專利名稱：肺炎球菌檢測方法
技術領域：
本發明涉及用于對生物體中的肺炎球菌抗原進行檢測或定量的免疫學測定方法。
背景技術：
肺炎球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)是作為社區獲得性肺炎或下呼吸道感染 癥的病原菌檢出頻率最高的菌，不僅在日本而且在全世界范圍內都是患病率、死亡率高的 病原菌之一。肺炎球菌感染癥不僅頻率高，而且容易演變成重癥，因此治療開始時選擇適當 的抗菌藥是非常重要的。另外，從感染癥治療的原則來看，由于盡可能早期確定病原菌能夠 早期地選擇準確的治療方法，因此與預后的改善、醫療成本的削減、防止耐藥菌的出現緊密 相關，因而非常重要。從這些背景考慮，要求在感染早期的階段快速檢測肺炎球菌來源的抗 原的診斷試劑。關于肺炎球菌的結構，Sorensen等進行了詳細的報道(非專利文獻1)。莢膜 (capsular)位于菌的最外側，莢膜上配位有稱為莢膜多糖的多糖抗原。根據該莢膜多糖的 結構的不同，報道了數十種以上的血清型。另一方面，細胞壁(Cell wall)及細胞膜(Plasma membrane)依次位于莢膜的內側，細胞壁上配位有莢膜多糖(C_ps)，細胞膜上配位有稱為F 抗原的磷壁酸或脂磷壁酸。已知C-ps是在所有肺炎球菌中保守的共同抗原，另外，據報道 F抗原的多糖部分具有與C-ps相同的糖序列。作為利用免疫測定方法的肺炎球菌的抗原檢測方法，以往報道了通過使用抗C-ps 抗體的ELISA檢測痰液中的C-ps抗原的方法(非專利文獻2、非專利文獻3)、和通過以莢膜 多糖為對象的免疫電泳法檢測血清中、尿中的抗原的方法(非專利文獻4、非專利文獻5)。另外，作為現有的肺炎球菌檢測試劑盒，過去使用通過膠乳凝集法檢測腦脊液、血 清、尿中的肺炎球菌抗原的試劑盒。認為該方法檢測的是莢膜多糖等多糖部分(非專利文 獻6、非專利文獻7)。但是，使用膠乳凝集法的試劑盒由于操作的復雜性和靈敏度的問題， 目前幾乎不再使用。目前，使用更簡便的檢測方法。Binax公司的尿中抗原快速檢測試劑盒(Binax NOff (注冊商標)肺炎球菌尿中抗原檢測)，通過免疫層析法檢測尿中的C-ps (專利文獻1)。 該方法檢測的是尿中的抗原因此為非侵襲性，測定時間為15分鐘左右也很快速(非專利文 獻8)。但是，在測定尿中抗原的情況下，由于肺炎球菌在治療后也長時間在尿中持續排出， 因而存在產生假陽性的問題(非專利文獻9)。另外，在嬰幼兒的情況下，還存在采尿困難以 及由于常住性的肺炎球菌的影響而產生假陽性的問題(非專利文獻10)。另外，對于該試劑 盒，也有靈敏度稍低的批評(非專利文獻11)。更近時期開發的肺炎球菌抗原檢測試劑盒(非專利文獻12)是通過使用抗C-ps 多克隆抗體(兔)的免疫層析法快速檢測痰液或鼻腔、上咽部的拭子、或中耳潴留液、耳膿 溢中的肺炎球菌抗原(C-ps)的試劑盒。該試劑盒與上述的尿中抗原診斷試劑盒相比靈敏 度高，無需將拭子等臨床樣本進行濃縮操作即可利用，并且能夠從以往難以測定的中耳潴 留液中進行測定。另外，與尿樣本不同，容易從嬰幼兒采取樣本。但是，對于中耳或副鼻竇
3來源的樣本等一部分樣本，該試劑盒的靈敏度也不能說是充分的，期望開發更高靈敏度的 檢測方法。如前所述，作為肺炎球菌的抗原檢測試劑盒，報道了檢測莢膜抗原及C-ps的試劑 盒。其中，多樣性高的莢膜抗原需要準備與其多樣型相應的抗體，因此不適合作為簡易測定 的對象。對于C-ps，從前述的現有檢測試劑盒的結果來看，也需要進一步提高靈敏度。另一方面，F抗原迄今為止還未用于日常的臨床檢查。雖然有通過使用抗F抗原 抗體的免疫學檢測方法檢測含有肺炎球菌抗原的細菌的報道(非專利文獻13 15)，但是 這些方法存在在菌種間產生交叉反應或者有假陰性的危險等精度方面的問題。專利文獻1 美國專利第6824997號非專利文獻1 =Sorensen, Danish Medical Bulletin 42 :47_53(1995)非專利文獻2 =Holmberg et al. , J. Clin. Microbiol. 