一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物的制作方法
【專利摘要】一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物及其應用，它涉及一種應用于養殖動物病毒性感染防治的藥物以及該組合用藥物的制備及穩定性控制方法。它的配方組成為：柴胡皂甙含量范圍：20-50μg/ml；柴胡揮發油含量范圍：紫外吸收值0.45以上；聚肌胞1-3mg/ml，分子量范圍：200-500bp(瓊脂糖凝膠電泳法)；它的制備方法為：將上述組成部分添加適當的藥用輔料按水針劑生產工藝，經配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗合格后即可。它能誘導動物機體產生內源性干擾素，阻遏病毒在動物體內的繁殖。
【專利說明】一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種應用于養殖動物病毒性感染防治的藥物以及該組合用藥物的制備及穩定性控制方法，具體涉及一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物及其應用。
【背景技術】:
[0002]病毒性感染是引起養殖動物死亡、影響動物養殖經濟效益的重要因素，隨著國家獸藥質量標準的規范，取消了大批原地方標準的抗病毒藥物，可選用的抗病毒藥物的短缺與獸醫臨床的需求矛盾日益突出。
[0003]1967年，美國Merck藥廠的Field等人發現了酶促合成的雙鏈核酸(doublestrained RNA, dsRNA)具有誘生干擾素的能力，其中聚肌胞(Polyinosinic-polycytidylic Acid, PIC)的誘生能力最強,它可以刺激機體產生廣譜的內源干擾素，進而激活蛋白激酶和2’，5’ -寡聚腺苷酸合成酶、Mx蛋白等抗病毒因子，以降解進入細胞的病毒，達到抑制、治療病毒性感染的目的。
[0004]PIC由寡聚肌苷酸與寡聚胞苷酸在合適的條件下按堿基配對的原則聚合而成。研究表明，PIC分子量的大小、雙鏈的緊密程度及其穩定性是決定其誘導干擾素活性高低的重要影響因素。目前，國內雖然有寡聚肌苷酸及寡聚胞苷酸原料的生產，但尚缺乏對雙鏈配對的合適條件、穩定性影響因素等的系統研究，也未見到其與其他活性物質配伍方面的報道。
[0005]國內外的藥理學和毒理學研究表明，PIC應用于動物體后，可發生一過性低熱的副作用，而如何防止這一副作用的發生，尚未見研究報道。
【發明內容】
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[0006]本發明的目的是提供一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物及其應用，它能夠誘導動物機體產生干擾素，增強機體免疫力，具有抗病毒作用的合成核酸類化學藥品與中藥提取物的組合用藥物，以及本組合藥品穩定性控制方法和在家禽，家畜、寵物和水產動物上的應用。
[0007]為了解決【背景技術】所存在的問題，本發明是采用以下技術方案:它的配方組成為:柴胡皂甙含量范圍:20-50 μ g/ml ;柴胡揮發油含量范圍:紫外吸收值0.45以上；聚肌胞l-3mg/ml，分子量范圍:200_500bp (瓊脂糖凝膠電泳法)；它的制備方法為:將上述組成部分添加適當的藥用輔料按水針劑生產工藝，經配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗合格后即可。這些組分之間具有一定的促效與 增效作用，并且可以避免dsRNA的副作用。
[0008]為了制成上述的復方制劑，需要對其穩定性進行控制，以確保改組和藥品適合保存運輸，從而具有上述的藥效。
[0009]所述的聚肌胞的合成方法為:
[0010]500ml注射用水中依次加入焦亞硫酸鈉0.3g、氯化鈉0.6g以及適量的磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉，加熱至20-60°C，進一步優選為30-50°C之間的某一特定溫度，加入500mg聚胞苷酸攪拌使溶解，保溫10分鐘，然后加入500mg聚肌苷酸攪拌使溶解，保溫配對15-30分鐘；上述溶液中加入紫外吸收值1.6以上、柴胡皂甙含量0.4%以上的柴胡揮發油400ml，充分攪拌混勻，用注射用水定容至1000ml, 0.45um微孔濾膜法過濾,灌封，100°C流通蒸汽滅菌30分鐘，燈檢、貼標即得。
[0011]所述的柴胡皂甙、柴胡揮發油的分步提取工藝為:
[0012]柴胡飲片按料液比1: 6在30_60°C，進一步優化為35_45°C之間某一特定溫度下溫潰，收集相當于藥材2倍量蒸餾液，減壓濃縮，得到較高紫外吸收值的柴胡揮發油；溫潰后的柴胡藥材，按料液比1: 6，加入體積百分比濃度60-98%之間，進一步優選為75-96%之間某一特定濃度乙醇，加熱至45°C，回流提取1-1.5小時提取柴胡皂甙，提取液經濃縮，得到較高濃度的柴胡皂甙。
[0013]因為本組合藥物制備過程中需要加入較高濃度的柴胡揮發油及柴胡皂甙，而這兩種成分在提取過程中存在相互影響，所以本發明采用了兼顧兩種成分的分步提取工藝。
[0014]本發明具有以下特征:通過柴胡皂甙與dsRNA的協同作用，誘導動物機體產生內源性干擾素，阻遏病毒在動物體內的繁殖；另一方面，通過柴胡皂甙疏散退熱的功效，避免dsRNA類藥物可能出現的一過性低熱的副作用。本發明涉及以下過程:二步抽提法制備柴胡皂甙和柴胡揮發油的工藝參數；由聚肌苷酸與聚胞苷酸合成一定分子量大小并且對核酸酶具有一定抗性的dsRNA的工藝參數；本發明的穩定化技術及其對家禽、家畜，水產動物的藥效學研究。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0015]圖1為本發明的熱源性測定示意圖，圖2為本發明對新城疫感染免疫后15d時攻毒后試驗結果不意圖，圖3為本發明對新城疫感染免疫后22d時攻毒后試驗結果不意圖，圖4為本發明對豬瘟病毒感染的保護作用示意圖，圖5為本發明對犬的犬瘟熱病毒感染的保護作用示意圖，圖6為本發明對虹鱒病毒感染的保護作用示意圖。
【具體實施方式】:
[0016]【具體實施方式】一:本【具體實施方式】采用以下技術方案:它的配方組成為:聚肌胞、柴胡皂甙和柴胡揮發油；它的制備方法為:將上述組成部分添加適當的藥用輔料按一定工藝制成復方制劑；這些組分之間具有一定的促效與增效作用，并且可以避免dsRNA的副作用。
[0017]【具體實施方式】二:參照圖1，本【具體實施方式】采用以下技術方案:取用兩組試驗家兔，分別注射單純聚肌胞注射液和該組合藥物進行熱源性試驗，記錄試驗兔體溫變化情況。結果表明，該組合藥物能夠減輕單獨聚肌胞注射液的熱源反應。
[0018]【具體實施方式】三:參照圖2和圖3，本【具體實施方式】采用以下技術方案:將該藥物用注射用水稀釋至50 μ g/ml。將240只試驗用雛雞隨機分為6個試驗組，每組40只。I組:空白對照組；11組:藥物對照組(黃芪多糖注射液，按每千克體重20mg) ；III組:疫苗對照組(無藥物)；iv組:高劑量藥物試驗組(每千克體重0.1mg)…組:中劑量藥物試驗組(每千克體重0.05mg) ；VI組:低劑量藥物試驗組(每千克體重0.01mg)。將以上雛雞隔離籠養，空白對照組與陽性對照組和 用藥試驗組在不同雞舍飼養，飼養條件保持一致。飼養至10d，II1、IV、V、VI四個組進行新城疫疫苗免疫。將各組再分別分成兩組，其中的一部分在免疫后15d，將I1、IV、V、VI組用藥物處理，12h后將I至VI組進行第一次攻毒(攻毒500個單位LD5tl的ND強毒)，攻毒后24h將I1、IV、V、VI組再次注射與首次注射劑量相同的藥物觀察7d ;每個組的另一半雞在免疫后21d進行攻毒，處理同第一次。
[0019]結果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物對家禽(雞)病毒病的自然感染發病有明顯的保護率和高的治愈率，能夠抑制病毒在家禽體內的增殖。尤其對于免疫失敗的家禽病毒病的防治具有聞的效果。
[0020]【具體實施方式】四:參照圖4，本【具體實施方式】采用以下技術方案:將該藥物用注射用水稀釋至50 μ g/ml。將60頭試驗用仔豬隨機均分為6個試驗組進行試驗，每組10頭。分組及試驗方法如下:第I組為生理鹽水對照組；第II組為藥物對照組(黃芪多糖注射液，20mg/kg.bw);第III組為疫苗對照組(無藥物)；第IV組為疫苗組+藥物高劑量組(0.1mg/kg.bw);第V組為疫苗組+藥物中劑量組(0.05mg/kg.bw) ?’第VI組為疫苗組+藥物低劑量組(0.01mg/kg.bw)。
[0021]將斷奶仔豬按以上實驗分組隔離飼養，生理鹽水對照組與陽性對照組和用藥試驗組在不同豬舍飼養，飼養條件保持一致。飼養至15天，II1、IV、V、VI4個組分別進行豬瘟疫苗(免疫劑量為常規免疫劑量)免疫。免疫后15天，第II組注射黃芪多糖注射液；IV、V、VI組仔豬肌注藥物，12小時后進行攻毒(攻毒劑量為500LD5(i豬瘟強病毒)，攻毒后24小時給藥組再次注射與首次注射劑量相同的藥液，觀察7-15天。
[0022]結果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物對豬病毒病的感染發病有明顯的保護率和較高的治愈率，能夠抑制病毒在家畜體內的增殖。能夠降低家畜的死亡率。
