專利名稱：單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物藥物轉導、納米藥劑學領域，更具體地講，涉及一種針對腫瘤的蛋白或核酸防治藥物的單壁碳納米管轉載技術。
背景技術：
目前，癌癥已經成為危害全世界人類健康的一大疾病，全世界每年約600萬人死于惡性腫瘤，中國現有癌癥患者約450萬人，死亡率逾30%，造成了嚴重的社會問題。用于腫瘤治療的化療藥物能夠殺死腫瘤細胞，但缺乏對腫瘤細胞的特異性。同時，我們也應該看到，以蛋白質與核酸為主體的生物大分子藥物在實際應用中也存在著一些區別于化學藥物的特殊問題，諸如，這些大分子藥物難于進入細胞起作用，而且在血液或者體液中被降解，產生免疫反應等問題，因此，研究副作用小、載藥量大、靶向性好、生物相溶性生物抗腫瘤藥物已成為全球醫藥研究領域的最重要目標和方向。傳統的藥物給藥方式不能通過生物屏障，無法對特殊病灶部位進行有效治療。靶向給藥充分體現了以生物分子為靶點治療的潛力。如何使高效遞送生物活性分子(肽、蛋白、DNA等)進入腫瘤細胞特定部位是重點，開發新型藥物載體有積極意義。 雖然前幾年已經有多種納米材料應用于藥物傳遞與診斷，特別是金屬納米材料，但同時也發現在應用性能、載藥量、可控性與靶向性等方面還是存在比較多的缺陷。單壁碳納米管 (SCNTs)具有獨特的中空結構和納米管徑，SCNTs具有高純度和尺寸一致等優點，對人體毒性較小，在結構上表面積大，能攜帶大量藥物。因此，國際上許多科學技術機構的科學家正著手對抗癌藥物傳送系統進行試驗。本發明在優選適合的單壁碳納米管的基礎上，利用PL-PEG5000-Amine對其進行功能化修飾以提高SWCNTs的溶解性，然后與核酸藥物分子偶聯，對乳腺癌細胞B-cap的轉染性進行研究，同時在SWCNTs空載情況下，對細胞的毒性進行研究。研究表明低濃度的 SffCNTs對細胞幾乎沒有毒性，轉染效率略低于傳統的lip2000脂質體轉染。SWCNTs作為藥物載體有其獨特的優勢，并以幾種核酸與蛋白藥物作為目標藥物進行抗腫瘤生物治療，顯示出一定的優勢，是一種適合有效的生物大分子抗腫瘤藥物技術。
發明內容
本發明的目的在于提供一種單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術。本發明的第二個目的是提供所述單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術在促進所述藥物靶向性中的應用。為實現以上目的，本發明公開以下技術方案單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術， 包括以下步驟
(1)單壁碳納米管的分散、質量檢測與單壁碳納米管PL-PEG-Amine功能化；
(2)功能化的單壁碳納米管與目標分子連接，所述目標分子是指生物大分子抗腫瘤藥物，包括核酸藥物或者蛋白藥物；(3 )單壁碳納米管介導的步驟(2 )所述目標分子轉載。步驟(1)獲得的單壁碳納米管直徑1-4納米、長度4-500納米。步驟(1)獲得的功能化的單壁碳納米管保存在4攝氏度、PL-PEG過量的溶液中。步驟(2)功能化的單壁碳納米管通過-NH2或-SH與目標分子連接。步驟(2)所述核酸藥物或者蛋白藥物是指生存素(survivin)及其突變體與剪接體、P53 及其突變體、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 抗體與單鏈抗體、MDM2癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纖維細胞激活蛋白 (FAP)、貝塔聯蛋白(β -Catenin)中的一種或幾種。單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術在促進所述藥物靶向性中的應用。本發明的優點在于單壁碳納米管轉載的藥物制劑對細胞的毒性低，轉染效率接近于傳統采用的脂質體LIP2000，而且相對穩定，在用量上比較小，由于它與目標大分子是通過化學鍵連接，因此對目的生物大分子的結合上比較牢固、易與運載，具有重要的發展前景。本發明中所采用的單壁碳納米管偶聯其它與腫瘤細胞特異結合的基團或抗體分子，使其有效的靶向腫瘤細胞，可以針對體外細胞，也可以針對人或動物。
