百日咳疫苗保護性抗原的重組表達及其應用的制作方法

專利名稱：百日咳疫苗保護性抗原的重組表達及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，具體地說涉及通過基因工程方法獲得百日咳桿菌保護性抗原蛋白，并將其用于百日咳疫苗的生產。
背景技術：
百日咳是由百日咳桿菌引起的一種嚴重呼吸系統傳染病，百日咳疫苗是預防百日咳最有效和最經濟的手段。據世界衛生組織(WHO)統計報道，現在全世界每年仍有3500萬的百日咳患者，其中高達32.5萬的兒童死于百日咳及其并發癥，且90％的病例來自不發達國家和發展中國家。近年來，在即使疫苗覆蓋率很高的國家，仍然存在發病率上升的趨勢，局部還有爆發性的流行，成人和青少年的百日咳病例數也急劇增加，被稱為“百日咳再現(re-emerge)”。
傳統的全細胞疫苗由于其較嚴重的副作用而促進了新一代百日咳疫苗——無細胞疫苗(APV)的發展，無細胞百日咳疫苗自身具有免疫效果好且副反應小的優點，由此決定無細胞百日咳疫苗必將逐漸替代全細胞疫苗。WHO推薦的無細胞疫苗包括PT、FHA(絲狀血凝素)、PRN、FIM2和FIM3五種抗原，其中，百日咳毒素(PT)為APV的主要成分。
理想的百日咳疫苗應是由抗原成分明確，具有良好的免疫原性及保護效果而無毒性作用的百日咳抗原組成。1981年，日本Sato首先研制成功含PT和FHA兩種組分的無細胞百日咳疫苗(APV)并在日本推廣使用至今，預防效果良好。美國于1992年從日本引進該疫苗用于2歲以上兒童的加強免疫接種。我國何長民等繼日本之后，于1989年研制成含PT和FHA兩種主要免疫原的APV。近十多年來，英、美、瑞典、意大利、加拿大等國家均對APV中各種保護性抗原PT、FHA、PRN和FIM的致病機理及免疫保護效果展開深入研究。
近年的研究顯示，百日咳致病和免疫機理復雜，體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫都在百日咳的免疫中都發揮著重要的作用。據Mills報道，APV免疫后的早期免疫效果是有多種抗原抗體介導的，可限制細菌定居范圍，并減輕對上皮細胞和免疫細胞的毒性損害。但后期細菌的清除必須依賴B細胞及其產物的產生的細胞免疫反應。自然感染百日咳可引起血清和局部分泌性免疫應答，說明局部的粘膜免疫在百日咳免疫中也起著重要的作用，但是接種疫苗后只能引起血清免疫應答卻不產生分泌性抗體。
研究百日咳疫苗生產菌株的基因背景，增加APV中有效抗原成分并系統地評價其免疫保護作用，以及建立靈敏特異的血清學檢定方法用于疫苗生產過程的質量控制和臨床效力評價，不僅是百日咳基礎研究的熱點，同時也是自主發展我國疫苗必須解決的關鍵點。目前國內外對重組PRN和FIM的免疫保護性研究較少，國內還沒有關于重組FIM的研究報道。采用基因工程技術開發的新一代百日咳基因工程疫苗，不僅是科技發展的必然趨勢，而且對最終控制和消滅百日咳具策略意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種從百日咳桿菌CS菌株中分離的，利用基因工程方法獲得的重組PRN，具有良好的免疫原性及保護效果。
本發明的另一目的，采用基因工程技術開發生產的百日咳基因工程疫苗，含有上述的重組PRN，以及重組FIM2、FIM3，可以解決用百日咳培養物上清液純化抗原制備方法中的有效成分的產量有限，純化工藝比較復雜，抗原變異等問題。
百日咳桿菌CS菌株是我國50年代自己分離的，也是目前我國用于APV生產的唯一菌株。APV(無細胞百日咳疫苗)產生的特異性抗體譜窄于WPV(全細胞百日咳疫苗)，因此，對APV所包含抗原的基因背景的研究關系到APV的長期保護性評價。
本發明人從百日咳桿菌CS菌株分離了APV中的三種保護性抗原組分PRN、FIM2和FIM3基因。PRN的基因序列是2031bp，其中可顯示，發生T-C的突變，Regionl多態區含5個GGXXP，Region2多態區含4個PQP。