22 :111_115 (1985)非專利文獻3 =Sjogren et al.，Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 6 :239_248 (1987)非專利文獻4 =Coonrod et al.，J. Lab. Clin. Med. 81 778~786 (1973)非專利文獻5 =Feigin et al.，The Journal of Pediatrics 89 :773_775 (1976)非專利文獻6 =Ajello et al.，J. Clin. Microbiol. 25 :1388_1391 (1987)非專利文獻7 =Ballard et al.，Pediatr. Infect. Dis. J. 6 :630_634(1987)非專利文獻8 小林隆夫等、感染癥學雜志第76卷第12號995_1002 (2002)非專利文獻9 館田一博、毛夕· fM 7第51卷第6號129_132(2005)非專利文獻10 成相昭吉等、感染癥學雜志第78卷第1號18-21 (2004)非專利文獻 11 =Tzeng et al.，J. Microbiol. Im munol. Infect. 39 :39_44(2006)非專利文獻12 東川幸嗣等、小兒科臨床58(1) 139-143 (2005)非專利文獻13 =Kolberg et al. , Microbial Pathogenesis 22 :321_329 (1997)非專利文獻14 =Stuertz et al.，J. Clin. Microbiol. 36 :2346_2348 (1998)非專利文獻 15 =Mattie et al.，J. Antimicrob. Chemother. 56 154—159 (2005)
發明內容
本發明的課題在于提供能夠簡便、快速且高靈敏度地從生物體來源的樣本中檢測 或定量肺炎球菌抗原的免疫學檢測方法及用于該方法的抗體。本發明人對能夠以更高的靈敏度對肺炎球菌抗原進行檢測或定量的方法進行了 研究。結果發現，通過在肺炎球菌的多糖抗原中，著眼于以往實際上未用于肺炎球菌抗原的 檢測的肺炎球菌F抗原，制作特異性識別該F抗原的抗體，并利用使用該抗體的免疫學測定 方法，從而能夠以比現有方法更高的靈敏度簡便且快速地測定生物體來源的樣本中的肺炎 球菌抗原，從而完成了本發明。即，本發明提供特異性識別肺炎球菌F抗原的抗體。另外，本發明提供一種肺炎球 菌抗原的檢測或定量方法，其特征在于，通過使用該抗體的免疫學測定方法，對生物體來源 的樣本中的肺炎球菌F抗原進行檢測或定量。本發明還提供含有該抗體的肺炎球菌抗原檢 測試劑盒。根據本發明，可以提供特異性識別肺炎球菌F抗原的新抗體。另外，可以提供利用 使用該抗體的免疫學測定方法、簡便且快速地對生物體來源的樣本中的肺炎球菌抗原進行
4檢測或定量的方法。根據本發明的方法，可以比以往靈敏度更高地對肺炎球菌抗原進行檢 測或定量，因此，不僅對于尿液、痰液、鼻腔或上咽部拭子，即使對于靈敏度要求高于現有檢 測靈敏度的中耳、副鼻竇來源的樣本等，也可以無需進行樣本的濃縮操作而得到可靠的測 定結果。另外，由于肺炎球菌是腦膜炎、中耳炎、敗血癥等的病原菌，因此本發明的方法具有 能夠提高這些疾病的病原菌鑒定的精度并縮短所需時間的臨床有用性。
