicinfarction)、肌肉營養不良癥(musculardystrophy)禾口腦梗死(cerebralinfarction)這樣的疾病禾口/或病癥。FMN2基因和/或蛋白表達的降低可以表示特征在于異常凋亡事件的細胞增殖和/或分化失調的存在，或對細胞增殖和/或分化失調的易感性，異常凋亡事件如例如為神經變性疾病(neurodegenerativedisease)禾口急性細胞變性疾病(acutecellulardegenerativedisease)和/或如缺血性事件的病癥(例如，中風(stroke)、心肌梗死(myocardialinfarction)等)。在另一些實施方案中，在此所述的方法可以用于診斷或鑒定傾向于或易于患有細胞增殖和/或分化失調的那些受試者。在傾向于或易于患有細胞增殖和/或分化失調的受試者中，FMN2基因和/或蛋白表達的水平可能升高。在一個實施方案中，可以相對于源自健康個體(即，沒有患有細胞增殖和/或分化失調的那些)的參照或對照樣品中存在的FMN2基因/蛋白表達的水平來評價FMN2基因和/或蛋白表達的調節。以這種方式，可以容易地檢測FMN2基因和/或蛋白表達水平的提高和/或降低。術語“樣品”應當理解為包括體液的樣品，如全血、血漿、血清、唾液、汗液和/或精液。在其他情況中，可以使用如組織活體切片和/或刮削物這樣的“樣品”。特別地，可以使用來自皮膚、腫瘤或淋巴結的活體切片或刮削物。此外，樣品可以包含組織或腺體分泌物，并且可以使用沖洗實驗方案來獲得分泌至例如肺部中的流體樣品。合適的沖洗實驗方案可以包括支氣管(broncho)-肺部灌洗程序。本領域技術人員將清楚在此所述的每一種樣品可以產生一定量的FMN2核酸(S卩，DNA或RNA)和/或FMN2蛋白、肽(或其片段)。此夕卜，在此所述的方法可以包括提供樣品的第一個步驟，所述樣品來自懷疑患有細胞增殖和/或分化失調的受試者或處于發展細胞增殖和/或分化失調的風險中的受試者。如所述的，“參照樣品”可以源自未患有細胞增殖和/或分化失調、呈現出“正常”水平的FMN2基因和/或蛋白表達的受試者。如在此所述的，從其獲取樣品的受試者，或接受治療的受試者，可以是人或動物受試者。本領域技術人員將熟知這些技術，其可以用于鑒定如上述列出的那些樣品中受到調節的FMN2基因和/或蛋白表達。這些技術可以包括，例如，基于聚合酶鏈式反應(PCR)的技術，如實時PCR(也稱為定量PCR)。在本發明的情況中，實時PCR可以用于測定編碼FMN2蛋白的基因的表達水平。通常并且為了定量特定核酸序列的表達水平，可以使用逆轉錄酶PCR，將相關的mRNA逆轉錄成互補DNA(cDNA)。優選，逆轉錄酶實驗方案可以使用設計來特異性擴增目標mRNA序列的引物。此后，可以使用PCR來擴增通過逆轉錄產生的cDNA。通常，使用設計來特異性地與特定序列雜交的引物來擴增cDNA，并且用熒光或放射性標記的化合物來標記用于PCR的核苷酸。本領域技術人員將熟知使用標記的核苷酸來定量PCR過程中產生的DNA的量的技術。簡言之，并且例如，可以通過監控PCR循環過程中結合的標記的核苷酸的量來測定標記的擴增的核酸的量。關于在此所述的基于PCR技術的更多信息可以在例如PCRPrimer=ALaboratoryManual(PCR引物實驗室手冊)，第二版，由CarlW.Dieffenbach&GabrielaS.Dveksler編輯=ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實驗室出版社)和MolecularCloning:ALaboratoryManual(^v^3H:^),JosephSambrook&DavidRussell:ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實驗室出版社)中找到。可以用于測定樣品中的FMN2基因表達水平的其他技術，包括，例如，Northern和/或Southern印跡技術。Northern印跡可以用于測定樣品中存在的特定mRNA的量，并且因此可以用于測定FMN2基因表達的量。簡而言之，可以使用本領域技術人員已知的技術，從細胞中提取出mRNA，并進行電泳。然后可以使用核酸探針來檢測和定量樣品中存在的特定mRNA的量，所述核酸探針設計來與目標mRNA序列(在這種情況下，是編碼FMN2蛋白的mRNA)雜交(即，與目標mRNA序列互補或基本上互補)。另外地，或備選地，可以通過微陣列分析來鑒定FMN2基因表達的水平。這樣的方法將涉及DNA微陣列的使用，所述DNA微陣列包含源自FMN2基因的核酸。為了鑒定FMN2基因表達的水平，本領域技術人員可以從樣品中提取出核酸，優選mRNA，并將其進行擴增實驗方案，如逆轉錄酶PCR，以產生cDNA。優選，可以使用對特定mRNA序列(在這種情況中，為編碼FMN2基因的序列)特異性的引物。可以將擴增的FMN2cDNA進行進一步的擴增步驟，任選在標記的核苷酸(如上所述的)的存在下進行。此后，可以將任選標記的擴增的cDNA在允許結合微陣列的DNA的條件下與微陣列接觸。以這種方式，可以鑒定FMN2基因表達的水平。此外，可以使用其他技術，如深度測序(de印sequencing)和/或焦磷酸測序(pyrosequencing)，來檢測如上所述的任一種樣品(特別是細胞提取物)中的FMN2序列。關于這些技術的更多信息可以在"Applicationsofnext-generationsequencingtechnologiesinfunctionalgenomics(下一代測序技術在功能性基因組學中的應用)”，OlenaMorozovaa和MarcoA.Marra,Genomics(基因組學)，第92卷，第5期，2008年11月，第255-264頁禾口"PyrosequencingshedslightonDNAsequencing(焦憐酸測序有助于闡明DNA測序)”，Ronaghi，GenomeResearch(基因組研究)，Vo1.11，2001，第3-11頁中找到。鑒于以上所述的，本發明的第二個方面提供編碼成熟FMN2蛋白的互補DNA(cDNA)和獲得該cDNA的方法。在一個實施方案中，本發明提供的cDNA包含圖2和3中所示的一種或多種序列。在進一步的實施方案中，通過位于染色體l，lq43(區域238321604-238705112)上的基因組DNA的序列的轉錄和翻譯后修飾來形成FMN2cDNA序列。5，-本發明還包括cDNA序列，其與以上序列及其物種特異性同源物相似。因此，本發明包括與所鑒定的cDNA序列為85%、90%、95%、89%或99%相同水平的序列。這些同源序列因此可以對應于與相同物種內或物種之間的突變相關的變異，并且可以特別地對應于至少一個核苷酸的剪截、置換、缺失和/或添加。所述同源序列還可以對應于與遺傳密碼簡并性或遺傳密碼偏好性相關的變異，遺傳密碼偏好性對于科、種或變種是特異性的。可以使用本領域已知的各種序列比較算法和程序中的任一種來評價蛋白質和/或核酸序列同源性。這樣的算法和程序包括，但決不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院學報)85(8)=2444-2448；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.(分子生物學雜志)215(3)403-410;Thompson等，1994，NucleicAcidsRes.(核酸研究)22(2):4673-4680；Higgins等，1996，MethodsEnzymo1.(酶學方法)266:383-402;Altschul等，1990，J.Mol.Biol.(分子生物學雜志)215(3):403-410；Altschul等，1993，NatureGenetics(自然遺傳學)3266-272)。在特別優選的實施方案中，使用本領域公知的基礎局部比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool，“BLAST”)來評價蛋白質和核酸序列同源性(參見，例如，Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院學報)872267-2268；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.