1 GACTGGAACA ACCAGTCCAT CGTCAAGACC GGTGAGCGCC AGCATGGCAT CCATATCCAG61 GGCTCCGACC CGGGCGGCGT ACGGACCGCC AGCGGAACCA CCATCAAGGT AAGCGGCCGT121 CAGGCCCAGG GCATCCTGCT AGAAAATCCC GCGGCCGAGC TGCAGTTCCG GAACGGCAGT181 GTCACGTCGT CGGGACAGTT GTCCGACGAT GGCATCCGGC GCTTTCTGGG CACCGTCACC241 GTCAAGGCCG GCAAGCTGGT CGCCGATCAC GCCACGCTGG CCAACGTTGG CGACACCTGG301 GACGACGACG GCATCGCGCT CTATGTGGCC GGCGAACAGG CCCAGGCCAG CATCGCCGAC361 AGCACCCTGC AGGGCGCTGG CGGCGTGCAG ATCGAGCGCG GCGCCAATGT CACGGTCCAA421 CGCAGCGCCA TCGTCGACGG GGGCTTGCAT ATCGGCGCCC TGCAGTCATT GCAGCCGGAA481 GACCTTCCGC CCAGCCGGGT GGTGCTGCGC GACACCAACG TGACCGCCGT GCCCGCCAGC541 GGCGCGCCCG CGGCGGTGTC TGTGTTGGGG GCCAGTGAGC TTACGCTCGA CGGCGGGCAC601 ATCACCGGCG GGCGGGCAGC GGGGGTGGCG GCCATGCAAG GGGCGGTCGT GCATCTGCAG661 CGCGCGACGA TACGGCGCGG GGACGCGCCT GCCGGCGGTG CGGTTCCCGG CGGTGCGGTTRegion 1721CCCGGTGGTG CGGTTCCCGG CGGCTTCGGT CCCGGCGGCT TCGGTCCCGT CCTCGACGGC781 TGGTATGGCG TGGACGTATC GGGCTCCAGC GTGGAGCTCG CCCAGTCGAT CGTCGAGGCG841 CCGGAGCTGG GCGCCGCAAT CCGGGTGGGC CGCGGCGCCA GGGTGACGGT GTCGGGCGGC901 AGCTTGTCCG CACCGCACGG CAATGTCATC GAGACCGGCG GCGCGCGTCG CTTTGCGCCT961 CAAGCCGCGC CCCTGTCGAT CACCTTGCAG GCCGGCGCGC ATGCCCAGGG GAAAGCGCTG1021 CTGTACCGGG TCCTGCCGGA GCCCGTGAAG CTGACGCTGA CCGGGGGCGC CGATGCGCAG1081 GGCGACATCG TCGCGACGGA GCTGCCCTCC ATTCCCGGCA CGTCGATCGG GCCGCTCGAC1141 GTGGCGCTGG CCAGCCAGGC CCGATGGACG GGCGCTACCC GCGCGGTCGA CTCGCTGTCC1201 ATCGACAACG CCACCTGGGT CATGACGGAC AACTCGAACG TCGGTGCGCT ACGGCTGGCC1261 AGCGACGGCA GCGTCGATTT CCAGCAGCCG GCCGAAGCTG GGCGGTTCAA GGTCCTGACG1321 GTCAATACGC TGGCGGGTTC GGGGCTGTTC CGCATGAATG TCTTCGCGGA CCTGGGGCTG1381 AGCGACAAGC TGGTCGTCAT GCAGGACGCC AGCGGCCAGC ACAGGCTGTG GGTCCGCAAC1441 AGCGGCAGCG AGCCGGCCAG CGCCAACACC CTGCTGCTGG TGCAGACGCC ACTAGGCAGC1501 GCGGCGACCT TTACCCTTGC CAACAAGGAC GGCAAGGTCG ATATCGGTAC CTATCGCTAT1561 CGATTGGCCG CCAACGGCAA TGGGCAGTGG AGCCTGGTGG GCGCGAAGGC GCCGCCGGCG1621 CCCAAGCCCG CGCCGCAGCC GGGTCCCCAG CCGCCGCAGC CGCCGCAGCCGCAGCCGGAARegion 21681 GCGCCGGCGC CGCAACCGCC GGCGGGCAGG GAGTTGTCCG CCGCCGCCAA CGCGGCGGTC1741 AACACGGGTG GGGTGGGCCT GGCCAGCACG CTCTGGTACG