專利名稱：乙酰化過低和過高的腦膜炎球菌莢膜糖的制作方法
技術領域：
本發明涉及腦膜炎球菌莢膜糖及其偶聯衍生物的領域。
背景技術：
多糖是重要的生物分子，它們廣泛地應用于預防和治療疾病的制藥工業。例如，莢膜多糖在抗帶莢膜的細菌，如腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis))、 肺炎球菌(肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae))和Hib (B型流感嗜血菌 (Haemophilus infiuenzae))的疫苗中使用多年。
為增強莢膜多糖，特別是在兒童中的免疫原性，開發了偶聯疫苗。這些疫苗含有與載體蛋白偶聯的莢膜糖[例如，參考文獻1-3]。偶聯將不依賴于T的抗原轉變為依賴于T 的抗原。
腦膜炎奈瑟球菌血清群W135( "Menff 135")的莢膜糖含有唾液酸-半乳糖二糖單位的聚合物
— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)-α -(2 — 6)-D-Gal-α - (I —
其中“Neu”指通常稱為唾液酸的神經氨酸。
類似地，腦膜炎奈瑟球菌血清群Y (MenY)的莢膜糖含有唾液酸-葡萄糖二糖單位的聚合物
— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)-α -(2 — 6)-D-Glc-α -(I —
實質上，這些莢膜糖在一些唾液酸殘基的一些7和9位發現是O-乙酰化的。W135 糖的O-乙酰化在參考文獻4中“首次報道”，該文獻報道了在0-7和0-9位的O-乙酰化。雖然作者注意到以前的工作表明O-乙酰化在0-7、0’ -3或O’ -4位發生，但血清群Y糖的0-7 和0-9位也觀察到乙酰化。參考文獻5報道了糖的O-乙酰基含量的進一步研究。
參考文獻5報道就血清群W135而言，“有越來越多的證據顯示O-乙酰化在引發保護性抗體應答中不重要”。相反，參考文獻6報道“有證據表明O-乙酰化影響多糖疫苗的免疫原性”。假定“CPS[莢膜多糖]的O-乙酰化在引發保護性免疫力中不重要”，然而參考文獻5的作者研究了血清群W135和Y的乙酰化。他們的研究結果表明這兩種血清群于室溫在堿性條件下保存9天后O-乙酰化無變化。
參考文獻7報道于四價多糖疫苗中的“W135和Y菌株的O-乙酰化狀態”以前“未報道”。作者在參考文獻8中繼續報道“關于血清群W135和Y的O-乙酰化狀態知之甚少”， 并且他們說進一步的工作“可增進對最優化疫苗制劑的了解”，然而這種進一步工作的本質和可能的了解并未詳細描述。參考文獻9報道血清群W135的“O-乙酰化與疫苗開發的關聯性尚未確定”。參考文獻6同意“O-乙酰化對血清群W-135或Y多糖的免疫原性的影響尚未獲得”的論據(2004年I月)。
對血清群W135和Y的這種誤解和信息的缺乏與當前用作糖疫苗的兩種其它血清群完全不同。腦膜炎奈瑟球菌血清群C莢膜多糖的O-乙酰化差異已廣泛報道[10、11]，但似乎對免疫原性無任何負面影響，因為Men jugate 和NeisVac-C 產品均是有效的。相反， 血清群A多糖的脫-O-乙酰化與“免疫原性的顯著降低”有關[12]。
本發明的目標是提供用于生產免疫原性組合物，特別是當偶聯于載體蛋白和腦膜炎血清群W135和Y時的莢膜糖衍生物。發明內容
盡管O-乙酰化在腦膜炎球菌血清群W135和Y疫苗中的作用不確定，本發明人發現O-乙酰化實際上是有關的，特別是在制備偶聯疫苗期間。本發明是基于以下發現來源于MenW135和MenY并改變唾液酸殘基7和9位的O-乙酰化水平的修飾莢膜糖可用于制造免疫原性組合物。相對于未修飾的天然糖，本發明的衍生物在與載體蛋白偶聯期間擇優選擇。此外，與天然多糖相比，這些衍生物的偶聯物顯示提高了免疫原性。
修飾的糖
因此，本發明提供修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)糖中<的唾液酸殘基在7位是O-乙酰化的；和/或(b)糖中> y%的唾液酸殘基在9位是O-乙酰化的。
類似地，本發明提供修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖，其中(a)糖中的唾液酸殘基在7-位是O-乙酰化的；和/或(b)糖中> 7%或< 2%的唾液酸殘基在9位是 O-乙酰化的。
X的值取決于血清群就血清群W135而言，X是29或更少(例如，28、27、26、25、 24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0· 5 或 O);就血清群Y而言，X是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0· 5或O)。
y的值也取決于血清群就血清群W135而言，y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100);就血清群 Y 而言，y 是 29 或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98,99或 100)。
z 值是 27 或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0· 5 或 O)。
優選x>m，其中選自0、0· 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10。