(分子生物學雜志)215:403-410；Altschul等，1993，NatureGenetics(自然遺傳學)3:266-272；Altschul等，1997，Nuc.Acids.Res.(核酸研究)25=3389-3402)BLAST程序評價了所鑒定的所有高評分區段對的統計學顯著性，并且優選選擇滿足使用者指定的顯著性閾值(如使用者指定的百分比同源性)的那些區段。優選，使用Karlin的統計學顯著性公式評價高評分區段對的統計學顯著性(參見，例如，Karlin和Altschul,1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院學報),87:2267-2268)。與本發明的序列互補的核苷酸序列理解為意指其核苷酸序列與本發明的那些序列互補并且方向相反的任何DNA(反向平行序列)。在代表性的片段中，優選能夠在嚴謹條件下與本發明所述的核苷酸序列雜交的那些。在嚴謹條件下的雜交意思是選擇溫度和離子強度條件，使得它們允許維持兩個互補DNA片段之間的雜交。通過舉例說明的方式，用于限定以上所述的核苷酸片段的目的的雜交步驟的高嚴謹條件有利地是以下的條件在SSC緩沖液的存在下，在65°C的優選溫度下進行雜交，IXSSC對應于0.15MNaCl和0.05M檸檬酸鈉。例如，洗滌步驟可以是下述室溫下，2.SSC，0.1%SDS洗滌，接著在68°C下，用1XSSC，0.1%SDS；0.5XSSC,0.1%SDS；0.1XSSC，0.1%SDS洗滌三次，持續15分鐘。對于兩個序列之間的雜交，中等嚴謹條件，例如，在5XSSC緩沖液的存在下，使用60°C的溫度，或低嚴謹性，例如，在5XSSC緩沖液的存在下，50°C的溫度，各自需要較低的整體互補性。對于更大或更小大小的寡核苷酸，本領域技術人員將根據Sambrook等，1989的教導調整上述用于大小約300個堿基的多核苷酸的嚴謹雜交條件。應該理解同源多肽用來指定呈現出與天然多肽相關的特定修飾的多肽(所述修飾特別地例如為至少一個氨基酸的缺失、添加或置換，剪截，延伸，嵌合融合和/或突變)，或呈現出翻譯后修飾的多肽。在同源多肽中，優選其氨基酸序列呈現出與根據本發明所述的多肽的氨基酸序列至少80%(優選90%)同源性或同一性的那些。在置換的情況中，一個或多個連續的或不連續的氨基酸由“等價”氨基酸替代。表述“等價”氨基酸在此用來表示能夠置換基礎結構中的氨基酸之一然而沒有實質性地改變相應肽的生物學活性的任何氨基酸，并且如下文所定義的。本發明還包括主要基因轉錄產物的剪接變體和由其編碼的翻譯的FMN2剪接變體蛋白。此外，本領域技術人員將容易認識到多腺苷酸化變體和起始密碼子變體，包括編碼這些變體的cDNA序列，也可以包括在本發明的范圍內。本發明提供的cDNA可以用于產生重組FMN2蛋白，并且本領域技術人員將熟知用于產生重組蛋白的技術和實驗方案(參見，例如，GerdGellissen等，2005)。此外，可以將cDNA用于作為檢測FMN2基因和/或蛋白表達的手段的測定或微陣列中。例如，可以在高嚴謹條件下，將獲自如在此詳述的那些樣品的cDNA與核酸(即，DNA)探針(如，從基因組DNA的片段產生的那些)接觸，使得含有與cDNA中存在的那些互補的序列的DNA探針與cDNA之間產生結合。產生cDNA時，可以用熒光或放射性標記的化合物來標記用于PCR程序的核苷酸。以這種方式，可以容易地檢測到與微陣列等結合的cDNA。為了測定樣品中的FMN2蛋白的水平，可以使用利用能夠結合FMN2蛋白的試劑的免疫學技術。術語蛋白質理解為指的是完整的FMN2蛋白，及其剪接變體、同種型功能性片段、突變形式和物種特異性同源物。在一個實施方案中，在此所述的方法可以包括在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白與基底締合、相互作用、結合和/或固定的條件下，將所述基底(或其一部分)與待測試的樣品接觸的步驟。合適的基底可以包括，例如，玻璃、硝化纖維素、紙、瓊脂糖和/或塑料。基底，如，例如，塑料材料，可以采用微量滴定平板的形式。或者，接觸待檢測樣品的基底可以包含能夠結合FMN2蛋白的試劑。優選，能夠結合FMN2蛋白的試劑結合在基底(或其至少一部分)上。合適的結合試劑可以包括，例如，抗體，如單克隆抗體或多克隆抗體和/或其他類型的能夠結合FMN2蛋白的肽或小分子。將理解這種定義適用于在此提及的所有類型的結合試劑。因此，可以在允許能夠結合FMN2蛋白的試劑與樣品中存在的任何FMN2蛋白之間的結合或相互作用的條件下，將基底(或其一部分)接觸待測試的樣品。可以使用另一種能夠結合FMN2蛋白的試劑(下文中稱為“一級結合試劑”)來檢測結合到基底或能夠結合FMN2蛋白的試劑上的任何FMN2蛋白。另外地，或備選地，所述一級結合試劑可以具有對FMN2蛋白基底或包含FMN2蛋白和上述能夠結合FMN2蛋白的試劑的復合物的親和性，或結合FMN2蛋白基底或包含FMN2蛋白和上述能夠結合FMN2蛋白的試劑的復合物。一級結合試劑可以與允許它們得到檢測的結構部分(下文中稱為“可檢測的結構部分”)綴合。例如，所述一級試劑可以與能夠通過比色化學發光反應來報告水平的酶綴合。這樣綴合的酶可以包括但不限于辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AlkP)。另外地，或備選地，一級結合試劑可以綴合到熒光分子上，如，例如，熒光團，如FITC、若丹明或德克薩斯紅(TexasRed)。可以綴合到結合試劑上的其他類型的分子包括放射性標記的結構部分。或者，可以通過另一種對一級結合試劑具有親和性的結合試劑(下文中稱為“二級結合試劑”)來檢測結合到基底或能夠結合FMN2蛋白的試劑上的任何FMN2蛋白。優選，二級結合試劑與可檢測的結構部分綴合。結合FMN2蛋白的一級結合試劑(或與其結合的二級結合試劑)的量可以表示測試樣品中存在的FMN2蛋白的水平。在一個實施方案中，鑒定FMN2蛋白水平的方法可以采用“浸量尺(dip-stick)”測試的形式，其中在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白與基底結合或與基底上結合或固定的結合試劑結合的條件下，將基底(或其一部分)與待測試的樣品接觸。在進一步的實施方案中，這些方法可以采用免疫學測定的形式，如，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)。ELISA可以采用“捕獲”ELISA的形式，其中，將待測試的樣品接觸基底，并且通過結合或固定在基底上的結合試劑(能夠結合FMN2蛋白)“捕獲”或結合樣品中存在的任何FMN2蛋白。或者，可以在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白和基底之間“直接”結合的條件下，將樣品與基底接觸。以上所述的每一種ELISA方法可以包括“直接”FMN2蛋白檢測步驟或“間接”鑒定步驟。可以將涉及這些步驟的ELISA稱為“直接”ELISA或“間接”ELISA。“直接”ELISA可以涉及在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白與基底結合和/或與基底上結合的結合試劑結合的條件下，將待測試的樣品接觸基底。任選的封閉步驟后，可以通過能夠結合FMN2蛋白的試劑(即，一級結合試劑)來檢測結合的FMN2蛋白。優選，一級結合試劑與可檢測的結構部分綴合。“間接”ELISA可以在FMN2蛋白與一級結合試劑接觸后，包括另一個步驟即使用另一種對一級結合試劑具有親和性或特異性的結合試劑(二級結合試劑)的步驟。優選，所述二級結合試劑可以與可檢測的結構部分綴合。可以用于鑒定樣品中FMN2蛋白水平的其他免疫學技術包括，例如，免疫組織化學，其中在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白和FMN2蛋白結合試劑結合的條件下，將結合試劑，如能夠結合FMN2蛋白的抗體，與樣品(如上述那些)接觸。