專利名稱：一種自銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質的方法
技術領域：
本發明型涉及從銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質的的方法。
背景技術：
銀杏(Ginkgo bilobal)又名白果樹，屬裸子植物，樹齡可達千年以上，是古代二疊 紀孑遺植物，有植物界中“活化石”之稱，是現存種子植物中最古老的孑遺植物。銀杏樹具 有適應性強、繁殖能力強等多方面的特點。銀杏果的醫療及營養保健作用早已被人們所知，而對銀杏葉的開發利用要晚得 多。德國和法國是世界上最早從事銀杏葉產品開發的國家，他們在七十年代中期，首先開發 了治療心血管病的銀杏葉片，此后，其他國家相繼致力于銀杏制品的開發。近代科學表明，銀杏葉的化學成分十分復雜，迄今為止已發現170多種化合物。其 中最重要的活性成分為黃酮類化合物和萜內酯類，其他的還包括有機酸類、氨基酸、糖類、 醇類、微量元素及維生素、葉綠素、生物堿類等。現代研究表明銀杏葉活性物質中黃酮類含 量最高，為2. 5% 5. 91%。銀杏葉提取物有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子引起的 血小板聚集和血栓形成作用，具有降血脂、增強中樞神經系統功能、調節神經遞質和激素水 平、改善血液流變狀態、抗炎、抗過敏作用。具有促進視網膜神經細胞增生，顯著升高視網膜 神經細胞的膜電位，對培養的視網膜神經細胞有良好的保護作用。隨著對銀杏葉提取物的 深入研究，其各種制劑已廣泛應用于心、腦血管疾病。活性物質中總黃酮的含量直接決定著銀杏葉的藥用價值，要想獲得較多黃酮，關 鍵是改進銀杏葉的提取工藝。只有提高活性物質的得率，才能為下一步獲取精制銀杏黃酮 鋪平道路。傳統的提取方法主要有水浸提法，醇提取法等，采用傳統的生產工藝很難獲得較 高質量的銀杏葉提取物。
發明內容
本發明針對現有銀杏葉提取工藝得率不高、雜質較多等方面的缺陷，旨在提供一 種新的提取方法，所要解決的技術問題是提高黃酮在活性物質中的含量。本發明的技術方案以銀杏葉為原料，包括粉碎、預處理、提取、分離和純化，與現有 技術的區別是粉碎后的銀杏葉經預處理后再進行提取，所述的預處理是銀杏葉粉末置于PH 值8-10的氫氧化鈣溶液中微波處理l-3min，銀杏葉粉末(質量)與堿液(體積)的料液 比為1 3-5，微波處理結束后加入等體積濃度65-95vt% (體積百分比，下同)乙醇溶液， 軟包裝并密封后于200-300ΜΙ^下處理15-25min得到預處理液；卸壓、拆封后對預處理液用 濃度65-95vt%乙醇溶液于pH8-ll條件下加熱回流提取至少兩次，過濾分離后合并濾液， 調濾液PH值至7，再離心分離，得到上清液，向上清液中加入0. 3-0. 5wt% (質量百分比，下 同)抗氧化劑維生素E，攪拌均勻后得到上液樣；所述的純化就是對上液樣用AB-8型大孔 吸附樹脂振蕩吸附分離純化，即將AB-8型大孔吸附樹脂浸泡于上液樣中振蕩吸附不少于 12h，吸附后分離，將樹脂浸入60-70vt%乙醇溶液中振蕩解析不少于ld，分離得到解析液。
解析液減壓脫溶回收乙醇，進一步濃縮成稠膏，真空冷凍干燥得到銀杏葉高黃酮 含量的活性物質。具體操作步驟如下(1)銀杏葉粉末制備將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預處理取粉碎好的銀杏葉粉末，加入一定量的pH為8-10的氫氧化鈣溶液，置于微波功 率800W下處理1. 0-3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積 65-95vt%乙醇溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于200-300Mpa高壓下處理15_25min 得到預處理液后取出，靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質的提取向銀杏葉預處理液加入65-95vt%乙醇溶液，液料比(乙醇溶液體積mL 銀杏葉粉 末質量g)為20 1，調pH為8-11，回流60min，靜置，過濾，殘渣加入65-95vt%乙醇溶液， 調pH值8-11，加熱回流提取60min，靜置，過濾，合并濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調節粗提液的pH至7，10000r/min離心10_20min得到上清液；(5)上清液處理上清液中添加0. 3-0. 5wt% (以上清液質量計)抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6) AB-8型大孔吸附樹脂吸附DAB-8型大孔吸附樹脂預處理稱取10_20g AB-8型大孔吸附樹脂用4_5倍 75vt%的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4_5倍4-8wt%堿和酸分別 處理30min。堿洗后水洗至pH 8_9;酸洗后水洗至pH 5_6。最后，將處理好的樹脂裝入容 器，用蒸餾水浸泡，得到預處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附移取銀杏葉上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時 振蕩吸附12h。3)振蕩解吸已吸附樹脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡震蕩ld，分離收集解吸液。(7)濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質成品。(8)黃酮含量的測定采用蘆丁絡合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。精確稱取干燥至恒重的蘆 丁(標準對照品)40mg置于IOOmL容量瓶中，加入75vt %乙醇溶液定容至IOOmL,即得蘆 丁標準溶液。分別取5、10、15、20、25mL蘆丁標準溶液用蒸餾水稀釋至50mL，準確吸取5mL 于IOmL試管中，各加入IOwt %亞硝酸鈉溶液0. 3mL，搖勻，放置6min ；加IOwt %硝酸鋁溶 液0. 3mL，搖勻，放置6min ；加氫氧化鈉溶液4mL，再用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置 15min。用蒸餾水作空白，在51 Onm處測定吸光度。準確稱取干燥的活性物質IOOmg置于IOOmL容量瓶中，在最優條件下測定銀杏葉 提取物吸光度，代入標準曲線方程中求出濾液中黃酮的濃度，然后計算出活性物質中總黃酮的含量。以銀杏葉計，活性物質提取率可達25%，活性物質中黃酮含量達22%。本發明運用堿性條件下微波-高壓聯合輔助提取并結合非極性AB-8型大孔樹脂 靜態飽和吸附-解析法從銀杏葉中提取活性物質的方法，微波促進了銀杏葉有效活性物質 從細胞中溶出，高壓促使細胞壁破裂，細胞內的提取物(活性物質)可以迅速溢出，與提取 劑本體(氫氧化鈣溶液)混合，從而大大提高提取率。提取的銀杏葉活性物質中黃酮含量 較高，本發明銀杏葉中總活性物質提取率高達25%，活性物質中黃酮含量高達22% ；AB-8 型大孔吸附樹脂對黃酮有良好的吸附-解析效果，吸附率可達80%以上，且成本較低，易再 生。