優選z>p，其中 P 選自0,0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10。
本發明的糖
更具體地說，本發明提供任選與載體蛋白偶聯的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其中該糖含有η個或更多個二糖重復單元{[唾液酸]-[己糖]}，其中己糖是半乳糖或葡萄糖，η是1-100的整數，并且其中(a)在所述η個或更多個重復單元中< χ%的唾液酸殘基在7 位是O-乙酰化的；和/或(b)當己糖是半乳糖時，在所述η個或更多個重復單元中彡y% 的唾液酸殘基在9位是O-乙酰化的，并且當己糖是葡萄糖時，在所述η個或更多個重復單元中彡或彡z%的唾液酸殘基在9位是O-乙酰化的。
X值取決于己糖當己糖是半乳糖時，X是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0· 5 或 O);當己糖是葡萄糖時，X是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0· 5或O)。
y的值取決于己糖當己糖是半乳糖時，y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100)；當己糖是葡萄糖時，y 是 29 或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98,99或 100)。
z 值是 27 或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0· 5 或 O)。
如上定義的，優選x>m。如上定義的，優選z>p。
唾液酸殘基優選是N-乙酰神經氨酸。
當己糖是半乳糖時，{[唾液酸]-[己糖]} 二糖單元優選是
— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)-α -(2 — 6)-D-Gal-α - (I —
當己糖是葡萄糖時，{[唾液酸]-[己糖]} 二糖單元優選是
— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)-α -(2 — 6)-D-Glc-α -(I —
修飾的腦膜炎球菌莢膜糖優選與載體蛋白偶聯。在這種偶聯物中(i)優選2-9% 之間、更優選4-8%之間、還要優選5-7%之間、再優選約6%的唾液酸殘基在7位O-乙酰化；( )優選35-55 %之間、更優選40-50 %之間、還要優選42-46 %之間、再優選約43 % (當己糖是Gal)或約45% (當己糖是Glc)的唾液酸殘基在9位O-乙酰化。
本發明也提供包含a分子個血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖的組合物，其中每個莢膜糖分子的唾液酸殘基的平均數目是b，并且其中(a)組合物中< x%的a *b個血清群 W135唾液酸殘基在7位O-乙酰化；和/或(b)組合物中> y%的a *b個血清群W135唾液酸殘基在9位O-乙酰化，并且其中X、y和z如上定義。
本發明也提供包含a分子個血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖的組合物，其中每個莢膜糖分子的唾液酸殘基的平均數目是b，并且其中(a)組合物中彡x%的a *b個血清群Y唾液酸殘基在7位O-乙酰化；和/或(b)組合物中> y%或彡z %的a *b個血清群Y唾液酸殘基在9位O-乙酰化,并且其中X、y和z如上定義。
所述種群中的糖可偶聯于蛋白質運載體和/或游離于溶液中。
本發明的糖或偶聯物優選是純化的形式，例如基本上在沒有天然多糖的情況下。
結構表示
本發明提供一種任選偶聯于載體蛋白的糖，該糖含有η個或更多個以下二糖重復單元
權利要求
1.一種修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖，其與載體蛋白偶聯，其中(a)所述糖中2-9%的唾液酸殘基在7位是O-乙酰化的；和/或(b)所述糖中35-55%的唾液酸殘基在9位是0-乙酰化的。
2.—種修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖，其與載體蛋白偶聯，其中(a)所述糖中2-9%的唾液酸殘基在7位是0-乙酰化的；和/或(b)所述糖中35-55%的唾液酸殘基在9位是0-乙酰化的。
3.如權利要求I或2所述的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其特征在于，所述糖中4-8%的唾液酸殘基在7位是0-乙酰化的。
4.如權利要求I或2所述的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其特征在于，所述糖中40-50%的唾液酸殘基在9位是0-乙酰化的。
5.一種偶聯于載體蛋白的修飾的腦膜炎球菌莢膜糖，其中所述糖含有n個或更多個二糖重復單元 {[唾液酸]-[己糖]}， 其中的己糖是半乳糖或葡萄糖，n是1-100的整數，并且其中 (a)在所述n個或更多個重復單元中X%的唾液酸殘基在7位是0-乙酰化的；和/或 (b)當己糖是半乳糖時，在所述n個或更多個重復單元中7%的唾液酸殘基在9位是0-乙酰化的，并且當己糖是葡萄糖時，在所述n個或更多個重復單元中的唾液酸殘基在9位是0-乙酰化的， 其中當己糖是半乳糖時，X是2_9且y是35_55 ;當己糖是匍萄糖時，x是2_9、y是35-55。
