專利名稱：肺炎球菌RrgB分化枝的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及針對肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌 (pneumococcus))的免疫領域。
背景技術：
肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)具有稱為菌毛_1的菌毛，其由141Λ島(Pl-I)編碼， 具有以下7個編碼基因RlrA轉錄調控因子、含LPXTG型細胞壁分選信號的3種菌毛亞基、 參與菌毛聚合物合成和摻入輔助菌毛成分的3種分選酶。RrgB是形成所述結構骨架的主要亞基，而另2個菌毛蛋白(RrgA、RrgC)是輔助結構蛋白[1_4]。RrgA是主要的菌毛-1粘附素；缺乏RrgA的細菌對上皮細胞的粘附低于野生型生物。發明_既述本發明涉及免疫原性組合物，其包括以下物質中至少兩種(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)與SEQ ID NO :1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQID NO :1的至少7個連續氨基酸的片段組成；(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)與SEQ ID NO :2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQID NO :2的至少7個連續氨基酸的片段組成；和/或(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)與SEQ ID NO :3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQID NO :3的至少7個連續氨基酸的片段組成。本發明還涉及包括以下至少兩種的多肽(a)第一氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)與SEQ ID NO 1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 1的至少7個連續氨基酸的片段組成；(b)第二氨基酸序列，其包括的氨基酸序列⑴與SEQ ID NO 2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 2的至少7個連續氨基酸的片段組成；和/或(c)第三氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)與SEQ ID NO 3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 3的至少7個連續氨基酸的片段組成。本發明還涉及含有以下氨基酸序列的多肽A-{-X-L-}n-B其中各X是如權利要求1定義的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列；L 是可選的接頭氨基酸序列；A是可選的N末端氨基酸序列；B是可選的C末端氨基酸序列；η 是2或更大的整數。可選地，所述多肽含有如權利要求1定義的第一、第二和第三多肽中的至少2種。在具體實施方式
中，本發明的多肽含有選自SEQ ID NO :11、13、15、17、19和21的
氨基酸序列。本發明也涉及表達以下至少兩種的細菌
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(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)與SEQ ID NO :1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQID NO :1的至少7個連續氨基酸的片段組成；(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)與SEQ ID NO :2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQID NO :2的至少7個連續氨基酸的片段組成；和/或(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)與SEQ ID NO :3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQID NO :3的至少7個連續氨基酸的片段組成。附圖簡要說明