四
圖1是蘆丁標準曲線圖。
五具體實施例方式實施例1 (1)銀杏葉粉末制備將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預處理取粉碎的銀杏葉粉末5g，加入20mL pH為8的氫氧化鈣溶液，置于微波功率800W 下處理3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積90vt%乙醇 溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高壓下處理15min得到預處理液后取出，
靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質的提取向銀杏葉預處理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(體積mL 質量g)為20 1， 調PH為8，加熱回流60min，靜置，過濾，殘渣在上述條件下回流提取60min，靜置，過濾，合并 濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調節粗提液的pH值至7，10000r/min離心15min得到上清液。(5)上清液處理上層清液中添加0. 3wt%抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6) AB-8型大孔吸附樹脂吸附1) AB-8型大孔吸附樹脂預處理稱取10. OOOgAB-8型大孔吸附樹脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4倍6wt %堿和酸分別處理30min。 堿洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，將處理好的樹脂裝入容器，用蒸餾水浸泡， 得到預處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附移取上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時振蕩吸 附 12h ；3)振蕩解吸
5
已吸附樹脂用50mL65vt %的乙醇溶液浸泡靜置振蕩ld，收集解吸液。(7)、黃酮含量的測定采用蘆丁絡合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。(8)、濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質1. 1991g。活 性物質中黃酮含量19.5%。實施例2 (1)銀杏葉粉末制備將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預處理取粉碎的銀杏葉粉末5g，加入20mL pH為9的氫氧化鈣溶液，置于微波功率800W 下處理3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積90vt%乙醇 溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高壓下處理15min得到預處理液后取出，
靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質的提取向銀杏葉預處理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(體積mL 質量g)為20 1， 調PH為8，加熱回流60min，靜置，過濾，殘渣在上述條件下回流提取60min，靜置，過濾，合并 濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調節粗提液的pH值至7，10000r/min離心15min得到上清液。(5)上清液處理上層清液中添加0. 3wt%抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6)AB-8型大孔吸附樹脂吸附1) AB-8型大孔吸附樹脂預處理稱取10. 000gAB-8型大孔吸附樹脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4倍6wt %堿和酸分別處理30min。 堿洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，將處理好的樹脂裝入容器，用蒸餾水浸泡， 得到預處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附移取上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時振蕩吸 附 12h ；3)振蕩解吸已吸附樹脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡靜置振蕩ld，收集解吸液。(7)、黃酮含量的測定采用蘆丁絡合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。(8)、濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質1. 2506g。活 性物質中黃酮含量22. 1%。實施例3 (1)銀杏葉粉末制備
將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預處理取粉碎的銀杏葉粉末5g，加入20mL pH為10的氫氧化鈣溶液，置于微波功率800W 下處理3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積90vt%乙醇 溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高壓下處理15min得到預處理液后取出，
靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質的提取向銀杏葉預處理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(體積mL 質量g)為20 1， 調PH為8，加熱回流60min，靜置，過濾，殘渣在上述條件下回流提取60min，靜置，過濾，合并 濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調節粗提液的pH值至7，10000r/min離心15min得到上清液。(5)上清液處理上層清液中添加0. 3wt%抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6)AB-8型大孔吸附樹脂吸附1) AB-8型大孔吸附樹脂預處理稱取10. OOOgAB-8型大孔吸附樹脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4倍6wt %堿和酸分別處理30min。 堿洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，將處理好的樹脂裝入容器，用蒸餾水浸泡， 得到預處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附移取上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時振蕩吸 附 12h ；3)振蕩解吸已吸附樹脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡靜置振蕩ld，收集解吸液。(7)、黃酮含量的測定采用蘆丁絡合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。(8)、濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質1. 2101g。活 性物質中黃酮含量20. 1%。實施案例4 (1)銀杏葉粉末制備將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預處理取粉碎的銀杏葉粉末5g，加入20mL pH為10的氫氧化鈣溶液，置于微波功率800W 下處理3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積90vt%乙醇 溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于300MPa高壓下處理15min得到預處理液后取出，
靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質的提取向銀杏葉預處理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(體積mL 質量g)為20 1，調PH為8，加熱回流60min，靜置，過濾，殘渣在上述條件下回流提取60min，靜置，過濾，合并 濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調節粗提液的pH值至7，10000r/min離心15min得到上清液。(5)上清液處理上層清液中添加0.3wt%抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6)AB-8型大孔吸附樹脂吸附1) AB-8型大孔吸附樹脂預處理稱取10. 000gAB-8型大孔吸附樹脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4倍6wt %堿和酸分別處理30min。 堿洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，將處理好的樹脂裝入容器，用蒸餾水浸泡， 得到預處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附:移取上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時振蕩吸 附 12h ；3)振蕩解吸已吸附樹脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡靜置振蕩ld，收集解吸液。(7)、黃酮含量的測定采用蘆丁絡合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。(8)、濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質1. 1241g。活 性物質中黃酮含量18.7%。
權利要求
1. 一種自銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質的方法，以銀杏葉為原料，包括粉碎、預處 理、提取、分離和純化，其特征在于將銀杏葉粉末置于PH值8-10的氫氧化鈣溶液中微波處 理l-^iiin，銀杏葉粉末質量與氫氧化鈣溶液體積的料液比為1 3-5;微波處理后加入等 體積的65-95vt%乙醇溶液，軟包裝密封后于200-300MPa下處理15_25min得到預處理液； 預處理液用濃度65-95vt%乙醇溶液于pH8-ll條件下加熱回流至少兩次，合并濾液并調濾 液PH至7，再離心分離得到上清液；向上清液中加入0. 3-0. 5wt %維生素E攪拌均勻得到 上液樣；上液樣用AB-8型大孔吸附樹脂振蕩吸附不少于12小時，吸附后分離，將樹脂置于 60-70vt%乙醇溶液中振蕩解析不少于1天，分離得到解析液，解析液減壓濃縮成稠膏，將 稠膏真空冷凍干燥。
全文摘要
一種自銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質的方法，將銀杏葉粉末置于pH值8-10的氫氧化鈣溶液中微波處理1-3min，銀杏葉粉末質量與氫氧化鈣溶液體積的料液比為1∶3-5；微波處理后加入等體積的65-95vt％乙醇溶液，軟包裝密封后于200-300MPa下處理15-25min得到預處理液；預處理液用濃度65-95vt％乙醇溶液于pH8-11條件下加熱回流至少兩次，合并濾液并調濾液pH至7，再離心分離得到上清液；向上清液中加入0.3-0.5wt％維生素E攪拌均勻得到上液樣；上液樣用AB-8型大孔吸附樹脂吸附-解析，分離得到解析液，解析液經濃縮和真空冷凍干燥得到銀杏葉活性物質。活性物質得率高達25％，其中黃酮含量高達22％。
文檔編號A61K36/16GK102138945SQ20111008179
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者倪林, 葉明 申請人:合肥工業大學