腫瘤細胞選擇性穿膜肽的應用的制作方法

專利名稱：腫瘤細胞選擇性穿膜肽的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于穿膜肽，特別涉及腫瘤細胞選擇性穿膜肽及其應用。
背景技術：
近些年來，一些具有細胞膜穿透能力的多肽，如TAT、MPG、PEP-U penetratin、寡聚精氨酸等逐漸成為生物醫藥領域研究的焦點。這些帶正電荷的多肽序列可以穿過細胞膜而不破壞細胞膜的結構。這些天然或人工合成的多肽具有水溶性、低裂解性，并且能夠通過非吞噬作用進入各種細胞，故稱之為穿膜肽(cell-permeable peptides, CPP)，因穿膜肽最早發現于全鏈蛋白質的跨膜轉運，故又稱之為蛋白轉導域(protein transduction domain, PTD)。雖然穿膜肽的穿膜機制目前尚不完全清楚，但它們對生物大分子的轉運效率很高且不耗能。這些細胞穿膜肽均為帶有正電荷的長短不等的多肽片段，其中富含精氨酸等堿性氨基酸殘基。利用這一特性，各種新型穿膜肽被設計和合成出來，而且人工合成的 octaarginine等穿膜肽穿膜效率遠高于天然存在的穿膜肽。穿膜肽一般含有11 30個氨基酸殘基，可以分為三類陽離子型穿膜肽諸如TAT peptide和octaarginine ；兩親性陽離子肽諸如penetratin和PEP-I ；疏水性肽諸如MTS等。穿膜肽可以通過共價鍵或非共價鍵偶合等方式攜帶各種生物大分子透過細胞膜，已經實驗證實的生物大分子有基因、多月太、蛋白質、納米粒禾口月旨質體等。(Lain Prochiantz Protein and peptide transduction, twenty years later a happy birthday[J]. Adv Drug Deliv Rev,2008 Mar 1 ；60(4-5) 448-51.)。雖然普通的穿膜肽具有以上的諸多優勢，但當其協助抗腫瘤藥物或其抗腫瘤藥物的載體進入細胞時，它們不能夠對普通細胞和腫瘤細胞加以區分，不能夠有選擇地發揮穿膜作用，因此會導致抗腫瘤藥物藥效和毒副作用同時得到加強，給患者帶來更大的痛苦。因此，構建一種對腫瘤組織具有高度選擇性，并且對正常組織具有高度安全性的新型腫瘤細胞選擇性穿膜肽為臨床所急需。

發明內容
發明目的本發明的目的旨在提供腫瘤細胞選擇性穿膜肽及其用途。技術方案腫瘤細胞選擇性穿膜肽，其含有5-12個連續的精氨酸殘基組成的堿性氨基酸簇， 其特征在于所述堿性氨基酸簇的C端或N端連接有3個組氨酸殘基。其多肽序列包括 RRRRRHHH (R5H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH (R7H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH(R8H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRHHH(R9H3，R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)。腫瘤細胞選擇性穿膜肽的應用，其特征在于是制備含有所述穿膜肽的藥物組合物。所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽的應用，其特征在于所述的藥物組合物中藥物為紫杉醇、多西紫杉醇、放線菌素D、多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、長春新堿、長春瑞濱、順鉬、 奧沙利鉬、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巰嘌呤、阿糖胞苷、脫氧氟尿苷、依托泊苷、替尼泊苷、喜樹堿、羥基喜樹堿、拓撲替康、伊立替康、米托蒽醌、環磷酰胺、異環磷酰胺、絲裂霉素C、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、吉西他濱、卡培他濱、地西他濱、安西他濱、順鉬、博來霉素、平陽霉素、藤黃酸、新藤黃酸以及這些藥物的各種藥用鹽。所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽的應用，其特征在于含有所述腫瘤細胞選擇性穿膜肽的藥物組合物的各種制劑。有益成果本發明所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽，具有細胞膜穿透能力，且能夠對腫瘤細胞和正常組織細胞加以區分，能夠高效地穿過腫瘤細胞膜而對正常組織細胞膜基本不穿透； 本發明的創新精要之處即在于此，由精氨酸殘基和組氨酸殘基所組成的多肽序列在不同的 PH環境下所帶的電荷不同。正常組織細胞通常處在pH7. 4的環境中，而腫瘤組織細胞其pH 一般偏酸性，為5 6. 5，帶有本發明氨基酸序列的穿膜肽在正常pH環境下，僅帶有少量正電荷，無法與細胞表面高度結合而穿膜；而當到達腫瘤組織細胞表面時由于其偏酸性的環境使得組氨酸和精氨酸協同表現出帶有大量正電荷，從而能夠高效地與帶負電荷的細胞表面相結合，體現出較強的穿透腫瘤細胞膜的作用。本發明所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽對于腫瘤細胞膜的親和力以及對藥物和納米藥物載體的運載能力已經由體內和體外實驗所證明。


圖1是10 μ mol/L的穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3)進入人類急性白血病細胞株HL60 的熒光強度；圖2是10 μ mol/L的穿膜肽RRRRRRRRHHH (R8H3)進入人類乳腺癌細胞株MCF-7的熒光強度；圖3是不同濃度的游離鹽酸多柔比星、未修飾的鹽酸多柔比星磷脂復合物與腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的鹽酸多柔比星磷脂復合物對人卵巢癌細胞株SK0V3的抑制率實驗結果。
具體實施例方式下列實施例中的R為精氨酸，H為組氨酸實施例1以RRRRRHffiKR5H3，R在C端和N端)為例，說明采用固相合成多肽的方法。在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入IgRinkamide-MBHA 樹脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入 1. 44g(2. 22mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃 _5_ 磺酰基)、0· 46g(2. 22mmol) 二環己基碳二亞胺和0. 30g(2. 22mmol) HOBt (1-羥基苯并三唑)和20mLDMF,室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸已聯接于樹脂上。后面接著聯接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，反應步驟重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Rnoc 保護，氨基酸依次為Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) _0H。