圖1為10000倍稀釋的五只兔來源的抗血清(1 11號)對F抗原固相板(F-Ag) 及BSA固相板(BSA)的反應性。圖2為ELISA測定系統的評價。A 使用抗F抗原多克隆抗體的夾心ELISA測定系 統。B:使用抗C-ps多克隆抗體的夾心ELISA測定系統。F-Ag:含有F抗原樣抗原的樣品、 C-ps 含有C-ps抗原的樣品。圖3為利用肺炎球菌培養株(ATCC49619)提取液的測定進行的ELISA測定系統的 靈敏度評價。C-ps ELISA:使用抗C-ps多克隆抗體的夾心ELISA測定系統、F-Ag ELISA 使用抗F抗原多克隆抗體的夾心ELISA測定系統。圖4為本發明的抗體的特異性評價。實施例1中得到的抗血清來源的抗F抗原多 克隆抗體(1 11號)、及公知的抗F抗原抗體(HAS)的反應特異性。圖5為使用本發明的抗體的ELISA測定系統的特異性評價。對表1所示菌體的反應性。圖6為免疫層析試條的例示的構成。A 使用前的試條。在硝基纖維素部分未確認 到線。B:使用后的試條。如果為陰性則可以確認到一條線(上部)、如果為陽性則可以確 認到兩條線(下部)。C:層壓加工而成的試條的構成。D:收納試條的塑料盒。圖7為F抗原檢測用免疫層析法的靈敏度評價及測定方式。A 使用樣本溶液的測 定方式。B 以各種濃度的純化F抗原樣抗原作為樣本的免疫層析法。C 以各種菌體濃度的 肺炎球菌培養株(ATCC49619)提取液作為樣本的免疫層析法。
具體實施例方式本發明人重新著眼于現有的肺炎球菌抗原檢測試劑盒中未使用過的F抗原，進行 抗F抗原抗體的制作。令人驚訝的是，所得的本發明的抗F抗原抗體與現有的抗F抗原單 克隆抗體不同，對流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzea)實質上不顯示交叉性(圖4)， 并且利用本抗體制作的ELISA系統對包括流感嗜血桿菌在內的其它多種菌種也基本不顯 示交叉反應(圖5)。另外，雖然迄今報道過F抗原與C-ps具有共同的多糖結構(例如， Sorensen, Danish Medical Bulletin 42 :47_53 (1995))，但是，本發明的抗 F 抗原抗體與 C-ps實質上不反應(圖2)。即，本發明的抗F抗原抗體是與現有的抗F抗原抗體或抗C-ps 抗體完全不同的、對F抗原高度特異性的、識別多糖部分的新抗體。另外，測定使用本發明 的抗F抗原抗體的肺炎球菌抗原測定系統的靈敏度時可知，與使用C-ps抗體的測定系統相 比，對相同的樣本顯示顯著的高靈敏度(圖3)。本發明的抗F抗原抗體可以通過后述的參考例所示的方法得到。首先，通過公知 的方法(例如，Poxton et al，Biochem. J. 175 =1033-1042 (1978))制備 F 抗原。制備的 F
5抗原可以直接作為免疫原使用。優選將制備的F抗原根據公知的方法(例如，馬來酰亞胺 法、吡啶二硫化物法等)與載體蛋白偶聯后作為免疫原使用。使用所得的免疫原，通過公知 的方法可以得到抗F抗原抗體。通過將偶聯的抗原作為免疫原，可以得到與流感嗜血桿菌 無交叉反應性、對肺炎球菌的特異性更高的抗F抗原抗體。作為用于偶聯的載體蛋白，例如可以列舉BSA(牛血清白蛋白，Bovine Serum Albumin)、KLH(匙孔蜮血藍蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)、0VA(卵清蛋白， Ovalbumin)、蛔蟲提取物(蛔蟲粗提取物)等，但不限于這些，只要是通常使用的載體蛋白 即可。作為用于使載體蛋白和F抗原偶聯的交聯劑，只要是蛋白質或肽之間相互連接時 通常使用的交聯劑則沒有特別限制。其中，優選使SH基與氨基交聯的雜二價反應試劑， 作為具體例，可以列舉間馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺(MBS)、N-(4-馬來酰 亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺(GMBS)、N-(6-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS)、 N-(8-馬來酰亞胺癸酰氧基)琥珀酰亞胺(HMCS)、N-(ll-馬來酰亞胺i^一酰氧基)琥珀 