圖1為SWNT溶液RAMAN光譜檢測結果。圖2為SWNT分散與連接效果圖，連接后PEG-SWNT濃度為5. 29mg/L,濃縮后濃度為 13.90mg/L。圖3為PEG-SWNT溶液稀釋10倍后的分散與連接效果圖，最終PEG-SWNT濃度為 53. 68mg/L。圖4為808nm吸收值與碳納米管濃度標準曲線(molar extinction coef cient of SffNT, ε =7. 9X106 ifW1)。圖5為單壁碳納米管載體與脂質體lip2000轉染效率檢測結果表。圖6為單壁碳納米管載體與脂質體lip2000轉染效率比較圖。圖7為對單壁碳納米管載體轉染細胞的效果與脂質體(LIP2000)效率檢測結果， 其中，A為Mh的檢測結果，B為48h的檢測結果。圖8為不同SWNTs濃度Mh，48h，72h的細胞增值率數據表。圖9為不同SWNTs濃度Mh，48h，72h的細胞增值率比較圖，評價單壁碳納米管載體毒性。圖10為SWNTs與LIP2000相對比的轉染實驗結果。圖11為流試細胞檢測結果，顯示被SWNT攜帶入細胞內的被選siRNA，與對照相比，對乳腺癌細胞有明顯的促凋亡作用。圖12為SWCNT與目標蛋白的連接結果示意圖，其中，①SWCNT(l-2nm，IOOnm)； ②磷脂；③支鏈PEG (15h)；④二硫鍵；⑤靶向分子(TFR/CD71)；⑥Survivin (T34A)； ⑦ RFP(635nm)。圖13為SWCNT與目標蛋白的連接方式示意圖。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明做詳細說明，實施例的作用僅是解釋而非限定本發明。實施例一單壁碳納米管(SWCNT)轉載核酸藥物。步驟(1)單壁碳納米管的分散、質量檢測與單壁碳納米管PL-PEG-Amine功能化。1)向20ml玻璃閃爍瓶中加入Img SffNTs和5mgPL-PEG_Amine，加入5ml水，震蕩至PL-PEG完全溶解。2)注意SWNTs非常輕，易擴散，要避免吸入SWNTs。操作時穿戴眼鏡、實驗服和面罩。3)將1)中的閃爍瓶置于超聲水槽中超聲60min，每20min更換一次水槽的水，避免水溫過熱。4)注意將閃爍瓶置于水槽的最佳位置，以期獲得最佳超聲效果。5)離心上述SWNT懸浮液，24，000g，6h，室溫(22°C)。收集上清。6)用UV-VIS-OTR測定獲得的SWNT溶液的808nm的吸光度，如圖4所示。確定 SWNT的濃度，4攝氏度保存。7) PL-PEG功能化的SWNT在結合其他基團前能在4攝氏度保存1_2個月，強烈建議將SWNT保存在PL-PEG過量的溶液中。8)將Iml得到的SWNT溶液加入細1微量過濾濃縮裝置(MWCOlOOkDa)。加入3ml 水，室溫4000g離心lOmin，殘留的體積應該小于0. 5ml。再補充水到細1，離心，重復5_6次， 洗去SWNT溶液中多余的PL-PEG。加入適量的水，調節SWNT的濃度為50mg/L。(UV-VIS-NIR 在808nm測定的質量吸光比為0. 0465mg/ (L*cm))。步驟(2)目標分子SiRNA與功能化的SWNT連接。1)將 500 μ IPL-PEG-Amine 功能化的 SffNT 與 0. 5mgSuIfo-LC-SPDP 混合，加入 50 μ 110XPBS中，室溫孵化2h。2)在1)開始的同時，配制IOmM的DTT (1. 54mgDTT溶解于Iml水中)。將15μ1 100 μ MsiRNA 與 1· 5 μ IDTT 混合，室溫反應 1. 5h。3)在1)結束后，用微量過濾濃縮裝置(MWCO=IOOkDa)去除多余的Sulfo-LC-SPDP， 重復洗滌5-6次(用3-鈿1 DNAse / RNAse水，IOOOOg離心6_8min)，使得終體積低于10 μ 1。注意得到的活化的SWNT必需立即用于SiRNA結合。4)在2)結束后，與3)同時進行，使用ΝΑΡ-5柱子用純凈的DTT處理siRNA (按照 NAP-5柱子使用說明書)。用DNAse / RNAse free IX PBS從柱子上洗脫下siRNA。5)重懸3)得到的活化的SWNTs和500 μ L經4)純化后的siRNA，4攝氏度結合反應24h。