通常，在將樣品與結合試劑接觸之前，用例如去污劑，如TritonXlOO，處理樣品。這樣的技術可以稱為“直接”免疫組織化學染色。或者，可以將待測試的樣品進行間接免疫組織化學染色實驗方案，其中，在樣品與FMN2蛋白結合試劑接觸后，使用另一種對FMN2蛋白結合試劑是特異性的、對FMN2蛋白結合試劑具有親和性的或能夠結合FMN2蛋白結合試劑的結合試劑(二級結合試劑)來檢測FMN2蛋白/結合試劑復合物。本領域技術人員將理解在直接和間接免疫組織化學技術中，結合試劑或二級結合試劑可以綴合到可檢測的結構部分上。優選，結合試劑或二級結合試劑綴合到能夠通過比色化學發光反應報告結合的結合試劑或二級結合試劑的水平的結構部分上。還可以使用功能化的納米-懸臂梁生物傳感器(nano-cantileverbiosensor)和相似的裝置來檢測FMN2蛋白和同種型、物種特異性同源物和片段(Fritz，J.Analyst(分析雜志),2008,133,855-863)。為了鑒定樣品中存在的FMN2蛋白的水平，可以將免疫組織化學染色的結果與關于參照樣品進行的免疫組織化學染色的結果相比較。例如，顯示出結合的FMN2蛋白結合試劑(或二級結合試劑)比參照樣品多或少的樣品可能是由患有或易患有細胞增殖和/或分化失調的受試者提供的。利用能夠結合FMN2蛋白的試劑的應用的其他技術包括，例如，如^iestern印跡或斑點印跡的技術。Western印跡可以涉及將樣品進行電泳，使得分離或解析樣品的組分，例如，蛋白質組分。然后將解析的組分轉移至基底，如硝化纖維素上。為了鑒定樣品中存在的任何FMN2蛋白，可以在允許樣品中存在的任何FMN2蛋白和能夠結合FMN2蛋白的試劑之間結合的條件下，將基底與能夠結合FMN2蛋白的結合試劑接觸。有利地，能夠結合FMN2蛋白的試劑可以綴合到可檢測的結構部分上。或者，可以將基底與另一種對能夠結合FMN2蛋白的結合試劑具有親和性的結合試劑接觸。有利地，所述另一種結合試劑可以綴合到可檢測的結構部分上。在斑點印跡的情況中，可以將樣品或其一部分接觸基底，使得樣品中存在的任何FMN2蛋白結合或固定在基底上。可以如上所述進行任何結合或固定的FMN2蛋白的鑒定。在上述任一種技術中，檢測到的一級或二級結合試劑的量表示樣品中存在的FMN2蛋白的量，或與樣品中存在的FMN2蛋白的量成比例。此外，可以將在此所述的任一種或所有診斷方法中獲得的結果與源自已知未患有或不易患有細胞增殖和/或分化失調的健康受試者的參照或對照樣品獲得的結果相比較。以上概括所述的測定在“TheImmunoassayHandbook(免疫測定手冊)”2005，DavidWild編輯，ElsevierLtd中有更詳細地描述，其指導本領域的讀者。應該理解，除了由例如ARF腫瘤抑制劑的誘導引起的調節的(即，提高的或降低的)FMN2基因和/或蛋白表達，FMN2基因序列中的一個或多個突變的存在也可能導致異常的FMN2基因/蛋白表達。例如，異常活性的啟動子序列可以引起FMN2基因的異常表達。核酸序列中的突變可以采取一個或多個核苷酸添加、缺失、倒置和/或置換的形式，并且上調的FMN2表達可以由一個或多個這些類型的突變的存在引起。因此，如PCR和/或限制性片段長度多態性分析的技術可以用于檢測已知導致異常(即，升高或降低的)FMN2表達的突變或特定序列基序的存在。在一個實施方案中，可以將核酸的片段(其包括可能帶有突變的FMN2序列的一部分)擴增并測序，以測定FMN2是否包含突變。或者，可以擴增這種類型的片段，并使用合適的寡核苷酸和非常嚴謹的雜交/洗滌條件(參見，例如，Sambrook等，2001)進行雜交研究。本領域技術人員將理解也可以使用包含修飾的核堿基(nucleobase)和/或PNA單體的化學修飾寡核苷酸或非標準寡核苷酸或包含肽核酸的那些。以這種方式，只有精確匹配的寡核苷酸結合所擴增片段的一個或多個包含突變的區域。還適于首先擴增包含可能含有或可能不含有突變的序列的DNA片段，并且此后使用擴增片段內部的引物進行進一步的PCR反應來檢測該片段是包含天然序列還是包含突變序列，以檢測突變或相反。這樣的技術通常稱為巢式PCR。此外，突變可以產生新的限制位點，或導致野生型或天然FMN2序列中存在的限制位點的丟失一一通過RFLP分析可以容易地檢測到這些變化。包含突變的片段，如果存在，首先可以使用合適的引物來擴增，并且此后將片段進行RFLP分析，條件是突變或天然序列具有相應的天然或突變序列中不存在的限制位點。根據本發明，在此鑒定的示例性突變導致新限制位點的產生，這可以通過首先擴增包含突變的片段并且此后使用合適的限制酶限制所獲得的片段來容易地檢測一一只有包含突變序列的片段將得到限制。本發明還延伸至試劑盒，其包含一種或多種用于檢測FMN2序列中的一個或多個突變或用于以上所述的更全面的檢測和探測實驗方案的寡核苷酸/引物。該試劑盒還可以包含有助于例如測序、進行PCR和/或RFLP分析的其他試劑。這樣的試劑盒還可以包含使用它們來檢測FMN2基因中的一個或多個突變和任選怎樣解釋突變是否可以導致發展或易于發展上述任一種疾病/病癥的說明書。相似地，試劑盒包含一種或多種結合試劑，如FMN2特異性抗體，并且任選地，可以提供如在此所述的二級結合試劑來檢測FMN2蛋白。本發明的寡核苷酸/引物還可以用于本領域技術人員已知的多重PCR技術中，參見，例如，KupersteinG,JackE和NarodSA；GenetTest(遺傳檢測)·10(1):1-7(2006),使得可以鑒定FMN2序列中的突變。可以用于檢測樣品(包括FMN2剪接體、起始密碼子和/或多腺苷酸化變體)中FMN2基因和/或蛋白表達水平的其他方法包括，例如，質譜技術。例如，通過酶消化(如使用胰蛋白酶分裂)或化學分裂，可以將分離的蛋白分裂成可預測的片段，并且可以在質譜儀中檢測和/或測量所得肽的質量/電荷比。通過將結果與使用參照或對照樣品(即，包含正常表達的標準、野生型或非變體FMN2蛋白/基因的樣品)獲得的那些相比較，可以使用質譜檢測到不同樣品中FMN2蛋白和/或基因表達水平的變化。在一個實施方案中，參照或對照樣品可以包含用化學標記物或通過結合重同位素標記的FMN2基因和/或蛋白。關于這些類型的實驗方案的更多信息可以在Aebersold，R.&Mann.Μ.Massspectrometry-basedproteomics(基于質譜的蛋白質組學).Nature(自然)422，198-207Q003)，Ong,SE等，Stableisotopelabellingbyaminoacidsincellcultures,silac,asasimpIeandaccurateapproachtoexpressionproteomics(通過細胞培養物中的氨基酸的穩定同位素標記，silac，作為表達蛋白質組學的簡單且精確的方法)，Mol.Cell.Proteomics(分子和細胞蛋白質組學)1，376-386(2002)中找到。鑒于本發明人的發現FMN2基因和/或蛋白的抑制具有細胞毒性作用(參見關于進一步討論和數據的詳述)，本發明的第三個方面提供能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達/功能的化合物，所述化合物用于治療細胞增殖和/或分化失調。第四個方面提供能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達/功能的化合物用于制備治療細胞增殖和/或分化失調的藥物的用途。本發明的第五個方面提供治療細胞增殖和/或分化失調的方法，所述方法包括將能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達/功能的化合物施用于需要其的受試者的步驟。術語“調節”應當理解為包括FMN2基因/蛋白表達相對于“正常”或“健康”系統中產生的FMN2基因和/或蛋白表達水平的提高和/或降低。本領域技術人員將認識到“正11常”或“健康”系統可以是源自未患有細胞增殖和/或分化失調的受試者，或由未患有細胞增殖和/或分化失調的受試者提供。