專利名稱：一種對脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行純化的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及對脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行純化的方法，尤其是采用中空纖維超濾法對脫毒后的無細胞百日咳抗原溶液進行純化的方法。
背景技術：
百日咳(pertussis，whooping cough)是由革蘭氏陰性百日咳桿菌引起的一種具有強傳染性的呼吸系統疾病，典型癥狀為突然陣發性痙咳，并帶有吸氣性尾聲或伴有嘔吐， 新生兒及嬰幼兒患者會引起呼吸暫停和發紺。百日咳在發病初期傳染力極強，不易診斷，因此進行疫苗接種是預防和控制百日咳最經濟最有效的手段。目前市場上的百日咳疫苗主要有全菌體百日咳疫苗和無細胞百日咳疫苗兩種，后者屬于百日咳疫苗的升級產品，其僅含提純的有效抗原而沒有百日咳菌體，因此大大降低了注射后的不良反應而保留了良好的免疫效果，因此被廣泛使用。根據有效抗原純化的方法不同，無細胞百日咳疫苗的生產工藝可以分為離心共純化和柱層析單獨純化兩種。一種是我國和日本大部分廠商采用的離心共純化工藝，即細菌培養液收獲后，通過硫酸銨鹽析、高鹽溶液浸提和蔗糖密度梯度離心獲得精制抗原，然后利用戊二醛溶液或者甲醛溶液將抗原脫毒為類毒素，另一種是歐美大部分廠商采用的柱層析法，即主要采用柱層析的方法將細菌培養液中的各抗原組分分別提取出來，然后利用戊二醛溶液或者甲醛溶液將抗原脫毒為類毒素，再按一定的比例混合。這兩種方法均是采用透析的方法去除解毒后抗原溶液中的脫毒劑以及脫毒過程中產生的色素分子獲得無細胞百日咳原液。傳統的流式透析法存在著不少質控隱患①透析袋的材質和性能缺乏嚴格驗證；②操作繁瑣，不易進行質控；③透析操作效率低，操作時間長達5-7天，無菌條件不易控制。切向流過濾是指液體流動方向與過濾方向呈垂直方向的過濾形式，根據過濾精度的不同可以分為超濾和微濾，根據使用材料的不同可以分為中空纖維膜柱式過濾和板式膜包式過濾。和傳統的液體死端過濾相比，切向流過濾具有濾速快、效率高的優點，而且可隨需控制濃縮和洗濾倍數，因此切向流過濾技術的超濾操作是替代透析的理想選擇，在很多生物制品的生產中已廣泛應用。盡管切向流過濾相比傳統流式透析法有很多優點，但是目前國內外還未有將此技術應用于去除脫毒后百日咳抗原溶液中的脫毒劑。這是因為無細胞百日咳疫苗的主要成分百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)都具有很強的疏水聚合特性，在脫毒處理后會出現顯著的絮狀凝集，而且在透濾過程中，隨著小分子伴侶逐漸被緩沖液替代，這種絮狀凝集還會增加，而超濾選用的材質多有復雜的流體通道，因此會造成切向流速的下降和蛋白沉淀物的積累堵塞，從而造成工作效率和收獲率的大幅下降，因此不適合產業化的需要。
發明內容
本發明的目的是提供一種對脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行純化的方法，用來替代現有的透析工藝，以克服現有技術的不足。
實現本發明的具體技術方案是本發明本提供的這種對脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行純化的方法，包括以下步驟步驟一、預調整在0_18°C，優選為4_12°C條件下進行以下操作向脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液中添加氯化鈉溶液，使脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液的電導率調整至 20-100mS/cm，優選為30-70mS/cm ；向脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液中添加磷酸鹽，使脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液的PH調整至6. 5-8. 5 ；所述的氯化鈉溶液的pH值為6. 5-8. 5，濃度為0. 15-1摩爾每升，優選為0. 