SffNT和siRNA的終濃度分別為40mg/L和2. 5 μ Μ。SWNT-siRNA結合后立即使用， 這樣降低污染和siRNA降解的風險。研究結果顯示，利用PL-PEG5000-Amine合理地對單壁碳納米管進行功能化修飾，使其溶解性與生物相容性得到提高。同時可以與選擇的目標分子，包括=Survivin及其突變體與剪接體、P53及其突變體、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)抗體與單鏈抗體、MDM2癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纖維細胞激活蛋白(FAP)、貝塔聯蛋白(β -Catenin)進行偶連，以用于腫瘤防治。步驟(3) =SffNTs與Lip2000脂質體分別介導的siRNA轉染(Lip2000脂質體為對照)。
1)準備細胞。貼壁細胞轉染前M hrs，在500 L無抗培養基中接種0. 5-2X105 個細胞，轉染時細胞融合度為30-50% (注鋪板時要將細胞消化完全混勻，避免細胞堆積生長)。2)懸浮細胞。轉染前M虹8，在500 1^無抗培養基中接種0.5-2\105個細胞， 轉染時細胞數量應在4-8X IO5/孔。對于每個轉染樣品，按下面的方法準備。3)用50 μ L Opti-MEM稀釋siRNA (轉染細胞的終濃度為33 nM)，輕輕吹吸3_5 次混勻。輕輕顛倒混勻轉染試劑，用50 μ L Opti-MEM稀釋1.0 yL LipofectamineTM2000, 輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5 min。混合轉染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸3_5次混勻，室溫下靜置20 min.轉染復合物加入到M孔細胞板中，100 μ L/孔，前后輕搖細胞板混合均勻。細胞板置于37 oC、5% CO2培養箱中培養18-48 hrs。轉染4_6 hrs后可換新鮮培養基。單壁碳納米管載體與脂質體lip2000轉染效率檢測結果表見圖5，單壁碳納米管載體與脂質體lip2000轉染效率繪圖比較見圖6。由結果可見，在稍高濃度時，其轉染效率可接近傳統脂質體轉染效率。實施例二 SWNTs的細胞毒性實驗——MTT法(與脂質體LIP2000作為對照)。1)接種細胞用含10%胎小牛血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000 -10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2)培養細胞同一般培養條件，培養3 — 5天(可根據試驗目的和要求決定培養時間)。3)呈色培養3 - 5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS溶解)20ul.繼續孵育 4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ul DMS0，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。4)比色選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以碳納米管濃度為橫坐標，細胞增殖率為縱坐標繪制條形圖。對單壁碳納米管載體轉染細胞的效果與脂質體(LIP2000)效率檢測結果如圖7所
7J\ ο5)單壁碳納米管載體的細胞毒性評價通過對SWNTs的功能化，利用超濾濃縮，制備不同濃度梯度的SWNTs濃度，檢測Mh，48h，72h的細胞增值率，結果見圖8，繪圖比較見圖 9。結果顯示，低濃度的單壁碳納米管對細胞幾乎沒有毒性，可作為良好的載藥系統。實施例三單壁碳納米管轉載核酸藥物(siRNA)對腫瘤細胞的作用(與脂質體 LIP2000作為對照)。1)連接方法將 500 μ IPL-PEG-Amine 功能化的 SWNT 與 0. 5mgSuIfo-LC-SPDP 混合，加入50 μ 110XPBS中，室溫孵化濁。2)在1)開始的同時，配制IOmM的DTT (1. 5%igDTT溶解于Iml水中)。