酰亞胺(KMUS)、N-((4-(2-馬來酰亞胺乙氧基)琥珀酰)氧基)琥珀酰亞胺(MESS)、N-琥 珀酰亞胺基-4_(N-馬來酰亞胺甲基)-環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、間馬來酰亞胺苯甲 酰-N-羥基磺基琥珀酰亞胺(sulfo-MBS)、N-(4-馬來酰亞胺丁酰氧基)磺基琥珀酰亞胺 (sulfo-GMBS)、N-(6-馬來酰亞胺己酰氧基)磺基琥珀酰亞胺(sulfo_EMCS)、N_(8_馬來酰 亞胺癸酰氧基)磺基琥珀酰亞胺(sulfo-HMCS)、N-(11-馬來酰亞胺十一酰氧基)磺基琥 珀酰亞胺(sulfo-KMUS)、磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)_環己烷-1-甲酸酯 (sulfo-SMCC)等。本發明的抗體只要具有抗F抗原應答性，既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆 抗體，還包括與這些抗體具有實質上相同的氨基酸序列的抗體。本發明的抗體還包括抗體 的整個分子、其重組體及它們的片段或修飾物、以及二價抗體及一價抗體。單克隆抗體通過如下方法制作將上述免疫原直接或與弗氏佐劑等佐劑一同免疫 到小鼠或大鼠的皮下、腹腔或肌肉內，制作被免疫個體的免疫相關細胞與骨髓瘤細胞的雜 交瘤細胞，從中選擇產生目標特異抗體的雜交瘤細胞。免疫通過使用例如0. 1 100 μ g/個 體的量的抗原、或者以偶聯中使用的載體蛋白的絕對量計為0.1 100 μ g/個體、優選1 IOyg/個體的量的抗原，以隔周的方式進行一次至數次免疫。多克隆抗體通過將上述免疫原與弗氏佐劑等佐劑一同免疫到兔子或山羊的皮下 來制作。免疫通過使用例如10 500 μ g/個體的量的抗原、或者以偶聯中使用的載體蛋白 的絕對量計為0. 1 1000 μ g/個體、優選10 500 μ g/個體的量的抗原，以隔周的方式進 行一次至數次免疫。從被免疫的個體采集血液，通過利用使用蛋白A等的親和純化或離子 交換樹脂等公知的方法，得到IgG組分。根據需要，可以組合進行凝膠過濾純化等其它純化 操作。“具有實質上相同的氨基酸序列的抗體”是指，在具有抗F抗原應答性的前提下，由 原抗體的氨基酸序列缺失、取代、插入或附加一個或多個(例如1 30個、優選1 20個、 更優選1 10個、進一步優選1 5個)氨基酸后得到的氨基酸序列構成的抗體。在特定 的氨基酸序列中取代、缺失、插入或附加一個或多個氨基酸序列的技術是公知的，例如可以 利用誘導定點突變等各種方法。作為“具有實質上相同的氨基酸序列的抗體”，還可以列舉在具有抗F抗原應答
6性的前提下，與原抗體的氨基酸序列具有80%以上的序列同源性、優選85%以上的序列 同源性、更優選90%以上的序列同源性、進一步優選95%以上的序列同源性的抗體。氨 基酸序列的同源性例如可以通過李普曼-皮爾森法(Lipman-Pearson法；Science，227， 1435(1985))進行計算。具體而言，使用遺傳信息處理軟件GeneryX-Win(Ver. 5. 1. 1 ；軟件 開發)的同源性分析(Search Homology)程序，將要比較的單位長度(ktup)設定為2進行 分析來計算。作為抗體的片段，可以列舉Fab、F(ab，)2、Fv、Fab/c或單鏈Fv(scFv)。這些抗體 片段可以通過將抗體用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶處理、或者構建編碼這些片段的基因并 將其在任意的宿主細胞中表達而得到(例如，參照Co，M. S. et al.，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976> Better, M. & Horwitz， A. H. Methodsin Enzymology(1989) 178,476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. &Skerra, A. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496,Academic Press,Inc. >Lamoyi,E. ,Methods in Enzymology (1989)121,652-663、 Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology(1989) 121,663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991)9,132-137)。scFv通過將抗體的H鏈V區與L鏈V區連接而得到。該scFv中，H鏈V區 和L鏈V區通過接頭、優選肽接頭而連接(Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988)85,5879-5883)。或者，也可以構建編碼這樣的連接肽的基因，并在任意的宿 主細胞中表達。抗體修飾物可以通過對抗體進行化學修飾而得到。抗體的重組體可以通過 使產生任意突變的抗體基因在宿主細胞中表達來制作。獲得抗體重組體及抗體修飾物的方 法是本領域公知的。本發明還提供一種肺炎球菌抗原的檢測或定量方法，其特征在于，通過使用本發 明的抗F抗原抗體的免疫學測定方法，對生物體來源的樣本中的肺炎球菌F抗原進行檢測 或定量。本發明的檢測方法能夠簡便、快速且高靈敏度地檢測肺炎球菌抗原，因此能夠進行 快速且準確的診斷。另外，通過使用本發明的定量方法，能夠簡便、快速且高精度地判斷藥 劑對肺炎球菌引起的疾病的效果等。因此，這些方法均有助于適當治療方法的早期選擇。作為本發明的測定方法中使用的生物體來源的樣本，沒有特別限制，例如，可以列 舉生物體來源的組織、器官或體液(例如，痰液、鼻腔或上咽部拭子、中耳潴留液、耳膿溢、 副鼻竇潴留液、腦脊液、尿、血液、淋巴液等)來源的樣本、及它們的培養物來源的樣本。樣 本優選來源于痰液、鼻腔或上咽部拭子、中耳潴留液、耳膿溢、副鼻竇潴留液、腦脊液、尿液、 血液、淋巴液。根據需要可以對樣本進行表面活性劑或酸、堿處理、加熱等的提取、濃縮、稀 釋等通常的預處理。本發明的方法比現有方法靈敏度高，因此，使用中耳潴留液、耳膿溢、副鼻竇潴留 液、腦脊液、血液來源的樣本等用現有方法得不到充分的測定靈敏度的樣本也是本發明方 法的優選方式。例如，肺炎球菌為腦膜炎、中耳炎、敗血癥等的病原菌，因此，如果用本發明 的方法測定中耳潴留液、耳膿溢、副鼻竇潴留液、腦脊液、血液來源的樣本，則能夠更高精度 地鑒定這些疾病的病原菌。作為本發明的方法中使用的免疫學測定方法，可以使用本領域中公知的任意免疫 測定方法。作為例示，可以列舉放射免疫分析(RIA)、ELISA等酶免疫分析(EIA)、膠乳凝集 法(LTIA)及免疫層析法。從提高檢測靈敏度的觀點考慮，優選使用夾心法。另外，從簡便性及快速性的觀點考慮，優選使用免疫層析法。使用免疫層析法時，可以在床旁或患者就診 中的短時間內進行診斷。作為上述免疫學測定中使用的標記，可以列舉本領域中使用的任意標記。作為例 示，可以列舉辣根過氧化物酶011^)、堿性磷酸酶、0-半乳糖苷酶等酶、1251、3牛、14(、355或3!1 等放射性同位素(RI)、FITC、四甲基羅丹明異氰酸酯等熒光物質、化學發光等的發光物質、 及金膠體、著色膠乳粒子等可見物質。另外，還可以列舉利用在用生物素進行一次標記后 使用由上述標記進行標記的抗生物素蛋白的增敏系統、或者在用地高辛配基等低分子物質 進行一次標記后使用由上述標記進行標記的抗體等對該低分子物質具有親和性的物質的 檢測方法。本發明還提供利用上述本發明的檢測或定量方法的檢測肺炎球菌抗原的試劑盒。 本發明的試劑盒可以包含特異性識別肺炎球菌F抗原的抗體。