最后樹脂用甲醇洗第三次，真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50mL圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRHHH粗肽。將IOOmg上述的RRRRRHHH粗肽溶于2mL純水中，用制備用反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得RRRRRHHH純肽。純肽的質譜表明，其分子量為 1336，與計算值相符。RRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制備方法和過程獲取。實施例2以RRRRRRHffiKR6H3，R在C端和N端)為例，說明采用固相合成多肽的方法。在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入1. 13gRinkamide-MBHA 樹脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入 1. 63g(2. 51mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0· 52g(2. 51mmol) 二環己基碳二亞胺和0. 34g (2. 51mmol) HOBt (1-羥基苯并三唑)和 20mLDMF,室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸己聯接于樹脂上。后面接著聯接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，反應步驟重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保護，氨基酸依次為Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg(Pbf)-0H> Fmoc-Arg(Pbf)-0H> Fmoc-His(Trt)-0H> Fmoc-His(Trt)-OH^ Fmoc-His (Trt)-0H。最后樹脂用甲醇洗第三次，真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50mL圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRHHH粗肽。將IOOmg上述的RRRRRRHHH粗肽溶于2mL純水中，用制備用反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得RRRRRRHHH純肽。純肽的質譜表明，其分子量為1510，與計算值相符。RRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制備方法和過程獲取。實施例3以RRRRRRRHffiKR7H3，R在C端和N端)為例，說明采用固相合成多肽的方法。
在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入1. 26gRinkamide-MBHA 樹脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入
1.82g(2. 80mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0· 58g(2. 80mmol) 二環己基碳二亞胺和0. 38g(2. 80mmol)H0Bt (1-羥基苯并三唑)和 20mLDMF,室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸已聯接于樹脂上。后面接著聯接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，反應步驟重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保護，氨基酸依次為Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-0H、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -0H。最后樹脂用甲醇洗第三次，真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50mL圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRHHH粗肽。將IOOmg上述的RRRRRRRHHH粗肽溶于2mL純水中，用制備用反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得RRRRRRRHHH純肽。純肽的質譜表明，其分子量為1685，與計算值相符。RRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制備方法和過程獲取。實施例4以RRRRRRRRHffiKR8H3，R在C端和N端)為例，說明采用固相合成多肽的方法。在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入1. 39gRinkamide-MBHA 樹脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入
2.OOg (3. 09mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0. 64g(3. 09mmol) 二環己基碳二亞胺和0. 42g (3. 09mmol) HOBt (1-羥基苯并三唑)和 20mLDMF,室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸已聯接于樹脂上。后面接著聯接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，反應步驟重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Rnoc 保護，氨基酸依次為 Tmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-0H, Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -0H。最后樹脂用甲醇洗第三次,真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50mL圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRHHH粗肽。