圖1顯示用5個RrgB嵌合體和對照的細菌研究結果。圖為CFU/ml。各標記顯示單個小鼠的數據。圖2顯示用5個RrgB嵌合體和對照的死亡率研究結果。圖為存活天數。各標記顯示單個小鼠的數據。圖3顯示有4條泳道的凝膠。所述泳道從左至右含有分子量標記物；I-II-III 嵌合體；I-II-III嵌合體；BSA標準。箭頭指示214kDa的分子量。圖4顯示被動保護數據，使用針對TIGR4RrgB的4種mAb，或鹽水對照。Y軸顯示 24小時菌血癥的CFU/ml。圖4B顯示用4種針對TIGR4RrgB的mAb的死亡率研究結果。圖5和6顯示使用針對TIGR4序列(圖5)或6B序列(圖6)的mAb的蛋白質印跡。泳道從左至右為標記物；RrgB I-II-III ；RrgB II-I-III ；RrgBII-III-I ；RrgB III-I-II ；RrgB III-II-I ；RrgB TIGR4 ；RrgB 6B ；RrgB 23F ；BSA 對照。圖7顯示用鋁佐劑I-II-III嵌合體、III-II-I嵌合體、TIGR4或單用鋁免疫后的 (A)菌血癥和(B)死亡率數據。圖7A中數據為CFU/ml而圖7B中數據為存活天數。圖8顯示針對TIGR4菌株的OPKA結果，顯示隨血清稀釋變化的OPKA殺傷％。菱形表示陽性對照血清；實心方格是預免疫血清，近χ軸可見 ’另5條線是針對5種嵌合體的血清。圖9顯示基于SEQ ID NO :1_3和85-96相同性％的樹形。標記是SEQID0圖10顯示針對肺炎鏈球菌血清型6B的OPKA結果，顯示隨血清稀釋變化的殺傷％。圖11顯示針對肺炎鏈球菌血清型6B的OPKA結果，顯示隨稀釋至多1/131220的血清稀釋變化的殺傷％。圖12顯示用III-II-I嵌合體以不同劑量免疫后的㈧菌血癥和⑶死亡率數據。 圖12A中數據為CFU/ml而圖12B中數據為存活天數。圖13顯示用20 μ g RrgB III-II-I嵌合體免疫后的㈧菌血癥和⑶死亡率數據。圖13A中數據為CFU/ml而圖13B中數據為存活天數。圖14表明用MF59佐劑的III-II-I RrgB嵌合體具有保護性。菱形表示有佐劑的 RrgB嵌合體，圓圈表示單獨的MF59佐劑。圖15顯示用RrgB III-II-I嵌合體皮下免疫后的(A)菌血癥和(B)死亡率數據。 圖15A中數據為CFU/ml而圖15B中數據為存活天數。
圖16顯示M小時菌血癥試驗中，與正常兔血清(NRS)對照相比，RrgB III-II-I 嵌合體在被動保護研究中引起功能性抗體生成。圖17顯示針對(A)TIGR4和(B) ST35B的OPKA結果，顯示隨血清稀釋變化的殺傷％。菱形表示抗抖，圓圈表示RrgB III-II-I嵌合體，正方形表示NSK。圖18顯示針對TIGR4菌株的OPKA結果，表明OPA活性由抗RrgBIII-II-I嵌合體的抗體特異性引起。圖19顯示單一 RrgB結構域賦予的體內保護。三角形表示RrgB嵌合體，菱形表示 Dl結構域，正方形表示D4結構域，圓圈表示鋁。圖20是不同RrgB結構域(單一結構域Dl、D2、D3和D4，多個結構域片段D1-3、 D2-4、D3-4)的蛋白質印跡分析，測試其與4種針對TIGR4RrgB的保護性mAb的結合。圖21顯示用結合于經胰蛋白酶消化RrgB的單克隆抗體23F8/C10進行的蛋白質印跡分析。圖22 (A)是RrgB結構域Dl氨基酸序列在化膿性鏈球菌(S. pyogenese)菌毛骨架 Spy0128結構域1晶體結構上的模型。(B)是肺炎鏈球菌RrgB晶體結構(D2-D3)和模型Dl 結構域。(C)是肺炎鏈球菌菌毛的3D重建電子密度圖。圖23顯示用RrgB 111_11_1嵌合體結合其他多肽抗原不同組合(20 μ g抗原)進行腹膜內免疫后針對6B-芬蘭菌株(靜脈攻擊)的(A)48小時菌血癥和(B)死亡率數據。 圖23A中數據為CFU/ml而圖23B中數據為存活天數。(A)和(B)中第1列顯示spr0057、 spr0096和spr2021的組合；第2列顯示SP2216-1、SP1732-3和PsaA的組合；第3列顯示 RrgB III-II-I 嵌合體；第 4 列顯示 RrgB III-II-I 嵌合體與 spr0057、spr0096 和 spr2021 的組合；第5列顯示RrgB III-II-I嵌合體與SP2216_1、SP1732_3和PsaA的組合；第6列顯示鋁對照。圖M顯示用RrgB 111_11_1嵌合體結合其他多肽抗原不同組合(20 μ g抗原)進行腹膜內免疫后針對35B-SME15菌株(靜脈攻擊)的(A) 48小時菌血癥和(B)死亡率數據。 圖24A中數據為CFU/ml而圖24B中數據為存活天數。(A)和(B)中第1列顯示spr0057、 spr0096和spr2021的組合；第2列顯示SP2216_1、SP 1732-3和PsaA的組合；第3列顯示 RrgB III-II-I 嵌合體；第 4 列顯示 RrgB III-II-I 嵌合體與 spr0057、spr0096 和 spr2021 的組合；第5列顯示RrgB III-II-I嵌合體與SP2216_1、SP1732_3和PsaA的組合；第6列顯示鋁對照。圖25顯示用含多組氨酸標簽的III-II-I嵌合體相較無標簽III-II-I嵌合體和鋁對照的(A) M小時菌血癥試驗和(B)死亡率數據(腹膜內免疫，用TIGR42. 1E+02CFU/小鼠進行腹膜內攻擊)。(A)中數據為CFU/ml而(B)中數據為存活天數。圖沈顯示在BALB/c小鼠中用含多組氨酸標簽的III-II-I嵌合體的M小時菌血癥試驗，與以下作比較(i)無標簽III-II-I嵌合體，(ii)spr0057、spr0096和spr2021的組合，(iii)spr0057、spr0096和spr2021的組合，進一步聯合無標簽III-II-I嵌合體和 (iv)鋁對照(腹膜內免疫，用TIGR41. 6E+02CFU/小鼠進行腹膜內攻擊)。圖27顯示用含多組氨酸標簽的III-II-I嵌合體相較無標簽111_11_1嵌合體和鋁對照的(A)48小時菌血癥試驗和(B)死亡率數據(腹膜內免疫，用35B-SME154.6E+07CFU/ 小鼠進行靜脈攻擊)。(A)中數據為CFU/ml而⑶中數據為存活天數。
