羅漢果三萜皂甙及其鹽和其制備方法、應用及包含該羅漢果三萜皂甙及其鹽的藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及從植物中提取的化合物在制備用于治療腫瘤的化療增效劑中的應用， 具體地涉及羅漢果三萜皂甙及其鹽和其制備方法、應用及包含該羅漢果三萜皂甙及其鹽的 藥物組合物。
【背景技術】
[0002] 化療是治療腫瘤疾病的重要途徑之一，然而，部分化療藥物副作用較大，給患者帶 來痛苦，如長春新堿、甲氨喋呤、順鉑、環磷酰胺等可導致注射局部疼痛、靜脈栓塞、胃腸道 反應、骨髓抑制、外周神經病變等毒副作用。此外，由于化療藥物的細胞毒性，甚至會引發病 人產生感染、出血等并發癥。例如，順鉑屬于細胞周期非特異性藥物，具有細胞毒性，可抑制 癌細胞的DNA復雜過程，并損傷其細胞膜上的結構，患者使用順鉑后可能會出現以下不良 反應：骨髓抑制、胃腸道反應、腎臟毒性、神經毒性、過敏反應、電解質紊亂等。
[0003] 腫瘤化療增敏劑是一類能提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性、減少化療藥物用量 的藥物。為減少化療藥物的毒副作用、提高藥物療效、降低抗藥性的產生，選擇合適的化療 增敏劑進行聯合使用，已成為治療腫瘤的重要方案之一。如，臨床上將順鉑與5-Fu、博來霉 素聯合使用治療食管癌，從而提高療效。
[0004] 因此，人們一直希望找到不良反應小，甚至沒有不良反應的腫瘤化療增效劑。腫瘤 對藥物的敏感性與其相關基因的表達密切相關，研究發現Bax表達可增強胰腺癌對吉西他 濱和5-FU等化療藥物以及放射治療的敏感性，此外，發現Bax基因在胃癌、肝癌等腫瘤組織 中表達明顯下調，提示Bax的表達可增強腫瘤對放療、化療的敏感性（何巍，李玉霞，李巍。 轉染Bax基因對A549細胞系的凋亡及化療敏感度的影響[J]。腫瘤防治研究，2014,06 : 515-518)。Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的編碼產物，是細胞存活促進因子，Bcl-2基因家 族中的Bcl-2是最重要的凋亡抑制基因，有研究發現Bcl-2的高表達能明顯抑制化療藥誘 導腫瘤細胞凋亡，導致腫瘤細胞對多種化療藥物耐受（周亭芳，莊英幟，曹建國。羅格列酮 增強順鉑抑制人肺腺癌細胞增殖作用[J]。中國藥理學通報，2005,01:88-91)。
[0005] 多藥耐藥（MDR)是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現耐藥的同時對其他結構不 同、作用靶位點不同的抗腫瘤藥物也產生耐藥的現象。多項研究顯示，ERK通路的過表達與 腫瘤的化療耐藥存在正相關的關系。ERK信號通路的研究為臨床上治療腫瘤耐藥提供了藥 物支持（梁偉，陳志霞，王慧君，王松坡。ERK信號通路參與至真方逆轉人大腸癌多藥耐藥 細胞HCT-8/VCR耐藥作用機制的研究[J]。中國中西醫結合消化雜志，2015,05 :315-320)， 在絕大多數急性白血病細胞中，ERK高表達。例如K562細胞系抗凋亡特性就與ERK基礎活 性較高有關，ERK活性受抑后，可使K562發生凋亡。通過阻抑ERK通路，降低磷酸化ERK1/2 蛋白表達水平，進而下調端粒酶活性，可以達到增強白血病、卵巢癌等多種耐藥細胞對化療 藥物敏感性的目的（李登舉，張瑤珍，黃偉，孟凡凱。抑制ERK增強白血病和卵巢癌耐藥細 胞系化療敏感性[J]。中國實驗血液學雜志，2003,11 (6) :595-599)。
[0006] 因此，為了解決現有技術中的上述不足，本發明提出了一種新的解決方案。
【發明內容】
[0007] 為了解決現有技術中的上述問題，本發明提供了羅漢果三萜皂甙及其鹽和其制備 方法、應用及包含該羅漢果三萜皂甙及其鹽的藥物組合物。根據本發明提供的羅漢果三萜 皂甙及其鹽能夠上調Bax的表達和下調Bcl-2的表達，或者能夠下調P-ERK的表達，能提高 腫瘤細胞對化療藥物的敏感性和減少化療藥物的用量，且無其他毒副作用和不良反應。
[0008] 本發明一方面提供了一種羅漢果三萜皂甙及其鹽的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)將羅漢果粉碎、稱重，按羅漢果與水質量比為1:6-1:8的比例加入7K，在 80-95Γ的溫度下攪拌提取1-3個小時，離心收集上清液，將沉淀重復攪拌提取1-4次，每次 均離心收集上清液，合并上清液以得到提取液；
[0010] 2)向所述提取液中加入絮凝劑，除去所述提取液中的鞣質和可溶性蛋白，得到澄 清的水溶液；
[0011] 3)采用XAD-16樹脂對所述水溶液進行吸附，然后用30-50%的乙醇進行洗脫，得 到富集羅漢果三萜皂甙的水-乙醇混合溶液；