將IOOmg上述的RRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL純水中，用制備用反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得RRRRRRRRHHH純肽。純肽的質譜表明，其分子量為1859，與計算值相符。RRRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制備方法和過程獲取。實施例5以RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端和N端)為例，說明采用固相合成多肽的方法。在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入1. 52gRinkamide-MBHA 樹脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入 2. 19g(3. 38mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃 ~5~ 磺酰基)、0· 70g(3. 38mmol) 二環己基碳二亞胺和0. 46g(3. 38mmol) HOBt (1-羥基苯并三唑)和 20mLDMF,室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸已聯接于樹脂上。后面接著聯接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，反應步驟重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Rnoc 保護，氨基酸依次為Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H> Fmoc-Arg(Pbf)-0H> Fmoc-Arg (Pbf)-0H> Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) _0H。最后樹脂用甲醇洗第三次，真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50mL圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRRHHH粗肽。將IOOmg上述的RRRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL純水中，用制備用反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得RRRRRRRRRHHH純肽。純肽的質譜表明，其分子量為2033，與計算值相符。RRRRRRRRRHHH (R在N端)可以采取相同的制備方法和過程獲取。實施例6以RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在C端和N端)為例，說明采用固相合成多肽的方法。在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入1. 65gRinkamide-MBHA 樹脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入 2. 38g(3. 67mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)、0· 76g(3. 67mmol) 二環己基碳二亞胺和0. 50g (3. 67mmol) HOBt (1-羥基苯并三唑)和 20mLDMF,室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸已聯接于樹脂上。后面接著聯接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，反應步驟重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保護，氨基酸依次為Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH> Fmoc-Arg(Pbf)-OH>Fmoc-His(Trt)-OH>Fmoc-His(Trt)-OH^ Fmoc-His (Trt) -0H。最后樹脂用甲醇洗第三次，真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50mL圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν))，室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRRRHHH粗肽。將IOOmg上述的RRRRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL純水中，用制備用反相HPLC純化，收集保留主峰，收集液經旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得RRRRRRRRRRHHH純肽。純肽的質譜表明， 其分子量為2207，與計算值相符。RRRRRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制備方法和過程獲取。實施例7以RRRRRRRRRRRHHH(RnH3，R在C端和N端)為例，說明采用固相合成多肽的方法。在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入1. 78gRinkamide-MBHA 樹脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入 2. 57g(3. 96mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)、0. 82g(3. 96mmol) 二環己基碳二亞胺和0. 53g(3. 96mmol) HOBt (1-羥基苯并三唑)和 20mLDMF,室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸已聯接于樹脂上。后面接著聯接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，反應步驟重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保護，氨基酸依次為Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-0H、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -0H。最后樹脂用甲醇洗第三次，真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50mL圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRRRRHHH粗肽。將IOOmg上述的RRRRRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL純水中，用制備用反相HPLC純化， 收集保留主峰，收集液經旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得RRRRRRRRRRRHHH純肽。純肽的質譜表明，其分子量為2382，與計算值相符。RRRRRRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制備方法和過程獲取。實施例8
以RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R在C端和N端)為例，說明采用固相合成多肽的方法。在50mL側面帶支管、支管帶有砂板濾芯的圓底燒瓶內加入1. 9IgRinkamide-MBHA 樹脂(0. 74mmol/g)，加20mLDMF溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑。然后加入20mL 20%哌啶 /DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入 2. 75g(4. 25mmol) Fmoc-Arg (Pbf) -OH(Pbf 為 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)、0. 88g(4. 25mmol) 二環己基碳二亞胺和0. 57g(4. 25mmol) HOBt (1-羥基苯并三唑)和 20mLDMF,室溫下攪拌進行縮合反應。反應2小時后取少量樹脂進行茚三酮顯色反應，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的(保護的)氨基酸已聯接于樹脂上。后面接著聯接有C端起的第二個至最后一個(保護的)氨基酸，反應步驟重復上面操作，即從用20%哌啶/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗后用DMF洗滌止。如果茚三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有氨基酸的氨基都用 Fmoc 保護，氨基酸依次為Rnoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-0H、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-His (Trt) -0H。最后樹脂用甲醇洗第三次,真空干燥。將上述已接肽的樹脂加入到50mL圓底燒瓶中，加入15mL試劑K (TFA/苯甲硫醚/ EDT/苯酚/水=87. 5/5. 5/2. 5/2. 5/2. 5 (ν/ν)),室溫下攪拌3小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合并濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉淀多肽，放入冰箱過夜。離心，除去乙醚，真空干燥，得到RRRRRRRRRRRRHHH粗肽。將IOOmg上述的RRRRRRRRRRRRHHH粗肽溶于2mL純水中，用制備用反相HPLC純化， 收集保留主峰，收集液經旋蒸濃縮，然后冷凍干燥得RRRRRRRRRRRRHHH純肽。純肽的質譜表明，其分子量為2556，與計算值相符。RRRRRRRRRRRRHHH(R在N端)可以采取相同的制備方法和過程獲取。實施例9以本實驗室合成的一系列16種多肽RRRRRHffiKR5H3，R在C端或N端)、 RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH (R7H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH (R8H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRHHH (R9H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)為例說明本發明腫瘤細胞選擇性穿膜肽對2種常見的人類腫瘤細胞的穿膜活性。16種腫瘤細胞選擇性穿膜肽N端標記FITC熒光素。RRRRRRRR(R8)購自AnaSpec公司N端標記 FITC熒光素。取人類急性白血病細胞株HL60，離心后加入DMEM完全培養基，吹打成單細胞懸液-M 6孔板，每孔中加入0. 9mL細胞懸液，然后加入0. ImL, 100 μ mol/L的FITC標記的腫瘤細胞選擇性穿膜肽或R8培養基溶液，孵育(37°C ,5% CO2) 1小時后，用2mL的PBS溶液離心洗3次，重懸于ImL的PBS溶液中，用于流式細胞儀定量分析熒光強度。取對數生長期的人類乳腺癌細胞株MCF-7，胰酶消化，離心，加入DMEM完全培養基，吹打成單細胞懸液；取出2mL細胞懸液并用IOmL DMEM完全培養基稀釋。取6孔板每孔加入2mL細胞懸液，CO2培養箱(37°C )孵育至細胞融合度達到約80%。棄去上層培養液，加入ImL 10 μ mol/L的FITC標記的腫瘤細胞選擇性穿膜肽或R8培養基溶液，孵育(37°C， 5% CO2) 1小時。棄去上層穿膜肽溶液，用冷PBS溶液ImL洗2次，加入ImL胰酶消化lmin， 每孔再加入ImL DMEM完全培養基終止消化，吹打每孔細胞成單細胞懸液，然后轉移至IOmL 離心管中，離心1000rpm，5min。棄去上層液體，加入2mL PBS溶液重懸細胞，用于流式細胞儀定量分析熒光強度。熒光強度數據分析結果如圖1和圖2所示。結果表明，本實驗室合成的16種腫瘤細胞選擇性穿膜肽對于人類急性白血病細胞株HL60和人類乳腺癌細胞株MCF-7均能夠很好地發揮穿膜作用，且效果明顯強于經典穿膜肽RRRRRRRR(R8)。腫瘤細胞選擇性穿膜肽 R5H3、R6H3、R7H3、R8H3、Ri3H3、R10H3、R11H3、R12H3各自的兩種不同序列(R在C端或N端)具有相同的穿膜活性。實施例10以本實驗室合成的一系列16種多肽RRRRRHffiKR5H3，R在C端或N端)、 RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH (R7H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH (R8H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRHHH (R9H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端) 為例說明本發明腫瘤細胞選擇性穿膜肽對相同組織的正常細胞和腫瘤細胞的選擇性穿膜活性。16種腫瘤細胞選擇性穿膜肽N端標記FITC熒光素。RRRRRRRR(R8)購自AnaSpec公司N端均標記FITC熒光素。將人類肝癌細胞株H印G-2培養于DMEM培養基中，含10%的胎牛血清，各100mg/L 的氨芐青霉素和鏈霉素。在37°C，5% CO2，完全飽和濕度下正常培養，三天傳代一次。