能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達的化合物可以包括，例如，DNA或RNA寡核苷酸或這些寡核苷酸的化學修飾衍生物和/或反義寡核苷酸，其能夠與FMN2DNA或RNA特異性地雜交。在一個實施方案中，寡核苷酸可以是本領域技術人員已知的作為小/短干擾和/或沉默RNA的RNA分子，并且在下文中將其稱為siRNA。這些siRNA寡核苷酸可以采取天然RNA雙鏈體或已經通過某種方式(例如，通過化學修飾)進行了修飾以具有核酸酶抗性的雙鏈體的形式。另外地，或備選地，siRNA寡核苷酸可以采取對應或包含在此所述的siRNA的短發夾RNA(shRNA)表達或質粒構建體的形式(參見，例如，GregoryJ.Hannon等，2003)。本領域技術人員將容易理解在此所述類型的反義寡核苷酸可以用于調節(例如，抑制、下調或基本上消除)任何給定基因的表達。此外，基因表達或功能的調節對由受到調節的基因編碼的任何蛋白的表達和/或功能具有相似或“敲擊(knock-on)”作用。因此，可以設計本發明提供的(反義)寡核苷酸，以調節FMN2基因和/或其蛋白產物的表達和功能。通過分析天然或野生型FMN2序列并借助如BIOPREDsi的算法，本領域技術人員可以容易地測定或通過計算預測對于這些基因具有最佳敲低(knockdown)作用的核酸序列(參見，例如:http://www.biopredsi.org/start.html)。因此，本領域技術人員可以產生并測試不同寡核苷酸的陣列或文庫，以測定它們是否能夠調節FMN2基因和/或蛋白的表達或功能。在一個實施方案中，反義寡核苷酸可以是針對FMN2mRNA的siRNA分子并且具有序列5’-GUAUACCAGGUCUCCUCAA-3’鑒于以上的，在此所述的反義寡核苷酸和/或siRNA分子可以用于⑴治療細胞增殖和/或分化失調，()制備用于治療細胞增殖和/或分化失調的藥物或(iii)治療患有細胞增殖和/或分化失調的受試者的方法中。作為基因表達的siRNA控制的備選方案，可以通過設計調節FMN2表達的特定snoRNA構建體來實現基因表達的靶向調節。例如，在PCT/GB2008/003211中描述了實現這一情況的方法。在其他實施方案中，能夠結合FMN2蛋白的抗體可以用在細胞增殖和/或分化失調的治療中。阻斷或中和FMN2蛋白的功能或阻斷FMN2蛋白和其他蛋白(例如，細胞周期蛋白P21)之間的相互作用的抗體是特別有用的。用于產生多克隆和/或單克隆抗體(mAbs)的技術是本領域公知的并且在上述的"TheImmunologyHandbook(免疫學手冊)”中有描述，并且可以容易地用來產生對FMN2蛋白或其片段特異性的抗體，其與任何天然P21競爭性地競爭。用于細胞增殖和/或分化失調治療中的其他化合物可以包括，例如，蛋白質、肽、氨基酸、碳水化合物和其他小的有機分子。例如，能夠干擾或阻止FMN2和細胞周期蛋白p21之間的相互作用的化合物可以是特別有用的。這樣的化合物可以采取完整的P21蛋白或其片段的形式。另外地，或備選地，能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達/功能的化合物可以特異性地結合鑒定為對FMN2功能和/或FMN2蛋白和細胞周期調節涉及的其他蛋白(例如p21)之間的相互作用重要的FMN2蛋白的特定區域。在一些情況中，能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達/功能的化合物可以間接影響其他基因和/或蛋白(如，例如，p53和/或Hdm2)的表達和/或功能。其他化合物可以對其他基因和/或蛋白的表達和/或功能沒有影響。本發明的第六個方面提供鑒定或獲得調節FMN2基因和/或蛋白表達的試劑的方法，所述方法包括將FMN2基因或蛋白與測試試劑接觸并檢測FMN2基因和/或蛋白表達/功能的任何調節的步驟。本領域技術人員將認識到可以在系統(如，例如基于細胞或無細胞的系統)中進行如本發明的第六個方面中所述的方法，這些系統進行了改變以包括FMN2基因和/或表達FMN2蛋白。例如，可以用包含FMN2基因的核酸轉染細胞。在一個實施方案中，核酸可以采用載體(例如，本領域公知的質粒或表達盒)的形式。在一個實施方案中，可以將獲自上述方法的結果與獲自對照方法的那些相比較，在對照方法中，已經將FMN2基因和/或蛋白不與測試試劑接觸。以這種方式，可以測定所述試劑是否能夠調節FMN2基因或蛋白的表達。在FMN2基因或蛋白表達的水平低于或高于對照方法中檢測到的表達水平的情況中，測試試劑可以用作FMN2基因和/或蛋白表達的調節齊U。在表達水平與對照方法中觀察到的相同的情況中，測試試劑很可能不能夠調節FMN2基因或蛋白的表達。合適的測試試劑可以采用核酸(例如，上述的反義寡核苷酸)、蛋白質、肽、氨基酸、抗體(及其片段)、碳水化合物和其他小的有機分子的形式。在第七個方面中，本發明提供一種藥物組合物，其包含上述任一種化合物(例如，寡核苷酸、抗體、小的有機化合物、P21蛋白或其片段)和/或通過本發明第六個方面提供的方法鑒定的并且能夠調節FMN2基因/蛋白表達或功能的任一種試劑，結合藥物學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。這樣的組合物可以在例如細胞增殖和/或分化失調(如上所述的那些)的治療中找到應用。優選地，本發明提供的藥物組合物配制成無菌藥物組合物。合適的賦形劑、載體或稀釋劑可以包括，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、磷脂酰膽堿、血清蛋白(如血清白蛋白)、緩沖物質(如，磷酸鹽)、甘油、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水鹽或電解質，如，硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態硅石、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質、聚乙烯糖原(polyethyleneglycon)、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂等，或其組合。所述藥物制劑可以例如配制成適于口服、腸道外或局部給藥的形式。為局部給藥配制的藥物組合物可以呈現為膏劑、在水性或非水性液體中的溶液或混懸液、或水包油型液體乳劑。如所述的，本發明是基于如下觀察FMN2過表達在mRNA水平受到ARF誘導的上調。因此，FMN2基因具有ARF應答性啟動子，其自身可以在基因治療領域中找到應用。因此，本發明還延伸至預防性地或治療性地治療上述任一種疾病/病癥的方法，所述方法通過將包含處在ARF應答性FMN2啟動子控制下的基因序列或其片段的DNA構建體施用于患有或傾向于發展上述任一種疾病的患者，其中所述基因序列或其片段能夠表達在所述疾病和/或病癥的治療中可能有用的蛋白質的一個或多個拷貝，由此所述蛋白質的所述一個或多個拷貝的表達治療或改善了所述疾病/病癥。通常，將在細胞增殖和/或分化失調的治療中可能有用的蛋白質以包含處在合適的轉錄/翻譯控制下的所述基因序列的重組分子的形式施用于受試者，從而在施用于受試者時，可能有用的蛋白質得到表達。將認識到基因序列或片段可以處于合適的啟動子的控制下，如組成型和/或可控制啟動子。方便的啟動子包括天然FMN2啟動子下文中稱為ARF應答性啟動子。ARF應答性啟動子位于chrl:238，139，341-238，321，875內(182468個堿基)。本發明人進一步表征了啟動子區域，如在實施例部分中所述。在這點上，FMN2起始密碼子上游約2Kb的區域已經顯示出具有啟動子和成為ARF應答性的能力。待表達的蛋白可以是細胞毒性劑，如胞嘧啶脫氨酶和單純皰疹病毒胸苷激酶等(CestmirAltaner,2008)，其僅作為ARF存在的結果才表達，例如，在癌細胞中。這還可以預防性地用于施用給可能傾向于發展上述疾病/病癥的受試者，使得只在發生ARF激活時才產生表達。