5摩爾每升；所述的磷酸鹽為磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉；步驟二、超濾濃縮采用中空纖維超濾系統對經步驟一處理的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行超濾濃縮，使百日咳抗原溶液中的蛋白氮含量為每毫升200-700微克時， 進行步驟三的操作；所述的采用中空纖維超濾系統對經步驟一處理的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行超濾濃縮的具體方法是將經步驟一處理的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液注入中空纖維超濾系統的儲罐(1)中，并將中空纖維超濾系統儲罐(1)中的百日咳疫苗抗原溶液的溫度控制在0-18°C，優選4-12°C ；所述的中空纖維超濾系統的中空纖維膜柱(5)的截留分子量在1萬-30萬，優選為5萬-15萬；啟動隔膜泵O)，調節帶有流速監測裝置的濾出閥(4)和隔膜泵(2)使濾出閥(4)所帶流速監測裝置顯示的切向流速在15-40LMH范圍內，優選為20LMH ；至超濾濃縮后的百日咳抗原溶液中的蛋白氮含量為每毫升200-700微克時，優選為每毫升300-500微克時，進行步驟三的操作；步驟三、洗濾向中空纖維超濾系統的儲罐(1)中添加洗濾液進行洗濾，調節濾出閥(4)和隔膜泵O)的速度來控制濾出液的流速，使濾出液的流速與洗濾液的添加速度一致，在洗濾過程中不定時取樣檢測洗濾后的百日咳抗原溶液中的脫毒劑的含量和洗濾后的百日咳抗原溶液的顏色，脫毒劑的含量和洗濾后的百日咳抗原溶液的顏色符合《中國藥典 (2010年版)》規定的“稀釋成成品后游離甲醛含量應不高于0. 2g/L，戊二醛含量應小于 0. 01g/L、外觀為淡棕色”的條件時，則停止洗濾；所述的洗濾液為pH值為6. 5-8. 5、濃度為 0. 15-1摩爾每升的氯化鈉溶液，洗濾結束后，收集中空纖維系統中的溶液得到洗濾后的百曰咳抗原溶液；步驟四、淋洗回收用洗濾液對中空纖維超濾系統進行淋洗，將淋洗得到的淋洗液和經步驟三得到的洗濾后的百日咳抗原溶液合并得到純化的百日咳疫苗抗原溶液，所述的洗濾液為PH值為6. 5-8. 5、濃度為0. 15-1摩爾每升的氯化鈉溶液；上述步驟二、步驟三和步驟四應在0. 5-3小時完成，優選1-2小時完成。上述步驟三、步驟四中所用氯化鈉溶液的濃度具體可以是0. 5摩爾每升。上述步驟二中采用中空纖維超濾系統可以是由儲罐⑴、泵(2)、進樣閥(3)、濾出閥G)、中空纖維膜柱( 和回流閥(6)組成，在儲罐(1)的外部安裝有內設冷凝水循環通道的夾套(7)，夾套(7)可以通過夾套中的冷凝水循環對儲罐(1)中的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行降溫。上述步驟二中對中空纖維超濾系統儲罐(1)中的百日咳疫苗抗原溶液的溫度進行控制的具體方法是通過設置在中空纖維超濾系統儲罐(1)的外部的其內設置有冷凝水循環通道的夾套(7)中的冷凝水循環對儲罐(1)中的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行降
本發明方法中抗原溶液的溫度須控制在0-18攝氏度之間，優選范圍為4-12攝氏度。低溫可以減輕蛋白質的疏水作用，從而減少有效抗原的絮凝。這可以通過給中空纖維超濾系統配備冷凝系統來實現，如在儲罐上安裝夾套，然后利用冷凝水進行冷卻。超濾濃縮過程中溶液的濃度須控制在每毫升含200-700微克蛋白氮，濃度過高會加強蛋白質的疏水作用，增加有效抗原的絮凝，濃度太低會增加洗濾過程中洗濾液的使用量并延長工作時間，超濾濃縮這一步優選的終濃度為每毫升含300-500微克蛋白氮。超濾濃縮、洗濾和淋洗回收的總時間須控制在0. 5小時到3小時之間，優選1-2小時，這可以通過選擇合適面積的中空纖維膜柱來實現，工作時間過長會使有效抗原的性質發生變化進而影響產品質量，此時可以選擇較大面積的中空纖維膜柱，工作時間過短可以選擇面積較小的中空纖維膜柱，這樣可以減少由于膜面積增大帶來的抗原溶液殘留同時降低使用成本。采用中空纖維超濾法對脫毒后的無細胞百日咳抗原溶液進行純化從而除去甲醛、戊二醛、賴氨酸、天冬氨酸等脫毒劑以及在脫毒過程中產生的色素分子的方法。在實施例1中，我們對利用此法純化得到的百日咳疫苗原液進行檢測，其戊二醛和賴氨酸的含量以及原液的外觀均達到《中國藥典O010年版)》三部規定的標準。本發明方法的優點是(1)物料發生混濁是小分子伴侶逐漸被緩沖液替代過程中難以完全避免的客觀現象。基于百日咳抗原這一特性，我們沒有使用帶“篩網”結構的膜包 (流體通道的復雜結構降低了切向流速，并可能造成蛋白沉淀物的積累堵塞)，而是選擇了低剪切力，流體通道簡單的中空纖維膜柱，同時還對超濾條件進行優化，使我們獲得了很高的工作效率，整個工藝時間由原來的5-7天縮短到不到3個小時，而且回收率可以達到90% 以上，符合大規模生產的要求。(2)切向流過濾對絮凝蛋白具有一定的“勻化”作用，有助于減少大塊沉淀物生成，比較透析后和超濾后的原液，我們發現后者的絮凝蛋白更細膩且沉降速度更緩慢。因此超濾法可以提高后期超聲波勻化效率，從而間接提高產品的效價。(3) 整個系統能夠很方便地進行CIP (原位清洗)和SIP (原位滅菌)，而且整個工藝過程都是全封閉操作，大大降低了污染的風險，更加符合《藥品生產質量管理規范》(GMP)的規定。
