專利名稱：ErbB受體激動劑在制備治療癲癇病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ErbB受體激動劑在制備治療癲癇病的藥物中的應用。
背景技術：
癲癇(印il印sy)是大腦神經元突發性異常放電，導致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病。癲癇患病率很高，中國約有一千萬患者，影響總人口的大約1 %，癲癇死亡率約為20%。給家庭、社會造成很大的負擔。目前，經過現有的抗癲癇藥物治療，仍有大約30% 的患者不能控制。藥物不能控制的癲癇即難治性癲癇的死亡率更高，可達50%，盡管對于藥物不能控制的癲癇目前多采取手術治療，但適合手術的患者只占一小部分。因此，尋找有效和安全的治療藥物是生物醫學重要的目標之一。在大腦中，約有10 20%的神經元是GABA能中間神經元，盡管數量不多，但是 GABA能中間神經元在感覺信息的處理、神經環路的同步化、腦電節律、抑制癲癇活動中發揮了重要作用。特別是一種表達鈣結合蛋白ParvaIbumin(PV)的細胞占抑制性中間神經元的50%之多，由于其高頻的發放特點，又被稱作快發放中間神經元。來自不同實驗室David Lau, Ikuo Ogiwara等人用在體腦電記錄的方式顯示PV中間神經元的低功能可以導致癲癇發生。在解剖學上，PV中間神經元與周圍神經元主要有兩類連接方式，(1)通過投射到椎體神經元的胞體以及軸突起始端來調節椎體神經元發放；( 通過縫隙連接與周圍的PV神經元廣泛連接，進而影響抑制性網絡的同步化活動。神經調節蛋白(Neuregulin，NRG)是生長因子家族的一員，主要由(NRG1 4)所編碼，NRGl是被詮釋較多的一種。由于不同的轉錄起始位點和選擇性剪切，NRGl可以產生 6種蛋白(I-VI)和至少31種亞型。NRGl的受體ErbB根據亞型分為ErbBl ErbB4四個受體。其中ErbBl和ErbB2沒有配體結合區，但是胞內段具備水解和激酶活性；而ErbB3可以結合NRGl但是不具備激酶活性。ErbB4是唯一一個可以特異性結合NRGl并且具有激酶活性的受體。ErbB受體之間可以形成同二聚體或異二聚體。NRGl通過激動ErbB酪氨酸激酶受體，繼而激活細胞內信號傳導通路，產生一系列細胞反應，包括增生、凋亡、遷移、分化和黏附的活躍或抑制。2010年，！^zzari等人發現ErbB4集中在中間神經元上表達，特別是在PV神經元上。這一結果提示，PV中間神經元很可能是NRGl-ErbB4信號的主要細胞靶點。
發明內容
本發明研究了 ErbB4激動劑NRGl對癲癇的抑制作用，為探索癲癇抑制藥物的新型有效“靶標”和分子提供研究方向，為治療以神經元興奮性改變為基礎的腦系疾病提供候選治療藥物。本發明采用的技術方案是ErbB受體激動劑在制備治療癲癇病的藥物中的應用。所謂ErbB4受體激動劑，是指神經調節蛋白-I (Neuregulin-I)。所述Neuregulin-I分為內源性和外源性激動劑兩種。
3外源性Neuregulin-I為人重組蛋白Neuregulin-lbeta 2 (NRGl)，它是由61個氨基酸組成的多肽鏈。內源性Neuregulin-Ι是由神經元或膠質細胞細胞產生，這里所用ErbB4胞外段 (aal-659, ecto_ErbB4)中和掉的部分。優選的，所述ErbB受體激動劑為ErbB4受體激動劑。具體的，所述ErbB受體激動劑可用于制備增強皮層和海馬區域PV中間神經元的興奮性的藥物。優選的，所述ErbB受體激動劑為NRGl (人重組Neuregulin-I beta2)，由61 amino acids組成，序列為shlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsrylckcpne ftgd rcqnyvmasfykaeelyq ；分子量為7055道爾頓。ErbB4—旦與NRGl結合，ErbB4即被激活，其羧基末端的絡氨酸殘基發生磷酸化并聚集連接蛋白如Shc和GA2等，進而激活Ras-Raf-Erk信號通路。本申請發明人經研究發現，ErbB4受體可能是抗癲癇藥物的潛在靶點，ErbB4激動劑NRGl對癲癇有一定的抑制作用，其機制是中間神經元上的Kvl. 1鉀通道。本發明的有益效果主要體現在本發明揭示了 ErbB4激動劑NRGl對癲癇的抑制作用并對其機理進行了深入研究，為探索癲癇抑制藥物的新型有效“靶標”和分子提供研究方向，為治療以神經元興奮性改變為基礎的腦系疾病的新藥篩選提供了基礎。