因此，本發明還提供一種用于治療中的重組分子，其包含處在FMN2ARF應答性啟動子控制下的編碼蛋白或其片段的基因序列。重組分子可以是質粒、噬菌粒或病毒載體的形式。此外，可以生產重組表達的、或化學合成的FMN2蛋白，或其功能上重要的片段，并用作與FMN2表達降低相關的細胞增殖和/或分化失調、或受試者表達突變或異常形式的FMN2時的治療或預防措施。許多用于基因治療中的不同病毒和非病毒載體及其遞送方法是已知的，如腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、脂質體、DNA疫苗接種寸。例如，在失調(如例如細胞增殖和/或分化失調，特別是涉及ARF誘導的細胞增殖和/或分化失調)的治療中可能有用的基因，可以與本文所述的FMN2ARF應答性啟動子連接。ARF應答性啟動子可以借助改造的包含FMN2ARF應答性啟動子序列的載體而連接到可能有用的基因上。合適的載體可以包括，例如，質粒或核酸盒。然后可以使用載體(可能作為藥物)來治療上述失調。本領域技術人員將認識到通過基因療法治療細胞增殖和/或分化失調的任一種方法可以包括將基因/FMN2ARF應答性啟動子復合物施用于需要其的受試者的步驟，使得基因在FMN2ARF應答性啟動子的控制下在受試者中得到表達。本領域技術人員將認識到在待治療的失調與ARF腫瘤抑制劑的誘導相關的情況中，在此所述的方法和藥物特別有用。還將認識到在此所述的藥物和方法可以涉及將核酸構建體直接施用于患病組織(例如，通過注射到腫瘤中)或通過上述任一種其他途徑來給藥。ARF應答性FMN2啟動子可以包含與備選啟動子(如，CMV啟動子等)融合的ARF應答性元件。詳述現在將參照以下附圖來詳細地描述本發明，所述附圖顯示圖1.ARF腫瘤抑制劑信號傳導的示意圖。ARF腫瘤抑制劑是對抗癌基因激活的細胞防御的重要組分。高百分比的白血病(leukaemia)和黑素瘤(melanoma)患者具有ARF突變。ARF敲除小鼠高頻率地發生腫瘤。ARF通過抑制HDM2(其是p53的E3泛蛋白連接酶)來穩定蛋白，從而激活P53。然而，對p53和ARF敲除小鼠的研究顯示了還存在p53不依賴性的ARF腫瘤抑制劑途徑。圖2a.編碼FMN2的N-端區域的序列。在外顯子1中存在2個可能的起始密碼子并且以粗體顯示；圖2b.編碼FMN2的C-端區域的序列。以粗體顯示siRNA靶向的序列。圖3.FMN2的完整cDNA序列；大寫字母顯示FMN2蛋白編碼區(圖13中的蛋白序列)。小寫字母顯示了來自人基因組數據庫的3’UTR。用下劃線顯示通過人基因組計劃預測的起始密碼子。用灰色陰影顯示了該研究發現的新起始密碼子和編碼序列。圖4.FMN2序列的示意圖。FMN2基因位置(從第1個ATG至TGA)。(ATG)chrl238，321，604-238，704，077(TGA)。序列1從外顯子1的第一個ATG至外顯子1和外顯子2連接處，使用引物FMN2ExlF2和FMN2Exl_2Rl。序列2從外顯子1的第二個ATG至外顯子1和外顯子2連接處，使用引物FMN2ExlF3和FMN2Exl-2Rl。序列3從外顯子1和外顯子2連接處至外顯子4結束，使用引物FMN2Exl-2Fl和FMN2Ex4_5Rl(來自報道的起始密碼子)。序列4完整的外顯子5，使用引物FMN2Ex5Fl和FMN2Ex5Rl(來自報道的起始密碼子)。序列5從外顯子13開始至外顯子18，包括終止密碼子，使用引物FMN2Exl3Fl和FMN2Exl8Rl(來自報道的起始密碼子)。箭頭表示我們通過質譜檢測的位置。圖5.核仁蛋白動力學的測定。a.三個細胞群中的蛋白質組通過摻入精氨酸的穩定同位素衍生物來編碼(SILAC方法)。用ArgO、Arg6和ArglO通過代謝來標記細胞，持續至少五次細胞倍增，然后用IPTG各自處理0、4和8小時或0、16和M小時，以誘導pl4ARF。將細胞混合、純化核仁并通過質譜分析。使用公共零點，將分析重復三次。b.C.pl4ARF肽的質譜，表示遞增量的P14ARF被召集到核仁中。d.pl4ARF的動力學特征。Y軸是pl4ARF的標準化倍數變化的單位。圖6.測量核仁蛋白動力學的不同方法的比較。a.在強力霉素(doxycyclin)誘導(5ygπιΓ1)過程中表達GFP-ARF的活U20S細胞，并且成像持續M小時。核仁內的變化。將GFP熒光信號(藍色曲線)與分離的核仁中通過SILAC檢測到的誘導的pl4ARF的水平變化相比較。誤差棒是來自每個情況中五個單獨的細胞的熒光測量的標準偏差。b.U20S細胞中瞬時轉染的核仁蛋白和GFP-ARF的表達模式。圖7.核仁蛋白的動力學特征。a.從第一個時間點到最后一個時間點顯示出變化的所有蛋白。b.使用倍數變化數據的3500個蛋白的分級群聚。c.在p53陰性E6細胞中誘導后4小時，通過時間點顯示了前50個顯示出最大百分比變化的蛋白的時間過程變化。圖8.FMN2的表達模式。固定NARF2(A-H)、E6(L-P)細胞a.和U20S(A-H)、Hela(L-P)細胞b.，并且對DNA(藍色)、和抗-FMN2抗體或抗-pl4ARF抗體(綠色)，使用DAPI染色。用或不用IPTG將細胞培養M小時，以誘導外源P14ARF表達。圖9.ARF激活過程中的微陣列分析。用IPTG將NARF2細胞培養M小時，以誘導外源ARF表達。我們從我們的最終數據集中選擇FMN2、HDM2、p21、pl4ARF、環形體蛋白、B23、核仁蛋白(Nucleoln)、ATM/ATR和核仁纖維蛋白(Fibrillarin)，并顯示為log2比例。圖10.用于FMN2的siRNA方法。用對照、DNA-PK或FMN2siRNA處理NARF2細胞，并在用或未用M小時IPTG誘導的前提下，收集48小時。圖11·a-b.FMN2耗盡的作用。c.IPTG的作用禾口d.ARF誘導和UV對FMN2誘導。e.ARF誘導以及對FMN2與p53締合的影響。圖12.a.FMN2耗盡對p21表達的作用。b.Wdc9耗盡對ARF的FMN2誘導的作用。c-e.用于FMN2的siRNA方法。圖12c顯示了FMN2通過阻止蛋白質組途徑穩定p21。圖13顯示了FMN2的蛋白序列和用于抗體生產的抗原區。顯示了人FMN2氨基酸序列。在該研究中鑒定的新的其他序列顯示為灰色(la.a.-143a.a.)。抗原序列顯示為粗體(請參閱方法和圖15A)。商購的FMN2抗體(Abnova)的抗原區也顯示為灰色(也請參閱方法)。圖14顯示了Western印跡的結果，顯示了用關于PA^γ和Skp2的siRNA拯救FMN2耗盡。圖15A顯示了FMN2蛋白和結構域的示意圖。示意圖顯示了用于產生單克隆抗體(m22Ab)和多克隆抗體(p31Ab)的蛋白區域。示意圖還顯示了由其產生了兩個截短的綴合的多肽mCherry-FMN2Ex6_2和mCherryFMN2Ex13-18的蛋白區域。圖15B顯示了兩個抗體p3IAb和m22Ab的共同定位分析；圖15C顯示了p31Ab對以mCherryF麗2Ex13-18過表達的多肽的特異性。圖16A顯示了使用FMN2抗體p31Ab和m22Ab的免疫沉淀(IP)分析的結果。圖16B和C顯示了進一步的IP分析；圖17顯示了FMN2和p21(CIPl)的共同定位；圖18A和18B顯示了檢測FMN2的啟動子的研究的結果；圖18C顯示了FMN2的啟動子和ARF應答性增強子元件的示意圖；和圖19顯示了肺原代細胞和肺癌細胞之間的FMN2表達分析的結果；和圖20顯示了pl4ARF-FMN2途徑的模型。材料和方法穩定的同位素標記的核仁蛋白的分離在ARF誘導之前，將細胞在L-精氨酸、L-精氨酸13C614N4-或L-精氨酸13Cf^N4-標記的培養基中生長至少五次細胞分裂。為了誘導外源P14ARF，將ImM終濃度的IPTG加入所有細胞中并分別培養4、8、16和對小時。重復實驗，以產生總共五個時間點，使用未處理的ArgO細胞作為公共零時間點。按照之前所述的(http://WWW.lamondlab.com/f5nucleolarprotocol.htm)，從NARF2和E6分離核仁。將分離的核仁蛋白在NuPAGE4-12%Bis-Tris凝膠上進行分離，并切成12片。