圖1 純化前后抗原溶液的外觀對比，圖中1是脫毒后的抗原溶液；2是超濾濃縮的濾出液；3是2. 5倍濃縮/洗濾后的抗原溶液。 圖2 為各純化步驟的SDS-PAGE分析，利用12 %的SDS-PAGE電泳對采用傳統透析方法純化和超濾后的溶液進行比較，上樣量為50微升的抗原溶液(蛋白氮含量為60微克 /升)，結果顯示，百日咳原液的性質未發生明顯改變，且超濾外液中未檢測到抗原組分。電泳順序為1、脫毒后的抗原溶液；2、超濾純化后的百日咳原液；3、超濾濃縮的濾出液；4、采用傳統透析方法純化后的的百日咳原液；5、蛋白質Marker。圖3 為中空纖維系統示意圖；圖中數字標識為1-帶夾套的儲罐；2-泵；3-進樣閥；4-濾出閥；5-中空纖維膜柱；6-回流閥；7-夾套。
具體實施例方式通過下面實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發明進行進一步的說明，但不能理解為對本發明保護范圍的限制。
實施例1主要物料和設備洗濾液(pH6. 5-7. 5，磷酸鈉緩沖液5毫摩爾每升，氯化鈉0.5摩爾每升)；脫毒后的精制無細胞百日咳抗原溶液6000毫升(蛋白質含量為每毫升75微克蛋白氮，以下簡稱脫毒后的抗原溶液)；IOkDa中空纖維超濾柱膜柱型號，SLP-1053 (PALL公司)；供液泵 Quottroflow衛生級隔膜泵，濾出閥為帶流量計(羅斯蒙特8731型衛生級流量計)的隔膜閥；高速冷凍離心機(Eppendorf)，小型垂直電泳儀(Bio-rad)，電子天平(梅特勒)。具體過程步驟一、預調整將脫毒后的精制無細胞百日咳抗原溶液中的氯化鈉濃度調整至 0. 5摩爾每升，電導率為40mS/cm，配置洗濾液pH6. 5-7. 5，磷酸鈉緩沖液5毫摩爾每升，氯化鈉250毫摩爾每升；步驟二、超濾濃縮超濾工藝數據參見表1。在超濾濃縮過程中，65分鐘濾出 4800ml料液，濃縮了 5倍，濾速衰減平穩，平均濾速為46LMH。步驟三、洗濾在洗濾過程中，80分鐘濾出5300ml料液，濾速衰減基本平穩，平均濾速為43LMH。步驟四、淋洗回收最后用1200ml洗濾液對整個系統進行了淋洗，并將淋洗液同之前的洗濾液(1200ml)進行了混合，原液的最終濃縮倍數為2. 5倍。脫毒后的抗原溶液， 超濾濃縮的濾出液和濃縮/洗濾后的原液的外觀圖見圖1，可以看到超濾純化后的原液的顏色為淺棕色，另外對原液進行生化檢測，結果顯示戊二醛的含量小于0. 01克每升同時并未檢測到賴氨酸，達到2005版《中國藥典QOlO年版)》三部規定的標準。對照方法利用傳統的透析方法純化脫毒后的百日咳抗原溶液將脫毒后的抗原溶液分裝包扎于透析袋中，置0. 85%無菌氯化鈉溶液中，于2 8°C透析至抗原為淺棕色。表1 :SLP膜柱超濾實驗數據(物料體積6000ml)
權利要求
1.一種對脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行純化的方法，包括以下步驟步驟一、預調整在0-18°C，優選為4-12°C條件下進行以下操作向脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液中添加氯化鈉溶液，使脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液的電導率調整至 20-100mS/cm，向脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液中添加磷酸鹽，使脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液的PH調整至6. 5-8. 5 ；所述的氯化鈉溶液的pH值為6. 5-8. 5，濃度為0. 15-1摩爾每升，所述的磷酸鹽為磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉；步驟二、超濾濃縮采用中空纖維超濾系統對經步驟一處理的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行超濾濃縮，使百日咳抗原溶液中的蛋白氮含量為每毫升200-700微克時，進行步驟三的操作；所述的采用中空纖維超濾系統對經步驟一處理的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行超濾濃縮的具體方法是將經步驟一處理的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液注入中空纖維超濾系統的儲罐(1)中，并將中空纖維超濾系統儲罐(1)中的百日咳疫苗抗原溶液的溫度控制在0-18°C ；所述的中空纖維超濾系統的中空纖維膜柱(5)的截留分子量在1 萬-30萬；啟動隔膜泵0)，調節帶有流速監測裝置的濾出閥(4)和隔膜泵( 使濾出閥 (4)所帶流速監測裝置顯示的切向流速在15-40LMH范圍內，至超濾濃縮后的百日咳抗原溶液中的蛋白氮含量為每毫升200-700微克時，進行步驟三的操作；步驟三、洗濾向中空纖維超濾系統的儲罐(1)中添加洗濾液進行洗濾，調節濾出閥 (4)和隔膜泵O)的速度來控制濾出液的流速，使濾出液的流速與洗濾液的添加速度一致，在洗濾過程中不定時取樣檢測洗濾后的百日咳抗原溶液中的脫毒劑的含量和洗濾后的百日咳抗原溶液的顏色，脫毒劑的含量和洗濾后的百日咳抗原溶液的顏色符合《中國藥典 (2010年版)》規定的“稀釋成成品后游離甲醛含量應不高于0. 