圖1為ErbB4受體敲除老鼠與正常老鼠對致癇藥戊四唑以及匹魯卡品的易感性； 結果表示為平均值士標準誤。圖2為預先腦室內注射人重組Neuregulin-I組與腦室只注射等量人工腦脊液組對致癇藥戊四唑以及匹魯卡品的易感性；結果表示為平均值士標準誤。圖3為癲癇患者以及正常對照組大腦皮層ErbB4和ErbB2表達量；結果表示為平均值士標準誤。圖4為外源性或內源性Neuregulin-I對大腦皮層或海馬PV中間神經元的調節作用；結果表示為平均值士標準誤。圖5為藥理學阻斷ErbB4受體或基因特異性敲除ErbB4受體后，Neuregulin_l的作用消失了 ；結果表示為平均值士標準誤。圖6為Neuregulin-I對PV中間神經元上Kvl. 1型鉀電流的調節；結果表示為平均值士標準誤。圖7為細胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平會受到NRGl_ErBB4信號的調節；結果表示為平均值士標準誤。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 :PV中間神經元上特異性敲除ErbB4受體的老鼠更易發癲癇(1)實驗材料
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實驗動物雄性PV-Cre-ErbB4—ρ小鼠(基因敲除ErbB4受體的小鼠)及同窩的對照ErbB4LoxP/LoxP小鼠(含有ErbB4受體的正常小鼠)，各18只，八周齡，體重24士2克， 飼養于相同的環境，食物和水自由攝取海天給12h的光照。行為學實驗在12:00 14:00 之間進行。基因敲除ErbB4受體的小鼠采用國際上廣泛應用的Cre-LoxP重組酶系統獲得。該系統含有兩種成分①一段長Mbp的DNA序列，含有兩個13bp的反向重復序列和一個8bp 的核心序列，其序列如下5' -ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'。這段 34bp 序列是重組酶識別的位點，被稱為IoxP位點；②Cre重組酶(cyclizationrecombination)， 它是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，可以引發IoxP位點的DNA重組，Cre重組酶基因編碼區序列全長l(^9bp (EMBL數據庫登錄號X03453)。任何序列的DNA，當其位于兩個IoxP 位點之間的時候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失(兩個IoxP位點的方向相同)，要么方向發生倒轉(兩IoxP位點的方向相反)。其中PV-Cre老鼠受贈于美國冷泉港Dr.ZJ Huang 實驗室，即在parvalbumin基因的第五號外顯子3' UTR端插入Cre重組酶基因，其在美國 Jacksonlab公司的商品號為008069。ErbB4L°xlVL°xP老鼠受贈于美國佐治亞大學Dr. LMei實驗室，即一段Ioxp序列置于erbb4上游，另一段置于erbb4下游。上訴兩種老鼠雜交，產生的子代老鼠中，經基因鑒定篩選出帶有PV-Cre-ErbBfrap^xp基因型的老鼠。試劑PTZ (戊四唑)，pilocarpine (匹魯卡品)購自美國Sigma公司。儀器透明玻璃籠子(2)實驗方法I、根據文獻和預實驗結果，選用PTZ濃度為40mg/kg，pilocarpine200mg/kg,溶解于PBS，并與腹腔內注射。注射PTZ以后，小鼠單獨放予透明玻璃籠子內，觀察行為變化 30min。癲癇發作嚴重程度根據文獻分級0級無反應；1級耳朵和面部抽動，包括眨眼、 動須、節奏性咀嚼；2級肌陣攣，但無直立；3級肌陣攣，雙側前肢抬起；4級側身倒地；5 級背部倒地，全身強直.陣攣發作6級死亡.II、評估了兩種老鼠在由PTZ誘發全身發作的發生率。III、還評估了兩種老鼠在由匹魯卡品引起癲癇持續狀態的發生率。(3)實驗結果I、圖la、b所示為PV-Cre-ErbBfxtvtap小鼠對戊四唑誘發的癲癇表現更高的發作級別，以及更多的發作百分比。II、圖Ic所示為PV-Cre-ErbB4—M、鼠對匹魯卡品誘發癲癇表現更高的發生率。(4)結論PV中間神經元上特異性敲除ErbB4受體的老鼠更易發癲癇。實施例2 外源性腦室內注入NRGl可以抑制癲癇的發作(1)實驗材料實驗動物雄性ErbB4L°xlVL°xP小鼠，共20只，八周齡，體重M+2克，飼養于相同的環境，食物和水自由攝取；每天給12h的光照。行為學實驗在12:00 14:00之間進行。試劑PTZ，pilocarpine購自美國Sigma公司；Isoflurane (異氟烷)購自河北九派制藥公司；儀器；立體定位儀，型號512600，產于美國Moelting公司；麻醉機。