取對數生長期的人類肝癌細胞株H印G-2，胰酶消化，離心，加入DMEM完全培養基， 吹打成單細胞懸液；取出2mL細胞懸液并用IOmL DMEM完全培養基稀釋。取6孔培養板，加入蓋玻片，接種人類乳腺癌細胞株MCF-7，密度為2 X IO5個/孔，培養過夜，待細胞貼壁后， 更換新鮮培養液，30min后，去掉培養液。每孔加入含有一定濃度的熒光標記的腫瘤細胞選擇性穿膜肽或R8-FITC培養液。培養箱孵育一定時間后，去掉培養基，細胞再用PBS洗3次， 用3. 7%的多聚甲醛固定液(PBS配制)在室溫下固定細胞5min，再用PBS洗3次。用50% 的甘油(PBS配制)封片后，在熒光顯微鏡下觀察。采用Image-Pro Plus (Version 4. 5 for Windows )來分析細胞熒光強度。結果1 :RRRRRHHH(R5H3，R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH(R7H3，R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH(R8H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRHHH(R9H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)均能有效進入細胞；其中尤以RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端)、RRRRRRRRHHH(R8H3，R在N端)進入細胞最多；其次是RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端或N端)、RRRRRRRHHH(R7H3，R在C端或 N 端)，RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRHHH (R5H3, R在C端或N端)；而RRRRRRRR(R8)進入細胞的最少。另將正常人類肝細胞株HL-7702培養于RPMI1640培養基中，含20%的胎牛血清， 各100mg/L的氨芐青霉素和鏈霉素。在37°C，5% CO2，完全飽和濕度下正常培養，每三天傳代一次。取對數生長期的正常人類肝細胞株HL-7702，胰酶消化，離心，加入RPMI1640培養基，吹打成單細胞懸液；取出2mL細胞懸液并用IOmL RPMI1640培養基稀釋。取6孔培養板， 加入蓋玻片，接種正常人類肝細胞株HL-7702，密度為2 X IO5個/孔，培養過夜，待細胞貼壁后，更換新鮮培養液，30min后，去掉培養液。每孔加入含有一定濃度的熒光標記的腫瘤細胞選擇性穿膜肽或R8-FITC培養液。培養箱孵育一定時間后，去掉培養基，細胞再用PBS洗3 次，用3. 7%的多聚甲醛固定液(PBS配制)在室溫下固定細胞5min，再用PBS洗3次。用 50%的甘油(PBS配制)封片后，在熒光顯微鏡下觀察。采用Image-ProPlus (Version 4.5 for Windows )來分析細胞熒光強度。結果2 :RRRRRHHH (R5H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRHHH(R7H3, R在 C 端或 N端)、RRRRRRRRHHH(I 8H3，R在 C 端或 N端)、RRRRRRRRRHHH(I 9H3， R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHffiKR11H3, R 在 C端或N端)、RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在C端或N端)均不能有效地進入細胞；然而， RRRRRRRR(R8)可以進入細胞。綜合以上結果可知，本發明所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽能夠有效地穿過腫瘤細胞膜而不能有效地穿過正常細胞的細胞膜，表現出較高的穿膜效率和較高的選擇性。其他腫瘤細胞系和正常細胞系的試驗結果都得出了相似的結果，在此不一一列舉。實施例11以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRHffiKR5H3，R在C端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRHHH (R5H3，R在C端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C 孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在C端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在C端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例12以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在N端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRHHH (R5H3，R在N端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C 孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在N端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRHHH(R5H3，R在N端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例13以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRHHH(R6H3，R在C端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在C端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C 孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRHHH(R6H3，R在C端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在C端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例14以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在N端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在N端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C 孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRHHH(R6H3，R在N端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRHHH (R6H3，R在N端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例15以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRHffiKR7H3，R在C端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRHHH (R7H3，R在C端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C 孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRHHH(R7H3，R在C端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRHHH (R7H3，R在C端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例16以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRHHH(R7H3，R在N端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRHHH (R7H3，R在N端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C 孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRHHH(R7H3，R在N端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRHHH (R7H3，R在N端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷
13脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例17以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在 4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRHHH (R8H3，R在C端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例18以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在N端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在N端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在 4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRHHH(R8H3，R在N端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRHHH (R8H3，R在N端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例19以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。
依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在 4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在C端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRHHHd^^，R在C端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M 小時滲漏率小于3%。實施例20以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在N端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRHffiKR9H3，R在N端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在 40C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRHHH(R9H3，R在N端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRHHH (R9H3，R在N端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M 小時滲漏率小于3%。實施例21以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(R1QH3，R在C端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R在C端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在 4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在C端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在C端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置對小時滲漏率小于3%。實施例22以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(R1QH3，R在N端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R在N端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在 4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在N端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRHHH(RltlH3, R在N端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置對小時滲漏率小于3%。實施例23以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在C端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R在C端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在C端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明， 腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在C端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例M以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在N端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R在N端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在N端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明， 腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRHHH(R11H3, R在N端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例25以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在C端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R在C端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在C端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明， 腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在C端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%， 常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例沈
以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在N端)與紫杉醇組成的藥物組合物來說明其應用方法。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R在N端)，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在N端)修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明， 腫瘤細胞選擇性穿膜肽RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3, R在N端)對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%， 常溫放置M小時滲漏率小于3%。實施例27以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽與紫杉醇組成的藥物組合物來說明這一系列穿膜肽對抗腫瘤藥物體外抑瘤效果的促進和增強作用。依處方量稱取注射用大豆磷脂和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。IOmL純水常溫手搖水合，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。然后3000rpm離心以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各一次即可制得紫杉醇磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實紫杉醇和磷脂有效地進行了結合。精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到制得的紫杉醇磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C孵育4小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的紫杉醇磷脂復合物。對修飾前后紫杉醇磷脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽對紫杉醇磷脂復合物的修飾沒有對普通紫杉醇磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，紫杉醇和磷脂的結合率大于97%，常溫放置M小時滲漏率小于3%。取人乳腺癌細胞株MCF-7培養于DMEM (高糖)培養基中，含10%的胎牛血清，各 100mg/L的氨芐青霉素和鏈霉素。在37°C，5% C02，完全飽和濕度下正常培養，隔天傳代一次。選取處于對數生長期的人乳腺癌細胞株MCF-7，胰酶消化，并用培養基稀釋配成細胞懸液。將細胞接種于96孔板中，每孔約含IXlO4個細胞，在37°C，5% CO2環境中培養對小時，棄去培養液，以不含血清的培養基分別稀釋未修飾的普通紫杉醇磷脂復合物和腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的紫杉醇磷脂復合物濃度至1、4、8、10、15、20、30、50、100nmol/L,每個濃度組設置3個復孔，每孔200 μ L。在37°C，5% CO2環境中培養72小時。然后用4°C的三氯醋酸固定，將96孔板于4°C放置1小時，雙蒸水洗5次除去三氯醋酸、培養液、代謝產物及血清，空氣干燥后加入4g/L磺基羅丹明B (SRB)染色15min，再用醋酸洗5遍。干燥后， 加入lOmmol/LTris液150 μ L溶解，使用酶標儀于波長540nm處測定吸收值A，計算半數抑制濃度(IC5tl)。采用羅丹明B法考察兩種紫杉醇磷脂復合物的細胞毒性。對于人乳腺癌細胞株MCF-7，未修飾的紫杉醇磷脂復合物的IC5tl和腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的紫杉醇磷脂復合物的IC5tl如表一所示，結果表明，與未修飾的紫杉醇磷脂復合物相比，腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的紫杉醇磷脂復合物的細胞毒作用明顯增強(P < 0. 05)。脂質材料及其他輔料均無細胞毒性，對測定不形成干擾。腫瘤細胞選擇性穿膜肽R5H3、R6H3> R7H3> R8H3> R9H3> R10H3> RnH3> R12H3各自的兩種不同序列(R在C端或N端)所修飾的紫杉醇磷脂復合物對人乳腺癌細胞株MCF-7的細胞毒作用之間不存在差異。表一各制劑對人乳腺癌細胞株MCF-7的半數抑制濃度(IC50)
制劑IC50 (nmol/L)
未修飾的普通紫杉醇磷脂復合物49. 6 士 4. 7
R5H3修飾的紫杉醇磷脂復合物27. 7 士 2. 8
R6H3修飾的紫杉醇磷脂復合物24. 3 士 2. 4
R7H3修飾的紫杉醇磷脂復合物22. 4 士 3. 1
R8H3修飾的紫杉醇磷脂復合物20. 8 士 2. 1
R9H3修飾的紫杉醇磷脂復合物23. 6 士 2. 5