另外，本發明的試劑盒可以 包含用于免疫測定的其它試劑或材料。例如，本發明的試劑盒可以包含本發明的抗體以及 用于免疫層析、ELISA或膠乳凝集法的固相(例如，試條、板、微珠等)及標記物等試劑等。實施例以下，說明本發明的實施例，但是本發明不限于這些實施例。(參考例1抗F抗原抗體制作用免疫原的制備)1) F抗原樣抗原的制備參考Poxton 等的方法(Biochem. J. 175 1033-1042 (1978))，進行 F 抗原的制備。 首先，使用羊血液瓊脂培養基或腦心浸液培養基培養肺炎球菌，通過刮取法或離心法回收 肺炎球菌的團塊。將回收的團塊懸浮于適量的純化水中后，進行超聲波破碎。加熱處理后， 通過離心操作回收團塊。重復數次在純化水中懸浮、超聲波破碎和離心的操作，充分除去水 溶性成分。將得到的水不溶性團塊加入到沸煮過的SDS中，調節為終濃度2. 5%的SDS后， 在室溫攪拌數小時。離心后，用水清洗團塊。重復數次離心、水清洗的操作，回收不溶性成 分。將不溶性成分制成終濃度10%的TCA溶液并在冷藏下攪拌數小時以上。離心后回收上 清，用二乙醚等除去TCA后，在純化水中進行透析。將該溶液凍干后，得到白色粉末。認為該 白色粉末是F抗原與核酸的混合物，但是由于核酸不具有免疫原性，因此將該粉末作為抗F 抗原抗體制作用的抗原(F抗原樣抗原)在后面的步驟中使用。2) F抗原樣抗原的純度評價取Img該白色粉末溶解于ImL超純水后，使用市售的蛋白定量試劑盒(二辛可寧 酸法BCA測定試劑盒、Pierce公司)評價蛋白質的混合情況。檢測靈敏度為31. 25 μ g/mL 以下，表明蛋白質的混合極低。3)免疫原的制備參考Szu等的報道(Infection and Immunity 54 :448_455 (1986))，將得到的F抗 原樣抗原偶聯到載體蛋白(KLH(蛾血藍蛋白)或市售的蛔蟲提取物(制造商LSL、銷售商 Cosmo Bio公司))上。分別使用與載體蛋白偶聯的抗原及未偶聯的抗原(F抗原單獨)作 為免疫原。換言之，進行以下的程序。1 將懸浮在磷酸緩沖液中的載體蛋白用二硫蘇糖醇或2-巰基乙醇等SH基還原劑 進行處理。處理后，使用凝膠過濾或透析等方法置換為磷酸緩沖液。2 與上述操作并行，將適量的F抗原樣抗原溶解在磷酸緩沖液中。接著以相對于
8F抗原樣抗原lmg為0. 1 2mg (優選0. 2 lmg)的比例在溶解液中添加使游離SH與氨基 交聯的二價反應試劑(磺基-SMCC或磺基-KMUS)。3 在室溫下反應后，通過透析或凝膠過濾等方法除去過量的二價反應試劑。4:相對于每lmg通過1的操作得到的SH還原載體蛋白，在0. 1 10mg(優選0.5 5mg)的范圍內添加通過2的操作得到的二價反應試劑處理后的F抗原抗原。5 在冷藏下反應充分的時間后，再次進行透析處理。使用該溶液作為F抗原抗體 制作用的免疫原。(實施例1抗F抗原抗體的制作)1)抗F抗原多克隆抗體的制作將參考例1得到的免疫原與弗氏佐劑等佐劑一同免疫到兔(n = 11)的皮下。免 疫量在用F抗原單獨免疫時使用10 500 yg/個體、在與載體蛋白偶聯時以偶聯中使用的 載體蛋白的絕對量計使用0. 1 1000 u g/個體、優選10 500 u g/個體，以隔周的方式進 行一次至數次左右。部分地采集抗血清，確認對免疫所用的抗原的反應性后，進行大量采血 或全部采血。大量采血的情況下，在繼續免疫的同時，在不對個體產生負擔的范圍內進行數 次大量采血。將得到的全血離心分離后，以抗血清的形式冷凍保存。解凍適量抗血清，通過 利用蛋白A等的親和純化或離子交換樹脂等進行純化，得到IgG組分。另外，根據需要組合 凝膠過濾純化。2)抗F抗原單克隆抗體的制作將參考例1得到的免疫原直接或與弗氏佐劑等佐劑一同免疫到小鼠或大鼠的皮 下、腹腔或肌肉內。免疫量在用F抗原單獨免疫時使用0. 1 100 y g/個體、在與載體蛋白 偶聯時以偶聯中使用的載體蛋白的絕對量計使用0. 