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圖28顯示用含多組氨酸標簽的III-II-I嵌合體相較無標簽III-II-I嵌合體和鋁對照的(A) 48小時菌血癥試驗和(B)死亡率數據(腹膜內免疫，用6B芬蘭129. 4E+07CFU/ 小鼠進行靜脈攻擊)。(A)中數據為CFU/ml而⑶中數據為存活天數。圖四顯示用含多組氨酸標簽的III-II-I嵌合體相較無標簽III-II-I嵌合體和鋁對照的(A)48小時菌血癥試驗和(B)死亡率數據(腹膜內免疫，用TIGR46. 3E+05CFU/小鼠進行靜脈攻擊)。(A)中數據為CFU/ml而(B)中數據為存活天數。圖30顯示用20 μ g III-II-I嵌合體相較鋁對照免疫后的(A) 48小時菌血癥試驗和⑶死亡率數據(腹膜內免疫，用TIGR4靜脈攻擊)。㈧中數據為CFU/ml而⑶中數據為存活天數。圖31顯示用20 μ g III-II-I嵌合體相較鋁對照免疫后的(A) M小時菌血癥試驗和⑶死亡率數據(腹膜內免疫，用TIGR4腹膜內攻擊)。㈧中數據為CFU/ml而⑶中數據為存活天數。圖32顯示用20 μ g III-II-I嵌合體相較鋁對照免疫后的(A) 24小時菌血癥試驗和⑶死亡率數據(腹膜內免疫，用35B-SME15靜脈攻擊)。㈧中數據為CFU/ml而(B) 中數據為存活天數。圖33顯示用20 μ g III-II-I嵌合體相較鋁對照免疫后的(A) 24小時菌血癥試驗和⑶死亡率數據(腹膜內免疫，用6B芬蘭12靜脈攻擊)。㈧中數據為CFU/ml而(B) 中數據為存活天數。圖34顯示用III-II-I嵌合體相較鋁對照免疫后的(A)48小時菌血癥試驗和(B) 死亡率數據(腹膜內免疫，用TIGR4靜脈攻擊)，用過量表達菌毛的TIGR4菌株(T4+)攻擊與菌毛表達量很低的TIGR4菌株(T4-)作比較。(A)中數據為CFU/ml而(B)中數據為存活天數。圖35顯示用II-I-III和111_11_1嵌合體免疫后的48小時菌血癥試驗，其中 (A)用過量表達菌毛的6B芬蘭12菌株攻擊(腹膜內免疫，用過量表達菌毛的6B芬蘭 127. 0E+09CFU/小鼠進行靜脈攻擊)和(B)用菌毛表達量很低的6B芬蘭12菌株攻擊(腹膜內免疫，用菌毛表達不足的6B芬蘭127.3E+09CFU/小鼠進行靜脈攻擊)。(A)和(B)都顯示以下的數據spr0057、spr0096和spr2021的組合；6B芬蘭-CRM197偶聯物；和鋁。(A) 中數據為CFU/ml而(B)中數據為存活天數。圖36是MLST數據庫的計算機模擬分析，顯示急性中耳炎肺炎鏈球菌分離物集合， 相較易受抗生素影響的菌株，菌毛-1在耐受抗生素(紅霉素耐受、青霉素耐受和多藥耐受) 的菌株中更普遍。發明詳述RrgB菌毛亞基具有至少3個分化枝。所述3個分化枝的參比氨基酸是本文的SEQ ID N0:l、2和3。所述分化枝在其N和C末端較好保守，但在中間偏離。SEQ ID NO :1和2 有46%的相同性；SEQ ID NO :1和3有51%的相同性；SEQ ID NO :2和3有65%的相同性。已發現針對給定RrgB分化枝的血清對表達該分化枝的肺炎雙球菌 (pneumococci)有活性，但對表達另外2種分化枝之一的菌株無活性，即存在分化枝內交叉保護，但沒有分化枝間交叉保護。因此，根據本發明，免疫原性組合物包括至少2種不同 RrgB分化枝。這些可能以單獨多肽形式存在于免疫原性組合物中，或可融合為單一多肽鏈。將多個RrgB分化枝納為疫苗成分改善免疫原性組合物抵御含菌毛肺炎雙球菌的菌株覆蓋率。此外，觀察到在菌毛-1存在和抗生素耐受間存在顯著相關性；此發現提示用含多個RrgB分化枝的免疫原性組合物免疫會具有抵御耐受抗生素處理的肺炎雙球菌的額外優勢。因此，本發明提供免疫原性組合物，其包括以下至少2種(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列 ⑴與SEQ ID NO 1具有至少序列相同性和/或(ii)由來自SEQ IDNO 1的至少χ個連續氨基酸的片段組成；(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)與SEQ ID NO 2具有至少序列相同性和/或(ii)由來自SEQ IDNO 2的至少y個連續氨基酸的片段組成；和/或(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列 ⑴與SEQ ID NO 3具有至少序列相同性和/或(ii)由來自SEQ IDNO 3的至少ζ個連續氨基酸的片段組成。本發明還提供包括以下至少兩種的多肽(a)第一氨基酸序列，其包括的氨基酸序列⑴與SEQ ID NO :1具有至少序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO :1的至少χ個連續氨基酸的片段組成；(b)第二氨基酸序列，其包括的氨基酸序列⑴與SEQ ID NO :2具有至少序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO :2的至少y個連續氨基酸的片段組成；和/或(c)第三氨基酸序列，其包括的氨基酸序列⑴與SEQ ID NO :3具有至少序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 3的至少ζ個連續氨基酸的片段組成。本發明還提供含有以下氨基酸序列的多肽A-{-X-L-}n-B其中Χ是如上定義的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列；L是可選的接頭氨基酸序列；A是可選的N末端氨基酸序列；B是可選的C末端氨基酸序列；11是2或更大的整數(例如2、3、4、5、6等)。可選地，所述多肽含有如權利要求1定義的第一、第二和第三多肽中的至少2種。通常，η是2或3，X部分選自下列