R10H3修飾的紫杉醇磷脂復合物26. 1 士 3. 2
R11H3修飾的紫杉醇磷脂復合物30. 2 士 4. 6
R12H3修飾的紫杉醇磷脂復合物32. 3 士 4. 1
實施例28
以本發明所述及的腫瘤細胞選擇性穿膜肽與鹽酸多柔比星組成的藥物組合物來說明這--系列穿膜肽對抗腫瘤藥物在體外抑瘤 效果的促進和增強作用。
依處方量稱取注射用蛋黃卵磷脂和鹽酸多柔比星于圓底燒瓶中，加入一定量四氫
呋喃使蛋黃卵磷脂充分溶解，并加入玻璃珠若干。避光條件下，置于水浴恒溫磁力攪拌中于 40°C反應3小時。然后減壓旋蒸1小時，揮除有機溶劑形成藥脂薄膜。結束后繼續抽真空過夜，以除去痕量有機溶劑。加入磷酸鹽緩沖溶液(PH6. 5)常溫手搖水化藥脂薄膜，至茄型瓶壁洗凈為止，樣品呈均勻的乳濁液。冰水浴中探頭超聲以減小粒徑。離心3000rpm以除去探頭超聲可能掉落的金屬屑。取上清液分別過0. 45 μ m，0. 22 μ m聚碳酸酯濾膜各5次進行整粒即可制得鹽酸多柔比星磷脂復合物。紫外光譜、紅紅外光譜和差示掃描量熱法證實鹽酸多柔比星和蛋黃卵磷脂有效地進行了結合。 精密稱取IOmg腫瘤細胞選擇性穿膜肽，并將其充分溶解于2mL的雙蒸水中。于常溫下，將此溶液緩緩滴加到以上制得的鹽酸多柔比星磷脂復合物分散體系中，滴加過程保持不斷地磁力攪拌。滴加結束后繼續攪拌30min，然后將此分散體系在4°C孵育8小時即可制得腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的鹽酸多柔比星磷脂復合物。對修飾前后鹽酸多柔比星磷
19脂復合物的結合率和穩定性的考察結果表明，腫瘤細胞選擇性穿膜肽對鹽酸多柔比星磷脂復合物的修飾沒有對普通鹽酸多柔比星磷脂復合物的理化性質產生顯著影響，結合率大于 90%，常溫放置M小時滲漏率小于4%。 取人卵巢癌細胞株SK0V3，在含有10%胎牛血清的DMEN培養液，5% C02，37°C完全濕度下正常培養。取對數生長期的細胞，胰酶消化后用DMEM培養液稀釋，按每孔密度為 2X IO5個/孔，培養過夜，待細胞貼壁后，于M孔板中加入不同量游離鹽酸多柔比星、未修飾鹽酸多柔比星磷脂復合物和腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的鹽酸多柔比星磷脂復合物各 lmL，并以培養基作為空白對照組。鹽酸多柔比星濃度分別為10、2、0. 4,0. 08和0. 016 μ g/ mL。每個濃度做3個復孔。孵育48小時后，每個復孔加入MTT溶液100 yL(5mg/mL) ,5% CO2, 37°C條件下繼續培養4小時，棄去上層液體，再在每個復孔中加入二甲基亞砜600 μ L，振蕩 IOmin后在酶標儀上測定570nm處各孔的吸光度，取平均值，以培養基為空白對照，計算細胞抑制率。細胞抑制率(％) = [ 1 -A570nm(samp 1 e) /A570nm(contro 1) ] X 100%, A570nm(samp 1 e) 為加入藥物后細胞的吸光度，A57tlnm(control)為空白對照細胞的吸光度。在10、2、0. 4、0. 08 和0. 016μ g/mL濃度組，腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的鹽酸多柔比星磷脂復合物、未修飾的鹽酸多柔比星磷脂復合物和游離鹽酸多柔比星對人卵巢癌細胞株SK0V3的抑制率如圖 3所示。由結果可知，腫瘤細胞選擇性穿膜肽修飾的鹽酸多柔比星磷脂復合物對人卵巢癌細胞株I0V3的抑制率明顯高于普通鹽酸多柔比星磷脂復合物和游離鹽酸多柔比星(P < 0. 05)。腫瘤細胞選擇性穿膜肽 I 5H3、R6H3> R7H3> R8H3> R9H3>R10H3> R11H3^R12H3 各自的兩種不同序列(R在C端或N端)所修飾的鹽酸多柔比星磷脂復合物對人卵巢癌細胞株SK0V3的抑制率之間不存在差異。
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權利要求
1.腫瘤細胞選擇性穿膜肽，其含有5-12個連續的精氨酸殘基組成的堿性氨基酸簇， 其特征在于所述堿性氨基酸簇的C端或N端還有3個組氨酸殘基。其多肽序列包括 RRRRRHHH (R5H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRHHH (R6H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRHHH (R7H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRHHH(R8H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRHHH(R9H3，R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRHHH (R10H3, R 在 C 端或 N 端)、RRRRRRRRRRRHHH (R11H3, R 在 C 端或 N 端)、 RRRRRRRRRRRRHHH (R12H3, R 在 C 端或 N 端)。
2.根據權利要求1所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽的應用，其特征在于是制備含有所述穿膜肽的藥物組合物。
3.根據權利要求2所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽的應用，其特征在于所述的藥物組合物中藥物為紫杉醇、多西紫杉醇、放線菌素D、多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、長春新堿、長春瑞濱、順鉬、奧沙利鉬、甲氨蝶呤、氟尿嘧唆、巰嘌呤、阿糖胞苷、脫氧氟尿苷、依托泊苷、替尼泊苷、喜樹堿、羥基喜樹堿、拓撲替康、伊立替康、米托蒽醌、環磷酰胺、異環磷酰胺、絲裂霉素C、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、吉西他濱、卡培他濱、 地西他濱、安西他濱、順鉬、博來霉素、平陽霉素、藤黃酸、新藤黃酸以及這些藥物的各種藥用ik ο
4.根據權利要求2所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽的應用，其特征在于含有所述腫瘤細胞選擇性穿膜肽的藥物組合物的各種制劑。
全文摘要
本發明屬于穿膜肽，特別涉及腫瘤細胞選擇性穿膜肽及其應用。腫瘤細胞選擇性穿膜肽，序列中含有5-12個連續的精氨酸殘基組成的堿性氨基酸簇，其特征在于所述堿性氨基酸簇的C端或N端連接有3個組氨酸殘基。本發明所述的腫瘤細胞選擇性穿膜肽，具有細胞膜穿透能力，且能夠對腫瘤細胞和正常組織細胞加以區分，能夠高效地穿過腫瘤細胞膜而對正常組織細胞膜基本不穿透。
文檔編號A61P35/00GK102174078SQ20111000356
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月10日 優先權日2011年1月10日
發明者呂慧俠, 周建平, 姜天玥, 孫博, 張振海, 張銀龍 申請人:中國藥科大學