專利名稱：聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白消解酶及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及聚合物修飾蛋白酶的技術領域，具體涉及用聚乙二醇(PEG)修飾沙雷菌蛋白消解酶的結合物及其制備方法和用途。
背景技術：
沙雷菌蛋白消解酶(Serratiop印tidase)是一種能夠消解動脈血管內壁硬化斑塊的生物活性酶。這種酶為蠶蛾羽化出繭時所用，是蠶幼蟲腸道中的共生菌粘質沙雷菌產生。歷經全球性三十多年的研究和臨床應用，沙雷菌蛋白消解酶的生物醫學功效已經得到證實，受到國際醫學界的青睞，被用于控制和治療與動脈血管粥樣硬化相關的多種慢性疾病。它能夠消解和清除人體內無生命活性的蛋白質、血液凝塊、組織囊腫和血管內壁的硬化斑，對人體正常功能無副作用。其突出的有效性還包括A)阻止誘發疼痛胺的產生；B)減輕炎癥，加速肌體組織的復原；C)稀釋外傷或炎癥產生的液體、抗浮腫、調節液體的疏散和水分滯留，恢復運動造成的組織損傷。該酶制劑在歐洲一些國家和日本被用于處方藥已有20多年。美國、加拿大等國家對這種天然化合物，將其歸類為功能性營養素。近幾年來，北美的抗衰老醫學和自然醫學界大力推薦和使用該酶制劑，用于消炎、止痛和動脈硬化等疾病的治療[Evaluation of Serratia peptidase in acute or chronic inflammation of otorhinolaryngology pathology: A multicenter, double-blind randomized trial versus placebo. J Int Med Res. 1990 (18) : 379-388]。在該酶制劑的臨床研究和應用中，著名的德國內科醫生 Hans A. Nieper (1928-1998)總結了他長期的臨床實踐，發現沙雷菌蛋白消解酶治療心腦血管疾病的明確療效。心腦血管疾病患者，每日3次、每次5毫克/2片沙雷菌蛋白消解酶，連續12-18個月，大多數患者的動脈血管硬化問題均能逆轉。他特別指出頸動脈或顱動脈血管硬化狹窄是產生腦部缺血和腦中風的重要原因。沙雷菌蛋白消解酶對打通頸部和顱內已經部分阻塞的動脈血管、清除硬化斑塊，有顯著效果。現行防治心腦血管疾病的方法往往著重于降血脂和活血化淤，或暫時性地擴張血管。這些方法雖能程度不等地控制疾病的惡化，卻無法清除動脈血管粥樣硬化斑塊，無助于逆轉疾病。沙雷菌蛋白消解酶能夠消解人體內無生命活性的蛋白質、血液凝塊、組織囊腫和血管內壁的硬化斑，且對人體正常功能無副作用。清除動脈血管內壁的硬化斑塊，是恢復血管內壁正常功能的前提和防止血栓阻塞血管的必要條件，也是逆轉由動脈血管硬化引起的高血壓和心腦血管疾病的根本性措施。同時，沙雷菌蛋白消解酶也能夠清除血栓形成因子一血液中的蛋白纖維、纖維蛋白原和血小板被異常激活后形成血栓凝塊，有助于血液流通和減少血管阻塞的機會。改善血液循環與防止血栓形成，對于降低心、腦血管疾病急性發作的機會至關重要。對于糖尿病患者來說，清除血液循環障礙，更是減少數種并發癥的關鍵。但是對于人體而言，沙雷菌蛋白酶屬于異源蛋白，所以在使用過程中具有蛋白質藥物所共同的特點，如存在免疫原性，半衰期短，穩定性差等。因此有必要采用蛋白質修飾技術以獲得低免疫原性的沙雷菌蛋白酶，從而改善該蛋白酶的藥物動力學特性；同時提高該蛋白酶對胃酸的耐受性，增加酶穩定性。 目前，研究人員采用了各種藥物傳遞技術來提高蛋白質藥物的療效，包括采用不同的給藥途徑(如口服，透皮)，不同的載體(如微球，脂質體，單克隆抗體)，不同高分子材料 (如多糖)和不同的藥物釋控技術。在對蛋白質藥物進行化學修飾的研究領域中，應用最多， 成功率最高的是聚乙二醇(PEG)修飾技術。在蛋白質藥物的PEG修飾中大多數采用對蛋白質分子中的氨基進行修飾，PEG可以共價鏈接到蛋白質上與活性位點無關的位點上。最常用方法是利用PEG活化后形成的親電子基團和蛋白質上的氨基進行反應，反應后可以在一個蛋白質分子上共價鏈接數個PEG長鏈，聚合物長鏈的數目取決于蛋白質分子上自由氨基的數目、修飾試劑的化學特性及反應條件(如反應溫度、溶液PH等)[Chemistry for peptide
and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Reviews. 2002 (54):459—476]。通