(2)實驗方法根據前面得出的結果可以做出這樣的假設藥物刺激NRGl_ErbB4軸可能會有抗癲癇的作用。持續異氟烷吸入麻醉，小鼠被固定在立體定位儀下，待麻醉平穩后， 右腦室(AP -O. 5mm, L -lmm, V :-2. 2mm)內注入人重組蛋白 Neuregulin-lbeta 2(6mmol in 3 μ 1)。在十五分鐘的恢復后，在進行腹腔內注射PTZ濃度為60mg/kg或，pilocarpine 250mg/kg。相應的，對照組采取注入右腦室相應體積腦脊液，15分鐘后，腹腔內注入PTZ濃度為60mg/kg或，pilocarpine250mg/kg。癲癇發作評級同上。(3)實驗結果I、所有的老鼠在腹腔注射60mg/kg PTZ后，都會表現出癲癇癥狀，然而，注射過 NRGl的老鼠發作的級別和發作次數明顯低于對照組。II、老鼠在腹腔注射250mg/kg pilocarpine后，預先給NRGl的老鼠癲癇持續狀態發生率更低并且發作潛時更長。(4)結論外源性腦室內注入NRGl可以抑制癲癇的發作。實施例3 :ErbB4受體在人的癲癇患者腦中表達量下降(1)實驗材料人腦組織5例難治性癲癇患者術后腦組織，符合以下標準1特征性腦電圖、藥物治療兩年以上仍有癲癇發作、應用2 3種一線抗癲癇藥物并已達到血藥濃度。II癲癇癥狀符合1981年國際抗癲癇組織分類標準。IIICT或MRI指引下沒有進行性灶點。IV除癲癇外，沒有其他神經系統疾病V術前評估屬于位置相關的癲癇樣放電。對照組腦組織符合以下標準1沒有神經系統的疾病史。II除外傷外，沒有其他可以引起癲癇的腦結構或功能改變的損傷。這兩組之間年齡沒有統計學差異。試劑:anti-ErbB4(ErbB4 抗體)和 anti-ErbB2 (ErbB2 抗體)購自美國 Santa Cruz Biotechnology 公司，anti-caveolin-Ι (小凹蛋白 1 抗體)購自美國 Cell Signaling Technology 公司。儀器Western Blotting所需的基本分子實驗設備。(2)實驗方法蛋白定量裂解細胞，提取蛋白裂解液，用于Wfestern Blotting。Western Blotting — 抗濃度為anti-ErbB4(l 1000)，anti_ErbB2(1 1000)和 anti-caveolin-1(1 ； 1000)。(3)實驗結果圖3所示癲癇患者大腦皮層地ErbB4表達量只有正常對照組的 60%，然而，ErbB2的表達量卻沒有發生改變。統計結果見圖北。(4)結論ErbB4受體在人的癲癇患者腦中表達量下降。實施例4 =NRGl增強皮層和海馬區域PV中間神經元的興奮性(1)實驗材料實驗動物B13和G42小鼠受贈于美國冷泉港Dr. ZJ Huang實驗室。G42，即一段 GAD67-GFP BAC重組體被插入到GAD67gene的第一段外顯子內，其在美國Jacksonlab公司的商品號為007677。B13，即一段Pv-GFPBAC重組體被插入于PV gene內。這兩種老鼠的 PV中間神經元上被特異性的標有綠色熒光。試劑NRG1購自美國 Prospec 公司，ecto-ErbB4 轉染 ecto_ErbB4 (含有 ErbB4 胞外段aa 1-659的pErbB4ex/Fc與昍以93，經培養、純化提取ecto_ErbB4。MEM培養基，胎牛血清購自美國Gibco公司。儀器細胞培養設備，培養瓶和培養箱。切片機購自美國Leica公司。紅外干涉顯微鏡購自日本Nikon公司。電生理記錄系統MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A數模轉換器以及pClamp 10. 2記錄軟件購自美國Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)實驗方法人工腦脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2PO4, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶劑為去離子水；電極內液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl，IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with Κ0Η, 288m0sm), MM 為去離子水；腦片準備動物麻醉后，取腦盡量快速，并保持低溫。然后冠狀切300微米，在33°C 人工腦脊液孵育60分鐘后，轉移到22°C室溫下，電生理記錄全程32°C 33°C。首先在用綠色熒光標記的中間神經元上做了全細胞記錄。所用液體全程充氣95% 02/5% C02。電生理記錄在腦片2或3層，經四十倍水鏡，熒光激發指引下找到帶有綠色熒光的神經元，做全細胞記錄，電流鉗模式下注入500毫秒電流。(3)實驗結果I、圖如所示外源性灌流10納摩爾的NRGl加快了皮層PV中間神經元動作電位的發放頻率。