[0023]【具體實施方式】五:參照圖5，本【具體實施方式】采用以下技術方案:將該藥物用注射用水稀釋至50μ g/ml。將75只試驗用犬隨機均分為5個試驗組進行試驗，每組15只。第I組為空白對照組；第I1、II1、IV組分別以聚肌胞藥物高、中、低劑量用藥試驗組(高劑量組用藥劑量為0.lmg/kg.bw ;中劑量組用藥劑量為0.05mg/kg.bw ;低劑量組用藥劑量為
0.0 lmg/kg.bw);第V組為黃苗多糖注射液藥物對照組20mg/kg.bw。
[0024]將比格犬按以上實驗分組隔離飼養，空白對照組與陽性對照組和用藥試驗組在不同犬舍飼養，飼養條件保持一致。飼養一周后，I1、II1、IV組比格犬肌注聚肌胞藥物(按照各組的給藥劑量給藥)，12小時后試驗犬全部注射500LD5(i的犬瘟熱病毒，攻毒后24小時各組按設計的方法再次注射與首次注射劑量相同的藥物，觀察7-15天。
[0025]結果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物對寵物(犬)病毒病的感染發病有明顯的保護率和高的治愈率，能夠抑制病毒在寵物犬體內的增殖。
[0026]【具體實施方式】六:參照圖6，本【具體實施方式】采用以下技術方案:將150條試驗用虹鱒稚魚隨機均分為6個試驗組進行試驗，每組25條。第I組為空白對照組；第II組為黃芪多糖注射液藥物對照組，給藥劑量為藥物推薦劑量;第II1、IV、V組分別以聚肌胞高、中、低劑量用藥(高劑量組用藥劑量為0.lmg/kg -bw ;中劑量組用藥劑量為0.05mg/kg -bw ;低劑量組用藥劑量為0.0 lmg/kg.bw);第VI組為攻毒對照組。
[0027]將虹鱒稚魚按以上實驗分組隔離飼養，空白對照組與陽性對照組和用藥試驗組在不同漁缸中飼養，飼養條件保持一致。飼養一周后，第II1、IV、V組虹鱒稚魚腹腔注射聚肌胞注射液，24小時后I1、II1、IV、V、VI注射3000TCID5(I的傳染性胰臟壞死癥病毒，攻毒后24小時后，按各組方案再次注射與首次注射劑量相同的藥液，觀察結果。
[0028]結果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物能夠抑制水產魚類病毒病增殖。從而達到對水產魚類病毒病感染的治療與預防作用。
【權利要求】
1.一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物，其特征在于它的配方組成為:柴胡皂甙含量范圍:20-50 μ g/ml ;柴胡揮發油含量范圍:紫外吸收值0.45以上；聚肌胞l_3mg/ml，分子量范圍:200-500bp，它的制備方法為:將上述組成部分添加適當的藥用輔料按水針劑生產工藝，經配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗合格后即可。
2.根據權利要求1所述的一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物，其特征在于所述的聚肌胞的合成方法為:500ml注射用水中依次加入焦亞硫酸鈉0.3g、氯化鈉0.6g以及適量的磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉，加熱至20-60°C，加入500mg聚胞苷酸攪拌使溶解，保溫10分鐘，然后加入500mg聚肌苷酸攪拌使溶解，保溫配對15-30分鐘；上述溶液中加入紫外吸收值.1.6以上、柴胡皂甙含量0.4%以上的柴胡揮發油400ml，充分攪拌混勻，用注射用水定容至1000ml, 0.45um微孔濾膜法過濾，灌封，100°C流通蒸汽滅菌30分鐘，燈檢、貼標即得。
3.根據權利要求1所述的一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物，其特征在于所述的柴胡皂甙、柴胡揮發油的分步提取工藝為:柴胡飲片按料液比1: 6在30-60°C，收集相當于藥材2倍量蒸餾液，減壓濃縮，得到較高紫外吸收值的柴胡揮發油；溫潰后的柴胡藥材，按料液比1: 6，加入體積百分比濃度60-98%之間濃度乙醇，加熱至45°C，回流提取1-1.5小時提取柴胡皂甙，提取液經濃縮，得到較高濃度的柴胡皂甙。
【文檔編號】A61P31/12GK103751237SQ201110308866
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2011年10月13日 優先權日:2011年10月13日
【發明者】胡鯨波 申請人:胡鯨波