6.如權利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是半乳糖，在所述n個或更多個重復單元中6%的唾液酸殘基在7位是0-乙酰化的，并且在所述n個或更多個重復單元中43%±4. 3%的唾液酸殘基在9位是0-乙酰化的。
7.如權利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是葡萄糖，在所述n個或更多個重復單元中6%的唾液酸殘基在7位是0-乙酰化的，并且在所述n個或更多個重復單元中45%±4. 5%的唾液酸殘基在9位是0-乙酰化的。
8.一種含有血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖分子的組合物，其中(i) (a)組合物中2-9%的血清群W135莢膜糖分子的唾液酸殘基在7位0-乙酰化；和/或(b)組合物中35-55%的血清群W135莢膜糖分子的唾液酸殘基在9位0-乙酰化；(ii)糖與載體蛋白偶聯。
9.一種a個含有血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖分子的組合物，其中(a)組合物中2_9%的血清群Y莢膜糖分子的唾液酸殘基在7位0-乙酰化；和/或(b)組合物中35-55%血清群Y的莢膜糖分子的唾液酸殘基在9位0-乙酰化；(ii)糖與載體蛋白偶聯。
10.一種含有n個或更多個以下二糖重復單元的糖
11.如以上任一項權利要求所述的糖，其特征在于，所述糖具有低于30的平均聚合度。
12.(i)以上任一項權利要求所述的糖的偶聯產物，，其中載體蛋白選自白喉類毒素、破傷風類毒素、流感嗜血菌蛋白D和CRM197的載體蛋白。
13.一種免疫原性組合物，所述組合物含有(a)以上任一項權利要求所述的修飾的莢膜糖偶聯物，和(b)藥學上可接受的運載體。
14.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物呈含水形式。
15.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物呈凍干形式。
16.如權利要求13-15中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自血清群C腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖抗原。
17.如權利要求13-16中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自血清群A腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖抗原。
18.如權利要求17所述的組合物，其特征在于，所述血清群A抗原是其中天然糖的一個或多個羥基被阻斷基團取代的修飾的糖。
19.如權利要求13-18中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的抗原。
20.如權利要求13-19中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自B型流感嗜血菌的糖抗原。
21.如權利要求13-20中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有來自肺炎鏈球菌的抗原。
22.如權利要求13-21中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有一種或多種以下抗原甲肝病毒的抗原；乙肝病毒的抗原；百日咳博德特菌的抗原；白喉類毒素；破傷風類毒素和/或脊髓灰質炎病毒抗原。
23.如權利要求13-22中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物用作藥物。
24.如權利要求1-11中任一項所述的修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖和/或修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖用于制備抗腦膜炎球菌性腦膜炎的疫苗的用途。
25.如權利要求1-12中任一項所述的修飾的血清群W135腦膜炎球菌莢膜糖和/或修飾的血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖在生產抗腦膜炎球菌性腦膜炎的藥物中的應用。
26.一種制備免疫原性偶聯物的方法，所述方法包括以下步驟(1)提供起始血清群W135或血清群Y腦膜炎球菌莢膜糖和載體蛋白，其中一個或兩個均是任選修飾的以賦予它/它們與另一個的反應性；(2)在糖和載體蛋白之間形成共價鍵；和(3)純化得到糖偶聯物，其中，在步驟(I)和(3)之間，起始糖中唾液酸殘基9位的O-乙酰化程度增加至35-55%。
全文摘要
來自腦膜炎奈瑟球菌的血清群W135和Y的莢膜糖改變了它們的唾液酸殘基的7和9位的O-乙酰化水平，并且可用于產生免疫原性組合物。相對于未修飾的天然糖，本發明的衍生物在與載體蛋白偶聯期間擇優選擇，并且與天然多糖相比，這些衍生物的偶聯物顯示提高了免疫原性。
文檔編號C08B37/00GK102977219SQ20121042540
公開日2013年3月20日 申請日期2004年10月4日 優先權日2003年10月2日
發明者P·科斯坦蒂諾, F·貝蒂 申請人:諾華疫苗和診斷有限公司