同時熱失活NRGl后再灌流，對頻率沒有影響。統計結果見圖如。 II、圖4b所示，用ecto_ErbB4拮抗內源性的NRGl，皮層PV中間神經元動作電位的頻率明顯下降。同時熱失活ect0-ErbB4后再灌流，對頻率沒有影響。統計結果見圖如。III圖4d所示，在海馬區域重復如上實驗，得到類似的效果。(4)結論NRG1增強皮層和海馬區域PV中間神經元的興奮性實施例5 :ErbB4受體對于NRGl調節中間神經元的興奮性是必要的(1)實驗材料實驗動物G42-ErbB4L。xlVL。xP小鼠，由 G42 與 ErbB4L。xlVL。xP 雜交獲得； G42-PV-Cre-ErbB4LoxP/LoxP 小鼠，由 G42_ErbB4L。xlVL。xP 與 PV-Cre_ErbB4L。xlVL。xP 雜交獲得。試劑NRG1購自美國 Prospec 公司，ecto_ErbB4 轉染含有 ecto_ErbB4 的 pErbB4ex/Fc與HEK293，經培養、純化提取ecro_ErbB4。MEM培養基，胎牛血清購自美國 Gibco公司。AG1478購自美國Sigma公司。儀器細胞培養設備，培養瓶和培養箱。切片機購自美國Leica公司。紅外干涉顯微鏡購自日本Nikon公司。電生理記錄系統MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A數模轉換器以及pClamp 10. 2記錄軟件購自美國Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)實驗方法人工腦脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2P04, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶劑為去離子水；電極內液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl, IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM
7NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with KOH, 288m0sm), MM 為去離子水；腦片準備動物麻醉后，取腦盡量快速，并保持低溫。然后冠狀切300微米，在33°C 人工腦脊液孵育60分鐘后，轉移到22°C室溫下，電生理記錄全程32°C 33°C。首先在用綠色熒光標記的中間神經元上做了全細胞記錄。所用液體全程充氣95% 02/5% C02。電生理記錄在腦片2或3層，經四十倍水鏡，熒光激發指引下找到帶有綠色熒光的神經元，做全細胞記錄，電流鉗模式下注入500毫秒電流。(3)實驗結果1、圖如所示，先用了藥理學的方法，ErbB4的特異性阻斷劑-AG1478，可以阻礙 NRGl對中間神經元興奮性的調節。而且AG1478本身就可以明顯的減慢PV中間神經元的發放頻率(圖)，這又進一步為內源性NRGl的作用提供了證據。II，圖恥所示，用Cre-LoxP的轉基因技術方法特異性敲除PV中間神經元上的 ErbB4受體。發現NRGl不再能加快PV中間神經元的興奮性。這與藥理學的結果相一致，進一步為ErbB4的必要性提供證據。(4)結論ErbB4受體對于NRGl調節中間神經元的興奮性是必要的。實施例6 (1)實驗材料實驗動物B13和G42小鼠受贈于美國冷泉港Dr. ZJ Huang實驗室。G42，即一段 GAD67-GFP BAC重組體被插入到GAD67gene的第一段外顯子內，其在美國Jacksonlab公司的商品號為007677。B13，即一段Pv-GFPBAC重組體被插入于PV gene內。這兩種老鼠的 PV中間神經元上被特異性的標有綠色熒光；試劑NRG1購自美國 Prospec 公司，ecto_ErbB4 轉染含有 ecto_ErbB4 的 pErbB4ex/Fc與HEK293，經培養、純化提取ecro_ErbB4。MEM培養基，胎牛血清購自美國 Gibco 公司。DiTx-K 購自美國 Alomone Labs.公司。儀器細胞培養設備，培養瓶和培養箱。切片機購自美國Leica公司。紅外干涉顯微鏡購自日本Nikon公司。電生理記錄系統MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A數模轉換器以及pClamp 10. 