[0012] 4)將所述水-乙醇混合溶液進行減壓濃縮，并回收乙醇，濃縮至膏狀的浸膏并稱 重，向所述浸膏中加入3-6倍質量的去離子水來稀釋浸膏，以得到粗品三萜皂甙水溶液；
[0013] 5)采用Diaion PA樹脂對所述粗品三萜皂甙水溶液進行脫色處理，收集下注液， 得到富集液，再利用半制備液相色譜分離制得純度大于98%的羅漢果三萜皂甙及其鹽。
[0014] 本發明另一方面提供了一種由上述制備方法得到的羅漢果三萜皂甙及其鹽，其特 征在于，所述羅漢果三萜皂甙及其鹽具有以下通式：
[0016] 其中，R為H原子、金屬離子或η個葡萄糖分子，Rl為金屬離子或η個葡萄糖分子， η均彡1〇
[0017] 可選地，所述羅漢果三萜皂甙具有以下結構式：
[0018]
[0019] 羅漢果皂甙VI
[0021] 羅漢果皂甙V
[0023] 羅漢果皂甙IV
[0024]
[0025] 羅漢果皂甙III。
[0026] 本發明又一方面提供了上述羅漢果三萜皂甙及其鹽在制備用于治療腫瘤的化療 增效劑中的應用。
[0027] 可選地，所述化療增效劑包括化療增敏劑和耐藥逆轉劑。
[0028] 進一步地，所述羅漢果三萜皂甙及其鹽能夠調控腫瘤細胞中與藥物敏感的、耐藥 相關的基因的表達。
[0029] 進一步地，所述羅漢果三萜皂甙及其鹽能夠上調Bax的表達和下調Bcl-2的表達， 或者能夠下調ρ-ERK的表達。
[0030] 可選地，所述腫瘤選自白血病、肝癌、肺癌、血癌、結腸腺癌、淋巴癌、乳腺癌、胰腺 癌、喉癌、黑色素瘤或宮頸癌。
[0031] 本發明再一方面提供了一種藥物組合物，其包含上述羅漢果三萜皂甙及其鹽和藥 用載體。
[0032] 可選地，所述藥用載體選自填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、吸收促進劑、吸附載 體、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑或潤濕劑。
[0033] 根據本發明提供的羅漢果三萜皂甙及其鹽和其制備方法、應用及包含該羅漢果三 萜皂甙及其鹽的藥物組合物，能夠帶來至少以下有益效果之一：
[0034] (1)具有化療增效劑的作用。本發明提供的羅漢果三萜皂甙及其鹽，在腫瘤化療的 治療中具有顯著的增敏和耐藥逆轉作用，此處所述的增敏作用包括能夠增加非耐藥腫瘤細 胞對于化療藥物敏感性的作用，以及能夠克服耐藥腫瘤細胞耐藥性的作用，本發明提供的 羅漢果三萜皂甙及其鹽通過調控腫瘤細胞中Bax、Bcl-2蛋白以及抑制ERK信號通路而具有 化療增敏和耐藥逆轉的作用，既可以發揮較顯著的抑制腫瘤細胞增殖的效應，又能有效降 低化療藥物劑量，從而提高療效，具有實際的應用價值；
[0035] (2)使用方便，應用廣泛。本發明提供的含有羅漢果三萜皂甙及其鹽可以單獨使用 或以藥物組合物的形式使用，可通過口服或注射給藥，可通過口服或注射給藥，可與抗代謝 藥物、轉錄抑制藥物、有絲分裂抑制藥物和干擾DNA復制藥物等化療藥物聯合使用，且可用 于白血病、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌或胰腺癌等各種腫瘤。
【附圖說明】
[0036] 圖1示出了本發明實施例1提供的羅漢果三萜皂甙VI調控胰腺癌細胞PANC-I中 Bax、Bcl-2蛋白的蛋白免疫雜交結果；
[0037] 圖2示出了本發明實施例1提供的羅漢果三萜皂甙VI與吉他西濱聯合抑制胰腺癌 的結果；
[0038] 圖3示出了本發明實施例2提供的羅漢果三萜皂甙V調控肝癌細胞中Bax、Bcl-2 蛋白的蛋白免疫雜交結果；
[0039] 圖4示出了本發明實施例2提供的羅漢果三萜皂甙V與順鉑聯合抑制肝癌的結 果；
[0040] 圖5示出了本發明實施例3提供的羅漢果三萜皂甙IV調控白血病耐藥株HL-60/ ADR細胞中p-ERKl/2蛋白的蛋白免疫雜交結果；
[0041] 圖6示出了本發明實施例4提供的羅漢果三萜皂甙III調控乳腺癌MCF-7ADR細胞 中P-ERK蛋白的蛋白免疫雜交結果。
【具體實施方式】
[0042] 下面參照附圖詳細介紹本發明的示例性實施例。提供這些示例性實施例的目的是 為了使得本領域普通技術人員能夠清楚地理解本發明，并且根據這里的描述能夠實現本發 明。附圖和具體實施例不旨在對本發明進行限定，本發明的范圍由所附權利要求限定。 [0043] 本發明一方面提供了一種羅漢果三萜皂甙及其鹽的制備方法，包括以下步驟：
[0044] 1)將羅漢果粉碎、稱重，按羅漢果與水質量比為1:6-1:8的比例加入7K，在 80-95Γ的溫度下攪拌提取1-3個小時，離心收集上清液，將沉淀重復攪拌提取1-4次，每次 均離心收集上清液，合并上清液以得到提取液；
[0045] 2)向上述提取液中加入絮凝劑，除去所述提取液中的鞣質和可溶性蛋白，得到澄