將15μ1 100 μ MsiRNA 與 1· 5 μ IDTT 混合，室溫反應 1. 5h。3)在1)結束后，用微量過濾濃縮裝置(MWCO=IOOkDa)去除多余的Sulfo-LC-SPDP， 重復洗滌5-6次(用3-4ml DNAse / RNAse水，IOOOOg離心6_&ι η)。使得終濃度低于10 μ 1。 (注得到的活化的SWNT必需立即用于siRNA結合)。4)上述2)結束后，與3)同時進行，使用ΝΑΡ-5柱子用純凈的DTT處理siRNA (按照NAP-5柱子使用說明書)。用DNAse / RNAse free IX PBS從柱子上洗脫下siRNA。5)重懸3)得到的活化的SWNTs和500 μ L經4)純化后的siRNA。4攝氏度結合反應24h, SffNT和siRNA的終濃度分別為40mg/L和2. 5 μ Μ。(注SWNT_siRNA結合后立即使用，以降低無所謂污染和siRNA降解)。6)MTT實驗方法檢測轉化效率與對腫瘤細胞的作用效果。設定MTT實驗藥物濃度為20匪、30匪、44匪、67匪、100匪。細胞鋪板調稀，控制鋪板時細胞濃度為30-50%。鋪板后6小時培養基中不加血清。LIP2000組和SWNTs組濃度相同，分別設定載有100匪的陰性siRNA作為對照。 圖10為與陽離子脂質體相對比的轉染實驗結果，顯示其進入細胞的效率與通常采用的 LIP2000作用效果是相接近的。7)通過流試細胞檢測結果顯示，被SWNT攜帶入細胞內的被選siRNA，與對照相比， 對乳腺癌細胞有明顯的促凋亡作用(圖11所示)，顯示了這種技術應用于轉導核酸抗腫瘤藥物是有效的。實施例四單壁碳納米管(SWCNT )轉載蛋白藥物。將直徑l-2nm，長度在Γ ΟΟηπι的單壁碳納米管(SffCNT)通過混分散后，利用混酸處理和活化后，依次與合成的磷脂分子交聯，利用支鏈PEG修飾15h;通過二硫鍵與靶向腫瘤細胞的分子(如葉酸、抗體分子或受體分子)相連接；同時與目標蛋白(如 Survivin (T34A)、P53、MDM2等)，同時，為了顯示這種轉載體系在腫瘤組織中的位置，還將 63(T700nm 的熒光蛋白，如紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Proteins，RFP s)與 SWCNT 上的目標藥物蛋白，通過基因工程融合表達制備，然后相連接而成一個具有示蹤功能的單壁碳納米管轉載抗腫瘤蛋白體系。其中一種連接結果示意圖如圖12。實施例五單壁碳納米管(SWCNT)轉載蛋白藥物。SffCNT與目標蛋白的連接技術利用一定比例的硝酸與硫酸混酸處理后的單壁碳納米管(SWCNT)在氯仿中與己二胺反應得到多氨基終端的碳納米管即CNT-NH。酸化的碳納米管與十六烷基溴等在一定條件下反應得到CNT-NH。功能化碳納米管在Tris-HCl緩沖液中超聲后加入酶液震蕩離心。固定化酶量利用Brandford測定上清中蛋白含量。單壁碳納米管與目標蛋白連接產物的表征采用CNT - C00H的FIlR光譜與拉曼光譜，結果皆展現出典型的條帶。然后對比分析CNT-C00H、CNT-NH、CNT-R固定化效率，發現 CNT-C00H效率最高，裝載量也最大。在此基礎上，將連接好的對照蛋白與目標蛋白分別孵育腫瘤細胞，然后收集各時間段細胞。進行熒光顯微鏡觀察和流式細胞檢測蛋白進入細胞的情況，裂解細胞進行 ffesternbolt檢測蛋白被切割的情況與作用效果。圖13為一種單壁碳納米管(SWCNT)與目標蛋白的連接方式示意圖。SffCNT對候選蛋白藥物的轉載技術為了檢測單壁碳納米管(SWCNT) 對候選蛋白藥物的轉載技術的有效性，作為對照，先在pET-22b上構建表達 ① TAT—I inker—UbGG-mCherry、② TAT—1 inker—mCherry、③ TAT—linker—UbGV— mCherry三個示范性蛋白，并用his柱純化，用TAT代替SWCNT檢測腫瘤細胞質中的泛素專一性酶對泛素切割的有效性。判斷依據①與②為了說明具有WdGG能在細胞質內被切割； ①與③為了說明泛素專一性酶對泛素的切割發生在兩個GG之后，把GG突變為GV后會阻止泛素專一性酶的切割。在上述檢測有效的基礎上，構建目標載體系統=SWCNT-Iinker-UbGG-Protein,其中的蛋白質ftOtein為本發明中候選的下列蛋白質=Survivin及其突變體與剪接體、P53及其突變體、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體與單鏈抗體、癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纖維細胞激活蛋白(FAP)、貝塔聯蛋白 (β -Catenin)。在前一步的基礎上，檢驗了泛素專一性酶對泛素切割的有效性后，將蛋白轉移到 SffCNT上，在pTWim構建下列3個表達質粒