從凝膠片中提取由凝膠內消化(in-geldigestion)得到的肽，脫鹽并在反相C18尖端(reverse-phaseC18tip)上濃縮，并洗脫至96-孔平板中，用于自動化質譜分析。質譜和數據分析使用LTQObitrap(ABI)，通過結合串聯質譜的液相色譜(AgilentHPllOO)(LCMS/MS)，進行了質譜分析。對于LTQObitrap，收集四種最強離子的先驅離子光譜(m/z350-1，500)和產物離子光譜(m/z70-1,500)1秒。以數據依賴性模式運行LTQ-FT-ICR儀器，以在ICR池中獲取高分辨率的先驅離子光譜(m/z300-1,500,RV425，000，并且離子累積至10，000，000的目標值)。通過選定的離子監控(SIM)掃描按序分離三種最強的離子，用于精確的質量測量(IODa質量窗口，R7450，000，和50，000的目標累積值)。同時使用27%的標準化碰撞能量設定和2，000的目標值，將離子在線性離子捕獲中分裂。對于使用Mascot程序(MatrixScience)和LTQ-FT-ICR數據的國際蛋白指標數據庫中的蛋白鑒定，需要嚴格的標準每個蛋白至少兩個匹配的肽，3p.p.m.內的質量精確性(平均絕對肽質量精確性為0.7p.p.m.)，對于單獨的肽高于20的Mascot評分和高于5的δ評分。使用顛倒數據庫沈的實驗表明在這些條件下，鑒定了具有兩個匹配肽的蛋白，具有低于0.的假陽性率。每種含精氨酸肽的蛋白比率計算為每次單掃描質譜的Arg6/ArgO和ArglO/ArgO的峰面積比。對每個蛋白測序的所有含精氨酸肽，進行了肽比率的平均數，并且相對于零標準化(x-1)。對于小于1的比率，計算了標準化的反比[1-(1/X)]。使用MS-Quant(http://msquant.sourceforge.net/)(一種內部研發的軟件程序)來評價肽鑒定和肽豐度比率中的確定性。活細胞成像將GFP-ARF細胞在Willco薄玻璃底微孔培養皿(Intracel)中培養，封固于DeltavisionSpectris顯微鏡(AppliedPrecision)上，顯微鏡安裝在透明的環境室(SolentScientific)中。在60X(NA1.4)PlanApochromat物鏡下將細胞成像。對于每個視野，記錄了隔開0.5mm的十二個光學切面，并且每個暴露持續0.05秒。記錄第一個時間點后，加入終濃度為5μgml-1的強力霉素，并將細胞成像2-3小時(SoftWoRx成像處理軟件，AppliedPrecision)。手工描繪出核仁或核(參見圖6)，并且從兩個獨立的實驗中測量了五個核仁/核。siRNA通過MWG合成siRNA雙鏈體寡核苷酸，并且按照制造商的說明使用Interferin(Polyplus)進行了轉染。簡而言之，在轉染前那天，將細胞以2XIO5細胞/孔的濃度涂布于6孔平板中。第二天，用終體積為2.2ml的新鮮培養基中的終濃度為5nM的siRNA寡核苷酸轉染細胞。在收集之前，將細胞再培養48小時。除非另外指出，加入IPTG持續24小時。在此描述了siRNA序列(對照CAGUCGCGUUUGCGACUGG,FMN2-GUAUACCAGGUCUCCUCAA)。MG132購自MerckChemicals,并且以50μM的終濃度來使用。細胞NARF2和NARF2-E6細胞系由GordonPeters博士提供(CancerResearchUKLondonResearchhstitute(癌癥研究UK倫敦研究所))并且之前已經描述過(Stott等，1998；Brookes等，2002；Rocha等，2003)。NARF2細胞，是含有異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)-可誘導pl4AKF基因的人骨肉瘤U20S細胞的衍生物，之前已經描述過(Stott等，1998)。NARF2-E6細胞是NARF2細胞的衍生物，但另外含有組成型表達的人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6蛋白。RNA制備和標記根據制造商的說明，使用DNaseI處理，使用RNeasy迷你試劑盒(QUIAGEN)分離了總NARF2細胞RNA。用單色的基于微陣列的基因表達系統(One-ColorMicroarray-BasedExpressionsystem)(AgilentTechnologies)來標記總RNA0微陣列實驗和分析在德國漢堡的EMBL基因組核心實驗室(EMBL’sGenomicsCoreFacility)進行了所有微陣列實驗。通過NanoDropND-1000UV-VIS分光光度計分析了標記的cDNA質量。將標記的cDNA在全人基因組寡DNA微陣列(WholeHumanGenomeOligoDNAmicroarray)(人WG4X44k=AgilentTechnologies)上進行雜交。根據制造商的說明(AgilentTechnology)，通過GeneSpringGX軟件分析了掃描的數據。結果我們使用基于質譜的細胞器蛋白組學和穩定的同位素標記(S卩，SILAC(圖5a)(參考文獻4-6))分析了ARF腫瘤抑制劑途徑的核仁蛋白動力學。我們進行了來自人ARF可誘導模型細胞系(稱為NARF2)的核仁蛋白組的定量分析，并且與另一種ARF可誘導的并且是P53陰性的細胞系(稱為E6(參考文獻1-)進行了比較。NARF2是從U20S人骨肉瘤細胞建立的穩定細胞系。通過ARF基因啟動子區域的高甲基化，阻止了U20S細胞中的內源性ARF表達。然而，這些細胞還含有野生型ARF基因的外源性的可誘導拷貝，可以通過加入IPTG誘導其在NARF2細胞中的表達。E6細胞系是從NARF2建立的并且表達滅活p53的人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6蛋白。我們檢測了來自ARF蛋白的肽(圖5b)并且比較了NARF2和E6細胞系中的動態時間過程變化(圖5c)。結果顯示出在IPTG誘導過程中，兩個細胞系中的ARF蛋白水平都顯著升高，與我們預期的一樣。接著，我們使用來自熒光顯微鏡活細胞圖像的信號強度比較了質譜數據(圖6)。數據集表明了ARF的倍數變化數據與來自我們的顯微鏡的信號強度相匹配(圖6a)。我們選擇了一些其他蛋白來與我們的質譜數據進行比較，并且它們的行為與我們檢測到的倍數變化數據相匹配(圖6b)。該數據記錄了ARF誘導過程中數千種核仁蛋白水平的時間過程變化(圖7a&b)。例如，成蛋白-2(FMN》(參考文獻7&8)(其在胞質分裂中具有作用并且來自我們在癌癥中的數據)在P53陽性和陰性細胞系的ARF誘導過程中都有顯著提高(圖7b&c)。該結果表明成蛋白-2可以是ARF蛋白的新配偶體或可以介導ARF-依賴性下游機制。我們進行了免疫細胞化學來證實這些細胞系中用或不用IPTG誘導的FMN2表達(圖8)。盡管在NARF2和E6細胞系中，在不用IPTG的情況下，FMN2以低水平表達，在IPTG處理后M小時，表達水平提高。我們在U20S細胞中沒有檢測到這種變化，表明FMN2誘導不是IPTG處理本身的結果。我們還檢查了Hela細胞中的FMN2表達水平，因為該細胞系具有內源性ARF表達。我們檢測到FMN2表達比U20S細胞中的多，所述U20S細胞不表達內源性ARF。這些數據表明ARF和FMN2表達之間的正相關性。我們還進行了微陣列分析，以測定這些基因的RNA水平(圖9)。在外源性ARF誘導后，FMN2RNA水平顯示出10倍或更多的高比例增加。該結果強調了FMN2mRNA表達受到ARF的控制，并且因此ARF直接或間接地影響FMN2啟動子的表達。為了分析FMN2蛋白在細胞中的功能，我們設計了五種siRNA來抑制FMN2表達。其中之一成功地抑制了FMN2表達(圖10)。我們沒有觀察到對p53或Hdm2的任何作用，Hdm2是E3泛蛋白連接酶，但細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21得到嚴重降低(圖10a)。其他實驗表明了FMN2敲低沒有影響puma水平，但降低了p21。相反，DNA-PK的siRNA敲低引起了puma和p21二者水平的降低(圖IOb)。