1 100 y g/個體、優選1 g/個 體，以隔周的方式進行一次至數次左右的免疫。部分地采集抗血清，確認對免疫所用的抗原 的反應性后，取出脾臟、胸腺或淋巴結，將從中獲得的免疫相關細胞與P3U1等小鼠骨髓瘤 細胞株用聚乙二醇法等公知的方法融合，制作雜交瘤細胞。從制作的雜交瘤細胞中通過有 限稀釋法選擇與目的抗原反應的雜交瘤細胞。從選出的雜交瘤細胞的培養上清或腹水中， 通過利用蛋白A等的親和純化或離子交換樹脂等純化單克隆抗體。另外，根據需要組合進 行凝膠過濾純化。(實施例2抗F抗原抗體的效價)將實施例1制作的由11個體的兔得到的抗血清(1號 5號以KLH為載體蛋 白，用經sulfo-SMCC交聯的抗原免疫的5只；6號 9號以蛔蟲提取物為載體蛋白，用經 sulfo-KMUS交聯的抗原免疫的4只；10、11號F抗原單獨免疫的2只)進行適當稀釋(1 5號50000倍、6 9號50000倍、10，11號1000倍)后，與F抗原樣抗原固相化板反應， 評價抗血清的效價。結果如圖1所示。可以確認全部11個體的抗血清均與F抗原樣抗原 固相化板發生強反應。另外，可以確認本抗血清與作為對照的牛血清白蛋白(BSA)固相化 板完全不反應。由這些結果表明，通過上述方法制作的全部抗血清均顯示強抗F抗原應答 性。(實施例3使用抗F抗原抗體的夾心ELISA的抗原反應性)從實施例1的抗血清中的1號及5號通過蛋白A純化及凝膠過濾純化得到IgG組 分后，構建使用上述多克隆抗體的夾心ELISA測定系統，評價其性能。換言之，在固定有5號血清來源的純化抗體的固相板中分別添加包含F抗原樣抗原或C-ps的樣品(0.041 10ng/mL)，使其與抗體反應。在使用抗F抗原抗體的測定系統中，將板清洗后，添加生物素 標記的1號血清來源的純化抗體，使其與樣品反應。將板再次清洗，加入辣根過氧化物酶 (HRP)標記的鏈親和素使其與生物素反應。然后，用吸光度計測定HRP的顯色。通過同樣的 方法，構建使用市售的C-ps制作的抗C-ps多克隆抗體夾心測定系統，測定HRP的顯色。根據測定的吸光度，評價兩種測定系統的性能。迄今為止的報道顯示C-ps與F抗 原具有共同的多糖結構(Sorensen, Danish Medical Bulletin 42 :47_53 (1995))，由此可 以預測兩種測定系統與C-ps和F抗原均有交叉反應。但是，如圖2所示，使用本發明的抗 F抗原多克隆抗體的夾心ELISA測定系統，檢測到F抗原樣抗原但完全未檢測到C-ps (圖 2A)。同樣地，使用C-ps的夾心ELISA測定系統，檢測到C-ps但完全未檢測到F抗原樣抗 原(圖2B)。由上述結果表明，本發明的抗F抗原抗體僅特異性識別F抗原。另外，本發明的抗 F抗原抗體完全不表現與C-ps的交叉反應(圖2)，因此，說明其為與現有使用的抗C-ps抗 體完全不同的新抗體。(實施例4使用抗F抗原抗體的夾心ELISA的菌體反應性)考察實施例3制作的兩種夾心ELISA測定系統對肺炎球菌菌體提取液的反應性。 菌體提取液使用通過將培養得到的肺炎球菌(ATCC49619)用表面活性劑或超聲波等破碎 而得到的溶液。如圖3所示，使用本發明的抗F抗原抗體的測定系統，以高于使用抗C-ps 抗體的測定系統100倍的靈敏度從肺炎球菌菌體提取液中檢測到肺炎球菌抗原。由此可以 確認，通過使用本發明的抗F抗原抗體的ELISA測定系統，可以以顯著高于現有使用的C-ps 測定系統的靈敏度檢測出生物體來源樣本中的肺炎球菌。另外，如圖2所示，測定純化抗原 時的靈敏度在兩種測定系統中基本相同(0. Ing/mL左右)，由此說明生物體來源的樣本中 的靈敏度差可能起因于肺炎球菌中兩種抗原的表達量的差異。(實施例5使用抗F抗原抗體的夾心ELISA的菌體特異性)公知的抗F抗原抗體或F抗原檢測系統(Kolberg et al.，Microbial Pathogenesis 22 321-329 (1997) Stuertz et al. , J. Clin. Microbiol.36 2346-2348(1998))中，利用磷酸膽堿部分作為表位。