2g/L，戊二醛含量應小于 0. 01g/L、外觀為淡棕色”的條件時，則停止洗濾；所述的洗濾液為pH值為6. 5-8. 5、濃度為 0. 15-1摩爾每升的氯化鈉溶液，洗濾結束后，收集中空纖維系統中的溶液得到洗濾后的百曰咳抗原溶液；步驟四、淋洗回收用洗濾液對中空纖維超濾系統進行淋洗，將淋洗得到的淋洗液和經步驟三得到的洗濾后的百日咳抗原溶液合并得到純化的百日咳疫苗抗原溶液，所述的洗濾液為PH值為6. 5-8. 5、濃度為0. 15-1摩爾每升的氯化鈉溶液；上述步驟二、步驟三和步驟四應在0. 5-3小時完成，優選1-2小時完成。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟一中，將脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液的電導率調整至30-70mS/cm。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟一中，所述的氯化鈉溶液的濃度為 0. 5摩爾每升。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟二中，所述的中空纖維超濾系統的中空纖維膜柱(5)的截留分子量為5萬-15萬。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟二中，調節濾出閥⑷和泵(2)使超濾濃縮過程中的切向流速控制在20LMH。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟二中，至超濾濃縮后的百日咳抗原溶液中的蛋白氮含量為每毫升300-500微克時，進行步驟三的操作。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟二中，將中空纖維超濾系統儲罐 (1)中的百日咳疫苗抗原溶液的溫度控制在4-12°C。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三或/和步驟四中所用氯化鈉溶液的濃度為0.5摩爾每升。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟二中采用中空纖維超濾系統是由儲罐(1)、泵O)、進樣閥(3)、濾出閥G)、中空纖維膜柱(5)和回流閥(6)組成，在儲罐⑴ 的外部安裝有內設冷凝水循環通道的夾套(7)，夾套(7)可以通過夾套中的冷凝水循環對儲罐(1)中的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行降溫。
10.根據權利要求1或10所述的方法，其特征在于，步驟二中對中空纖維超濾系統儲罐(1)中的百日咳疫苗抗原溶液的溫度進行控制的具體方法是通過設置在中空纖維超濾系統儲罐(1)的外部的其內設置有冷凝水循環通道的夾套(7)中的冷凝水循環對儲罐(1) 中的脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行降溫。
全文摘要
本發明提供的對脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液進行純化的方法，包括對脫毒后的百日咳疫苗抗原溶液的電導率和pH進行預調整、采用中空纖維超濾系統進行超濾、用洗濾液對中空纖維超濾系統進行洗濾和淋洗等步驟，將洗濾后的百日咳抗原溶液和淋洗得到的淋洗液合并即得到純化的百日咳疫苗抗原溶液。本發明采用中空纖維超濾法對脫毒后的無細胞百日咳抗原溶液進行純化，除去脫毒劑和在脫毒過程中產生的色素分子。對利用此法純化得到的百日咳疫苗原液進行檢測，其戊二醛、賴氨酸含量和原液外觀均達到《中國藥典(2010年版)》三部規定的標準。該方法具有工作效率高、回收率高、產品的效價高、適合工業化生產、可實現全封閉操作降低污染風險等特點。
文檔編號A61P31/04GK102443572SQ20111032259
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者曾凱, 李新國, 熊薇, 胡業勤, 薛紅剛, 項美娟, 龔靜 申請人:武漢生物制品研究所有限責任公司