2記錄軟件購自美國Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)實驗方法人工腦脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2PO4, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶劑為去離子水；電極內液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl，IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with KOH, 288m0sm), MM 為去離子水；腦片準備動物麻醉后，取腦盡量快速，并保持低溫。然后冠狀切300微米，在33°C 人工腦脊液孵育60分鐘后，轉移到22°C室溫下，電生理記錄全程32°C 33°C。首先在用綠色熒光標記的中間神經元上做了全細胞記錄。所用液體全程充氣95% 02/5% C02。電生理記錄在腦片2或3層，經四十倍水鏡，熒光激發指引下找到帶有綠色熒光的神經元，做全細胞記錄，電壓鉗模式。用了電流相減的分析方法分離出DTx-K敏感的鉀電流Kvl. 1以及受到ecto-ErbB4調節的電流。把灌流ecto-ErbB4前后的電流相減得到受到 ecto-ErbB4調節的外向電流。或是把灌流DTx-K前后電流相減得到DTX_k敏感的鉀電流 Kvl. 1。(3)實驗結果圖6所示，ecto-ErbB4可以增加整體的外向鉀電流。這一增加的部分被后來的 DTx-K完全的抑制掉(圖)。當提前用DTx-k孵育腦片的情況下，ecto-ErbB4不再能增加鉀電流(圖)。(4)結論這一結果顯示，ecto-ErbB4調節的部分電流是DTx-K敏感的鉀電流，即 Kvl. 1電流。實施例7 細胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平會受到NRGl-ErBB4信號的調節。(1)實驗材料實驗動物PV-Cre-ErbB4—ρ小鼠及同窩的對照小鼠ErbB4L°xPA°xP試劑:anti-Kvl.1 (Kvl. 1 抗體)購自美國 NeuroMab 公司，anti-caveolin-l (小凹蛋白-1抗體)和anti-phosphotyrosine (酪氨酸磷酸化抗體)購自美國Cell Signaling Technology 公司。儀器(2)實驗方法免疫沉淀裂解組織，提取膜蛋白裂解液，富集膜上的Kvl. 1蛋白，用于Western Blotting。蛋白定量蛋白定量裂解組織，提取蛋白裂解液，用于Western Blotting。 Western Blotting 一抗濃度為anti_Kvl· 1 (1 1000), anti-phospho-tyrosine 禾口 anti-caveolin-l (1 ； 1000)(3)實驗結果I、圖7a所示，Kvl. 1總蛋白在NRGl處理后20分鐘內都沒有明顯改變，然而細胞膜上的Kvl. 1通道酪氨酸水平在20分鐘內逐漸升高。II、圖 7b 所示，PV-Cre-ErbB4L°xlVL°XIVjHllKVl. 1 磷酸化水平低于 ErbB4L°xlVL°xP 小鼠 Kvl. 1水平。(4)結論細胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平會受到NRGl-ErBB4信號的調節。
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權利要求
1.ErbB受體激動劑在制備治療癲癇病的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述ErbB受體激動劑為ErbB4受體激動劑。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述ErbB受體激動劑用于制備增強皮層和海馬區域PV中間神經元的興奮性的藥物。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述ErbB受體激動劑為人重組蛋白 Neuregulin-1 beta 2，其氨基酸序列如下:shlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsryIckcpnef tgdrcqnyvmasfykaeelyq0
全文摘要
本發明提供了ErbB受體激動劑在制備治療癲癇病的藥物中的應用。本發明的有益效果主要體現在本發明揭示了ErbB4激動劑NRG1對癲癇的抑制作用并對其機理進行了深入研究，為探索癲癇抑制藥物的新型有效“靶標”和分子提供研究方向，為治療以神經元興奮性改變為基礎的腦系疾病的新藥篩選提供了基礎。
文檔編號A61K45/00GK102327613SQ20111025806
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月2日 優先權日2011年9月2日
發明者盧應梅, 李可心, 李曉明 申請人:浙江大學