①linker—UbGG-mCherry ；
②Iinker-UbGG-Pr (P53、Sm34 或抗 Survivin 多肽)；
③scFv單鏈抗體(在pTXBl上表達，幾丁質純化)。通過構建上述三個質粒以實現下列目標①起示范作用；②需要轉載的蛋白；③ 靶向性作用。選用不同的scFv可以靶向不同的腫瘤細胞。在pTWim上表達，純化出來的蛋白在N端具有一個半胱氨酸，便于通過二硫鍵與SWCNT連接；在pTXBl上表達，純化出來的蛋白在C端具有一個硫酯，便于通過酰胺鍵與SWCNT連接。酰胺鍵比二硫鍵牢固，不易斷開。具體實驗方法采用1 inker—UbGG-P與scFv通過摩爾比(如10 1)與SWCNT連接構成載體系統SWCNT-Iinker-UbGG-Pr。然后進行靶向性，有效性評價。通過具體的優化與檢測后，證明單壁碳納米管(SWCNT)通過轉載候選蛋白藥物，起到了靶向傳遞蛋白質藥物與抗腫瘤功效。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術，其特征在于，包括以下步驟(1)單壁碳納米管的分散、質量檢測與單壁碳納米管PL-PEG-Amine功能化；(2)功能化的單壁碳納米管與目標分子連接，所述目標分子是指生物大分子抗腫瘤藥物，包括核酸藥物或者蛋白藥物；(3 )單壁碳納米管介導的步驟(2 )所述目標分子轉載。
2.根據權利要求1所述的單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術，其特征在于，步驟(1)獲得的所述單壁碳納米管直徑1-4納米、長度4-500納米。
3.根據權利要求1所述的單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術，其特征在于，步驟(1)獲得的功能化的單壁碳納米管保存在4攝氏度、PL-PEG過量的溶液中。
4.根據權利要求1所述的單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術，其特征在于，步驟(2)功能化的單壁碳納米管通過-NH2或-SH與目標分子連接。
5.根據權利要求1所述的單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術，其特征在于，步驟(2)所述核酸藥物或者蛋白藥物是指生存素及其突變體與剪接體、P53及其突變體、血管內皮生長因子抗體與單鏈抗體、MDM2癌基因、成纖維細胞激活蛋白、貝塔聯蛋白中的一種或幾種。
6.權利要求1所述的單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術在促進所述藥物靶向性中的應用。
全文摘要
本發明公開一種單壁碳納米管轉載抗腫瘤藥物技術及其應用，包括以下步驟(1)單壁碳納米管的分散、質量檢測與單壁碳納米管PL-PEG-Amine功能化；(2)功能化的單壁碳納米管與目標分子連接，所述目標分子是指生物大分子抗腫瘤藥物，包括核酸藥物或者蛋白藥物；(3)單壁碳納米管介導的步驟(2)所述目標分子轉載。單壁碳納米管轉載的藥物制劑對細胞的毒性低，轉染效率接近于傳統采用的脂質體LIP2000,而且相對穩定，在用量上比較小，由于它與目標大分子是通過化學鍵連接，因此對目的生物大分子的結合上比較牢固、易與運載，具有重要的發展前景。
文檔編號A61K38/17GK102370988SQ201110003490
公開日2012年3月14日 申請日期2011年1月10日 優先權日2011年1月10日
發明者安學勤, 張翼, 林南靜, 鄭文云, 陳海龍, 馬興元 申請人:華東理工大學