過這樣的修飾，PEG的一些特性就傳遞給了蛋白質，從而改變其在體內的藥代動力學和生理學特性，例如，隱蔽了該酶的抗原表位，降低其免疫原性，降低體內清除率，提高該酶的水溶性，增加酶分子的表觀分子量，降低腎臟清除速率，延長體循環時間。PEG化還可以通過提高酶穩定性，增加其抵抗酶解的能力[The therapeutic value of poly (ethylene
glycol)-modified proteins. Advanced Drug Delivery Reviews. 1991 (6):133—151]。
PEG是目前被美國FDA批準的極少數能作為注射藥用的合成聚合物之一。
發明內容
本發明的目的是提供一種采用蛋白質修飾技術以獲得低免疫原性的聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白酶。本發明包括沙雷菌蛋白消解酶，在沙雷菌蛋白消解酶上連接至少一條聚乙二醇或其衍生物鏈，其結構式如下
權利要求
1.聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白消解酶，其特征在于包括沙雷菌蛋白消解酶，在沙雷菌蛋白消解酶上連接至少一條聚乙二醇或其衍生物鏈，結構式如下
2.根據權利要求1所述聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白消解酶，其特征在于所述的沙雷菌蛋白消解酶為天然或人工重組。
3.一種制備權利要求1所述的聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白消解酶的方法，其特征在于先在沙雷菌蛋白消解酶的溶液中加入緩沖液，調節PH至5.0 9. 5，然后加入活化的聚乙二醇衍生物，在4 50°C環境溫度下反應5 120min，然后將反應混合液進行色譜分離，得到聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白消解酶。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述活化的聚乙二醇衍生物和沙雷菌蛋白消解酶的投料摩爾比為0.1 100 1。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于調節pH至8.5后，加入活化的聚乙二醇衍生物。
6.根據權利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，采用離子交換層析和凝膠過濾層析方法對反應混合液分離純化。
7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述活化的聚乙二醇衍生物為單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯或單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯。
8.如根據權利要求1所述的聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白消解酶的用途，其特征在于用于制備治療心腦血管疾病藥物。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于用于制備清除動脈血管硬化斑塊疾病藥物。
10.根據權利要求8或9所述的用途，其特征在于所述藥物的劑型為丸劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、凝膠劑、注射液或注射用無菌粉針。
全文摘要
聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白消解酶及其制備方法和用途，涉及聚合物修飾蛋白酶的技術領域，先在沙雷菌蛋白消解酶的溶液中加入緩沖液，調節pH值后加入活化的聚乙二醇衍生物進行反應，再將反應混合液進行色譜分離，得到聚乙二醇修飾的沙雷菌蛋白消解酶。本發明基本了保持沙雷菌蛋白消解酶原有的生物活性，增強其生物穩定性，可抵抗胃蛋白酶的水解作用；同時降低了其免疫原性，藥物動力學也因此發生較大的變化，提高生物利用度，更好地滿足沙雷菌蛋白消解酶在臨床應用方面的需求，其應用特別在治療心腦血管疾病方面。
文檔編號A61K47/48GK102229924SQ20111012877
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月18日 優先權日2011年5月18日
發明者華林, 陳厚琦 申請人:華林, 陳厚琦