因此，FMN2顯示出特異性，并且在癌基因激活過程中穩定了P21蛋白水平和/或促進了p21表達。這些發現是可重復的并且顯示出FMN2表達穩定了P21或增強了其表達，或兩者(圖IOc)。其他材料和方法siRNA實驗通過MWG合成了siRNA雙鏈體寡核糖核苷酸并且按照制造商的說明使用Interfection(Polyplus)進行了轉染。簡而言之，在轉染前那天，將細胞以2XIO5細胞/孔的濃度涂布于6孔平板中。第二天，用終體積為2.2ml的新鮮培養基中的終濃度為5nM的SiRNA寡核糖核苷酸轉染細胞。在收集之前，將細胞再培養48小時。除非另外指出，加入IPTG持續24小時。在此描述了siRNA序列(對照5，-CAGUCGC⑶UUGCGACUGG-3，，FMN2-5'-GUAUACCAGGUCUCCUCAA-3',PA28γ-5'-GAAUCAAUAUGUCACUCUA-3‘,Skp-25，-ACUCAAGUCCAGCCAUAAG-3，)。抗體生產通過DundeeCellProducts(Dundee細胞產物)(Dundee，UK)生產了FMN2小鼠單克隆和兔多克隆抗體。合成了用于小鼠腹水雜交瘤克隆的TC上清液的寡肽(CTEHVRAPPAPSRSR,MHSIRTVEIKVPEIEEC,KDSQALQTGELDSAHS)，以建立FMN2_m22Ab(圖15A)，并且合成了寡肽(CRQKKGKSLYKIKPR,CKPRHDSGIKAKISMKT)，以建立FMN2_p21Ab。免疫沉淀按照之前所述的(Trinkle-Mulcahy等，2006)，進行免疫沉淀。從NARF2穩定細胞系制備核裂解物。將純化的核重懸浮于RIPA緩沖液中，以溶解蛋白質。使用抗-FMN2-m22Ab單克隆抗體和抗-FMN2-p31Ab，將FMN2蛋白免疫沉淀(圖15)。將樣品分成兩份，并且從每份核裂解物的一半中分離出輸入anput)樣品。顯微鏡檢查使用DeltaVisionSpectris熒光顯微鏡(Applied!decision)記錄了所有細胞圖像。使用60X(NA1.4)PlanApochromat物鏡，將細胞成像。對于每個視野和每次曝光，記錄了0.5μm隔開的十二個光學切面(SoftWoRx成像處理軟件，AppliedPrecision)。結果圖14顯示用關于PA^γ和Skp2拯救FMN2耗盡。使用關于FMN2(對于siRNA靶標序列的位置，參見圖15)、PA28y、Skp2和對照(Control)的siRNA,用/不用pl4ARF誘導(+/空白)，在NARF2細胞的轉染后，檢測內源性FMN2、Skp2、PA^G、p21、pl4ARF和肌動蛋白的蛋白水平。對每個泳道，上樣等量的NARF2提取物，并且通過SDAPAGE分離蛋白，進行電印跡，并用單克隆抗-PA^γ和多克隆抗-FMN2、抗-Skp2、抗-p21、抗-pl4ARF進行探測，使用抗-肌動蛋白作為上樣對照。FMN2耗盡后觀察到的p21失活通過PA^ysiRNA/Skp2siRNA的共轉染得到了部分拯救。這些數據表明FMN2耗盡使p21失活是通過泛蛋白依賴性降解途徑(Skp2)和泛蛋白不依賴性途徑(ΡΑ^γ)引起的(模型顯示于圖20中)。FMN2特異性抗體的建立。a.通過注射合成的FMN2寡肽來建立小鼠單克隆抗-FMN2抗體(m22Ab)和兔多克隆抗-FMN2抗體(p31Ab)(參見圖15A)。為了證實抗體特異性，將FMN2部分cDNA序列與mCherry紅色熒光蛋白cDNA融合(mCherry-FMN2Ex6-12和mCherry-FMN2Exl3-18)。圖15A還顯示了FMN2蛋白結構，并且指出了用于FMN2敲低的siRNA的位置，用作產生抗-FMN2抗體的抗原的肽序列和基序。2結構域幾乎完全是α螺旋并且可以細分成具有任意分界線的五個亞結構域，。這些包括N-端“套索(lasso)”、“接頭(Linker)”區段、球狀“凸起”亞結構域、卷曲螺旋區、羧基端“標桿(post)2”亞結構域。通過“套索”與配偶體2的“標桿”的獨特相互作用介導了二聚體形成，呈現出閉環結構。已經提出了DEP結構域可以在將含DEP結構域的蛋白靶向特定亞細胞膜位點、甚至可能靶向特定的G蛋白偶聯的信號傳導途徑起選擇作用。圖15B顯示了FMN2m22Ab_p31Ab的共同定位分析。在pl4ARF誘導后，將NARF2細胞固定，并用小鼠單克隆抗-FMN2抗體(m22Ab)和兔多克隆FMN2抗體(p31Ab)進行染色。圖15C顯示mCherry-FMN2部分質粒的表達結果。用pmCherry-FMN2Ex6_12和pmCHerry-FMN2Exl3-18轉染后，將Hela細胞固定并使用多克隆抗-FMN2抗體(p31Ab)進行染色。標線為ΙΟμπι。箭頭表示受轉染的細胞。如可以看到的，包括由FMN2-p31Ab識別的抗原序列的pmCHerry-FMN2Exl3-18的瞬時表達受到FMN2_p31Ab的強烈染色。pmCHerry-FMN2Ex6-12瞬時表達后，該相同的FMN2_p31Ab抗體沒有使細胞染色，pmCHerry-FMN2Ex6-12沒有包括用作產生抗-FMN2抗體的抗原的肽序列(箭頭)。圖16顯示使用FMN2特異性抗體的免疫沉淀(IP)分析的結果。按照之前所示(Trinkle-Mulcahy等，2006)，進行免疫沉淀。在pl4ARF誘導后分離了NARF2細胞核裂解物，并將等量裂解物與FMN2多克隆抗體(FMN2p31Ab)或單克隆抗體(FMNan22Ab)混合。還通過檢查作為核標記物的B23蛋白和作為細胞質標記的微管蛋白來證實了級分。對于每個泳道，上樣等量的IP提取物，并通過SDSPAGE分離蛋白，進行電印跡并用抗-FMN2抗體進行探測，例如，使用單克隆抗-FMN2的IP和使用多克隆抗-FMN2的印跡(泳道M)(參見圖15A)。如可以看到的，IP后與輸入泳道(未用抗體的裂解物)相比，顯示了FMN2的明顯分離。在FMN2IP中也檢測到了p21。分離NARF2細胞核裂解物，使用/不用pl4ARF誘導，并且將等量的裂解物與FMN2多克隆抗體(FMN2p31Ab)混合。對于每個泳道，上樣等量的總核裂解物(輸入)、沉淀的樣品(IP)和流出的樣品(FT)，并且通過SDSPAGE分離蛋白，進行電印跡并用包括抗-FMN2m22Ab、抗-PA^γ、抗_Skp2以及作為輸入和FT上樣對照的抗-B23的抗體進行探測(參見圖16C).將NARF2細胞固定，并用兔抗-FMN2p31Ab和抗-p21抗體染色，用/不用pl4ARF誘導。圖17顯示了大部分FMN2和p21信號共同位于核中。該結果與圖15中所示的IP結果相一致。構建了第一個ATG(+1)上游的兩個FMN2啟動子缺失質粒(圖18A左圖)。用質粒mCherry-FMN2p-2k、mCherry-FMN2p-lk或不含啟動子的mCherry轉染后，將NARF2細胞固定，并用抗_pl4pARF抗體染色，用/不用P14ARF誘導。如可以看到的，具有FMN2基因上游序列的約2000個堿基的mCherry-FMN2pjk在pl4ARF誘導的細胞中得到上調。然而，只具有FMN2基因上游序列的1000個堿基的mCherry-FMN2p-lk沒有顯示出應答pl4ARF誘導的上調(箭頭)(參見圖18A右圖)。使用NARF2-E6細胞(p53陰性細胞)進行了相同的實驗(參見圖18B)。這顯示了與NARF2細胞觀察到的相同結果。這些結果表明FMN2基因上游的FMN2啟動子/調控區(約2000個堿基)包括一個或多個賦予p53不依賴性的ARF誘導的元件。最后，圖18C顯示了FMN2啟動子分析的概述。還表征了FMN2啟動子區域，并且確定了ARF可誘導元件(染色體1，+鏈大約從238319604至238321603，基因組瀏覽器)。將人肺原代成纖維細胞(ATCC-CCL-211)和人肺腺癌細胞(ATCC-CRL-5868)固定，并用抗-FMN2-p31Ab、抗-FMN2-m22Ab、抗-p21和抗-pl4ARF抗體進行染色。圖19顯示了與人肺原代細胞相比，人肺癌細胞中的FMN2基因得到上調，正如我們在如U20S、Hela,NARF2和NARF2-E6細胞系的組織培養物中所觀察到的，即，癌基因激活后增強的FMN2表達(還請參閱圖8)。