因此，這些抗體或檢測系統存在除F抗 原以外、與C-ps及流感嗜血桿菌等也具有強交叉反應性的缺點。因此，對使用實施例1得到的抗血清(1 11號)來源的本發明的抗F抗原多克 隆抗體的夾心ELISA測定系統在菌種間的交叉反應性進行了考察。為進行比較，使用以磷 酸膽堿為表位的小鼠單克隆抗體HAS (國立血清研究所，丹麥；參考文獻=Infection and immunity 1984 ；43 876-878,Microbial Pathogenesis 1993;14:299-305)進行同樣的實驗。1)與流感嗜血桿菌間的交叉反應性的比較將肺炎球菌(ATCC49619)和流感嗜血桿菌(B型，ATCC31441)的培養菌體進行超 聲波破碎后，利用市售的蛋白定量試劑盒(二辛可寧酸法BCA測定試劑盒、Pierce公司) 進行蛋白定量，用D-PBS稀釋后以1.0 μ g/mL的濃度在ELISA用板上固相化過夜。通過一 般的方法封閉后，使其與適當稀釋的實施例1制作的各抗血清(1 5號50000倍、6 9 號50000倍、10，11號1000倍)或上述HAS抗體的稀釋液(125倍)反應。然后，用HRP標記的抗兔IgG抗體或HRP標記的抗小鼠IgM抗體進行顯色，利用吸光度計測定HRP的顯 色。另外，使用BSA固相板作為對照板。結果如圖4所示。用F抗原單獨免疫而得到的10、11號兩種抗血清以及以磷酸膽堿為表位的HAS抗 體，與肺炎球菌破碎抗原和流感嗜血桿菌破碎抗原均發生反應。另一方面，用偶聯抗原免疫 而得到的1 9號抗血清中，只有8號有弱交叉，但是，對流感嗜血桿菌沒有反應性，對肺炎 球菌具有高度特異性。因此，使用通過將F抗原與載體蛋白交聯而制作的抗原作為免疫原 而得到的抗體，不產生像HAS抗體那樣的與流感嗜血桿菌的交叉反應，由此說明其為不識 別磷酸膽堿的抗F抗原抗體。另一方面可知，以未與載體蛋白偶聯的F抗原抗原作為免疫 原而得到的抗血清，包含與HAS抗體同樣的以磷酸膽堿為表位的抗體。2)多菌種間的交叉反應性的比較進而，考察多菌種間的交叉反應性。除了使用表1的菌以外，使用與本實施例的1) 同樣的方法測定本發明的抗體的反應性。結果如圖5所示。本發明的抗體與Stuertz等 (Stuertz et al.，J. Clin. Microbiol. 36 :2346_2348 (1998))的抗體同樣，與緩癥鏈球菌 (S. mitis)有交叉反應性，但是與其它菌種之間完全沒有交叉反應。[表 1]
1權利要求
一種抗體，其特異性識別肺炎球菌F抗原。
2.如權利要求1所述的抗體，其實質上不顯示與流感嗜血桿菌抗原及肺炎球菌莢膜多 糖抗原的交叉反應性。
3.一種肺炎球菌抗原的檢測或定量方法，其特征在于，通過使用權利要求1或2所述的 抗體的免疫學測定方法，對生物體來源的樣本中的肺炎球菌F抗原進行檢測或定量。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述生物體來源的樣本為中耳或副鼻竇來源的樣本。
5.一種肺炎球菌抗原檢測試劑盒，含有權利要求1或2所述的抗體。
6.如權利要求5所述的試劑盒，用于實施權利要求3所述的方法。
全文摘要
本發明提供能夠簡便、快速且高靈敏度地從生物體來源的樣本中檢測或定量肺炎球菌抗原的免疫學檢測方法及用于該方法的抗體。本發明提供特異性識別肺炎球菌F抗原的抗體。本發明還提供一種肺炎球菌抗原的檢測或定量方法，其特征在于，通過使用上述抗體的免疫學測定方法對生物體來源的樣本中的肺炎球菌F抗原進行檢測或定量。本發明還提供含有上述抗體的肺炎球菌抗原檢測試劑盒。
文檔編號C12N15/02GK101981452SQ200980111519
公開日2011年2月23日 申請日期2009年3月31日 優先權日2008年3月31日
發明者西條容子, 赤松優 申請人:大塚制藥株式會社