~~ΠζΠζΠζ
—2 第一氨基酸序列第二氨基酸序列
—2 第二氨基酸序列第一氨基酸序列
第一氨基酸序列第二氨基酸序列第三氨基酸序列
第一氨基酸序列第三氨基酸序列第二氨基酸序列
第二氨基酸序列第三氨基酸序列第一氨基酸序列
第二氨基酸序列第一氨基酸序列第三氨基酸序列
權利要求
1.一種免疫原性組合物，所述組合物包括以下至少兩種(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列(i) 與SEQ ID NO 1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 1的至少7個連續氨基酸的片段組成；(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列(i) 與SEQ ID NO 2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 2的至少7個連續氨基酸的片段組成；和/或(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列(i) 與SEQ ID NO 3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 3的至少7個連續氨基酸的片段組成。
2.一種多肽，所述多肽包括以下至少兩種(a)第一氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)與SEQID NO :1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 1的至少7個連續氨基酸的片段組成；(b)第二氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)與SEQID NO :2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 2的至少7個連續氨基酸的片段組成；和/或(c)第三氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)與SEQID NO :3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 3的至少7個連續氨基酸的片段組成。
3.一種多肽，所述多肽含有氨基酸序列A-{-X-L-}n-B其中各X是如權利要求1定義的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列；L是可選的接頭氨基酸序列；A是可選的N末端氨基酸序列；B是可選的C末端氨基酸序列；11是 2或更大的整數。
4.如權利要求2或3所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有選自SEQID NO :11,13, 15、17、19和21的氨基酸序列。
5.一種細菌，所述細菌表達以下至少兩種(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列(i) 與SEQ ID NO 1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 1的至少7個連續氨基酸的片段組成；(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列(i) 與SEQ ID NO 2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 2的至少7個連續氨基酸的片段組成；和/或(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列(i) 與SEQ ID NO 3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由來自SEQ ID NO 3的至少7個連續氨基酸的片段組成。
6.一種含有氨基酸序列SEQ ID NO 83的多肽。
全文摘要
肺炎球菌菌毛亞基RrgB具有至少3種分化枝。針對給定分化枝的血清對表達該RrgB分化枝的肺炎雙球菌有活性，但對表達另外2種分化枝之一的菌株無活性，即存在分化枝內交叉保護，但沒有分化枝間交叉保護。因此，免疫原性組合物可包括至少2種不同RrgB分化枝以改善針對含菌毛肺炎雙球菌的菌株覆蓋率。所述多種分化枝可作為單獨多肽存在于免疫原性組合物中或可作為單一多肽鏈融合。
文檔編號A61K39/09GK102481354SQ201080031054
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月1日 優先權日2009年6月1日
發明者M·A·巴羅基, M·莫斯切奧尼, P·魯格洛, V·馬西格納尼 申請人:諾華有限公司