這些數據顯示出升高的FMN2表達可以出現在多種形式的癌癥中以及模式組織培養系統中。圖20。pl4ARF-FMN2途徑的模型。我們發現了新的p53不依賴性的腫瘤抑制劑途徑。通過癌基因激活誘導的P14ARF上調了不依賴于p53的FMN2基因。FMN2直接或間接地抑制了p21降解，包括泛蛋白依賴性和不依賴性途徑。參考文獻1.RochaS.禾口PerkinsN.D.,ARFtheintegratorJinkingNF—kappaB，p53andcheckpointkinases(ARF,整合劑連接NF-κB、p53和檢查點激酶).CellCycle(細胞周期),6,756-9(2005).2.RochaS.,GarrettΜ.D.,CampbellK.J.,SchummK.,PerkinsN.D.,RegulationofNF-kappaBandp53throughactivationofATRandChklbytheARFtumoursuppressor(通過ARF腫瘤抑制劑激活ATR和Chkl來調節NF-κB和p53).EMBOJ.(歐洲分子生物學學會雜志),24(6)，1157-69(2005).3.RochaS.,CampbellK.J.,PerkinsN.D.,p53-andMdm2_independentrepressionofNF-kappaBtransactivationbytheARFtumorsuppressor(通過ARF腫瘤抑制劑對NF-κB轉移活化的ρ53_和Mdm2_不依賴性抑制)，MolCell(分子細胞)，1，15-25(2003).4.Andersen,J.S.等，Directedproteomicanalysisofthehumannucleolus(人核仁的定向蛋白質組學分析)，Curr.Biol(當代生物學)，12，1-11(2002).5.Andersen,J.S.等，Nucleolarproteomedynamics(核仁蛋白組學動力學)，Nature(自然)，433，77-83(2005).6.Lam,Y.W.,Lamond,A.I.,Mann,M.J.,Andersen,S.AnalysisofnucIeolarproteindynamicsrevealsthenucleardegradationofribosomalproteins(核仁蛋白質動力學分析揭示了核糖體蛋白的核降解)，Curr.Biol.(當代生物學)，17,749760(2007).7.KatohM.,KatohΜ.,CharacterizationofFMN2geneathumanchromosomelq43(人染色體lq43的FMN2基因的表征)，Int.J.Mol.Med.(分子藥物國際雜志)，3，469-74(2004).8.LeaderB.等，Formin_2,polyploidy,hypofertilityandpositioningofthemeioticspindleinmouseoocytes(成蛋白-2，小鼠卵母細胞中減數分裂紡錘體的多倍性、繁殖力減低和定位)，Nat.Cell.Biol(自然細胞生物學)，12，921-8(2002)·9.Trinkle-Mulcahy,L.,Andersen,J.,Lam,Y.W.,Moorhead,G.,Mann,Μ.,andLamond,Α.I.(2006).Repo-ManrecruitsPPlgammatochromatinandisessentialforcellviability(R印o_Man召集PPlγ至染色質，并且是細胞生活力必需的)，JCellBiol(細胞生物學雜志)，172，679-692.10.SambrookJ.等，MolecularCloning(分子克隆)(第三版)，CHSpress,(2001).11.GerdGellissen(編輯)，ProductionofRecombinantproteins(重組蛋白的生產)，JohnWiley&Sons(2005).12.GregoryJ.Hannon(編輯)，RNAi:aguidetogenesilencing(RNAi:基因沉默指南)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港實驗室出版社)(2003).2權利要求1.一種診斷細胞增殖和/或分化失調或發展所述失調的易感性的方法，所述方法包括檢測成蛋白2(FMN2)基因和/或蛋白表達的調節的步驟，其中FMN2基因和/或蛋白表達的調節指示細胞增殖和/或分化失調。2.根據權利要求1的方法，其中所述調節是FMN2基因和/或蛋白表達水平的提高。3.根據權利要求1或2的方法，其中所述細胞增殖和/或分化失調是癌癥，如癌、肉瘤或淋巴瘤，白血病或自體免疫和/或炎性病癥，如銀屑病、過敏癥等，減數分裂失調，例如，涉及生殖細胞增殖的導致不育的失調，或如肝炎、肝硬化、腎衰竭、急性肺炎、胃潰瘍、心肌梗死、肌肉營養不良癥和腦梗死這樣的疾病和/或病癥。4.根據權利要求1的方法，其中所述調節是FMN2基因和/或蛋白表達的降低，其可以指示細胞增殖和/或分化失調的存在或發展細胞增殖和/或分化失調的易感性。5.根據權利要求4的方法，其中所述細胞增殖和/或分化失調的特征在于異常的凋亡事件并且可以是神經變性疾病，如急性細胞變性疾病，和/或如缺血性事件這樣的病癥(例如，中風、心肌梗死等)。6.一種分離的cDNA序列，其包含圖2或3中所示的一種或多種序列或其同種型、可變剪接形式或翻譯后修飾形式或截短形式。7.—種DNA微陣列，其包含根據權利要求6的cDNA，所述DNA微陣列用于根據權利要求1-5任一項的方法中。8.—種重組FMN2蛋白或其片段，其是由根據權利要求6的分離cDNA表達的。9.一種多克隆或單克隆抗體或抗體片段，其能夠與根據權利要求8的重組蛋白或片段特異性反應。10.根據權利要求9的抗體或抗體片段，其與用于根據權利要求1-5任一項的方法中的基底結合。11.根據權利要求9的抗體或抗體片段，其與可檢測的結構部分綴合，所述結構部分如比色的、熒光、化學發光或放射性標記。12.—種試劑盒，其包含一種或多種能夠與FMN2基因或包含一個或多個突變的FMN2基因特異性雜交的寡核苷酸/引物。13.—種能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達/功能的化合物，其用于治療細胞增殖和/或分化失調。14.能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達/功能的化合物用于制備治療細胞增殖和/或分化失調的藥物的用途。15.一種治療細胞增殖和/或分化失調的方法，所述方法包括將能夠調節FMN2基因和/或蛋白表達/功能的化合物施用于需要其的受試者的步驟。16.一種鑒定或獲得調節FMN2基因和/或蛋白表達的試劑的方法，所述方法包括將FMN2基因或蛋白與測試試劑接觸并檢測FMN2基因和/或蛋白表達/功能的任何調節的步馬聚ο17.一種藥物組合物，其包含能夠調節FMN2基因/蛋白的表達或功能的化合物，并結合藥物學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。18.—種載體，其包含ARF應答性增強子和啟動子，所述ARF應答性增強子和啟動子用于表達設計用來治療細胞增殖和/或分化失調的基因。19.根據權利要求18的載體，其中所述ARF應答性增強子和啟動子包含FMN2起始密碼子上游約21Λ的序列。20.根據權利要求18或19的載體，其中所述基因是細胞毒性基因并且待治療的疾病是癌癥。21.一種治療細胞增殖和/或分化失調的方法，其包括將根據權利要求18-20任一項的載體施用于受試者。全文摘要本發明提供了診斷細胞增殖和/或分化失調的方法，用于治療該失調的組合物和方法以及鑒定可能有效用于治療細胞增殖和/或分化失調的藥劑的方法。文檔編號A61K48/00GK102575283SQ201080020496公開日2012年7月11日申請日期2010年3月15日優先權日2009年3月13日發明者安格斯·萊恩·萊蒙德,小野基晴,山田佳代,索尼婭·羅沙申請人:敦提大學校董事會