CCGAAAGCAA TGCGTTGTCC1801 AAGCGCCTGG GCGAGTTGCG CCTGAATCCG GACGCCGGCG GCGCCTGGGG CCGCGGCTTC1861 GCGCAACGCC AGCAGCTGGA CAACCGCGCC GGGCGGCGCT TCGACCAGAA GGTGGCCGGC1921 TTCGAGCTGG GCGCCGACCA CGCGGTGGCG GTGGCCGGCG GACGCTGGCA CCTGGGCGGG1981 CTGGCCGGCT ATACGCGCGG CGACCGCGGC TTCACCGGCG ACGGCGGCGG C本發明以百日咳桿菌CS菌株基因組為模板，采用PCR方法，擴增APV中的三種保護性抗原組分PRN、FIM2和FIM3基因，克隆入T載體，構建重組克隆質粒并轉化入大腸桿菌。陽性菌株經PCR和雙酶切方法鑒定，下一步進行體外表達，表達產物免疫學活性分析及基因工程疫苗的研究，都將奠定良好的基礎。
本發明利用基因工程技術，分別構建了PRN、FIM3、FIM2和FIM2-FIM3融合基因的原核表達質粒轉入大腸桿菌，IPTG誘導表達目的蛋白PRN、FIM2、FIM3和FIM2-FIM3融合蛋白，繼而純化目的蛋白并用免疫印跡和ELISA方法檢測所獲蛋白的抗原性。
采用小鼠鼻腔攻擊和腦腔攻擊試驗對四種重組蛋白的免疫保護性進行了評價，檢測免疫后小鼠血清總IgG抗體產生情況，外周血細胞因子濃度及通過CD4+和CD8+T淋巴細胞表型分析來評價四種重組蛋白免疫原性。結果證實重組PRN具有良好的免疫保護性，重組FIM2、FIM3和FIM2-FIM3具有一定的免疫保護性；四種重組蛋白都具有良好的免疫原性，都可以誘導免疫后小鼠產生高滴度的特異性抗體；四種重組蛋白都可誘導細胞免疫反應，刺激小鼠體內產生較高水平IL-2的和低水平的TNF-α，CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群和佐劑對照組相比都有增高。
將PRN、FIM2和FIM3三種重組蛋白的一種或同種按一定濃度比例配比作為具有免疫性的抗原成分加入到疫苗中，可以得到良好的免疫原性和保護性。三種組分的濃度比是PRN∶FIM2∶FIM3＝(2～10)∶(1～5)∶(1～5)；還可以將PRN、FIM2、FIM3和FIM2-FIM3重組蛋白作為疫苗的抗原組分。
本發明為我國的APV增加PRN、FIM2和FIM3抗原組分，提高我國APV的免疫保護效果，符合百日咳疫苗發展趨勢。利用基因工程方法制備PRN、FIM2和FIM3抗原成分，可以解決用百日咳培養物上清液純化抗原制備方法中的有效成分的產量有限，純化工藝比較復雜，抗原變異等問題。


圖1是本發明pGEM-T Easy-目的基因重組克隆質粒構建示意圖。
圖2是本發明的重組蛋白的重組表達質粒構建示意圖；其中圖2-1是PQE-30-PRN重組質粒構建示意圖；圖2-2是pET-3a(+)-FIM2重組質粒構建示意圖；圖2-3是pQE-30-FIM3重組質粒構建示意圖；圖2-4是pET-30a(+)-FIM2-FIM3重組質粒構建示意圖。
圖3是本發明PRN的SDS-PAGE凝膠掃描分析圖；圖中，1.攜帶pQE-30空載體的E.coli溶解產物)；2.未誘導的攜帶pQE-30/Prn的E.coli溶解產物；3.攜帶pQE-30/Prn的E.coli誘導后溶解產物4.攜帶pQE-30/Prn的E.coli誘導后超聲和離心后上清；5.攜帶pQE-30/Prn的E.coli誘導后超聲和離心后沉淀6.純化后重組蛋白。
圖4是本發明FIM2的SDS-PAGE凝膠掃描分析圖；其中圖中，1.攜帶PET-30a(+)空載體的E.coli溶解產物2.未誘導的攜帶PET-30a(+)/FIM2的E.coli溶解產物3.攜帶PET-30a(+)/FIM2的E.coli誘導后溶解產物4.攜帶PET-30a(+)/FIM2的E.coli誘導后超聲和離心后上清5.攜帶PET-30a(+)/FIM2的E.coli誘導后超聲和離心后沉淀6.純化后重組蛋白。
圖5是本發明FIM3的SDS-PAGE凝膠掃描分析圖；其中圖中，1.攜帶PQE-30空載體的E.coli溶解產物；2.未誘導的攜帶PQE-30/FIM3的E.coli溶解產物；3.攜帶PQE-30/FIM3的E.coli誘導后溶解產物；4.攜帶PQE-30/FIM3的E.coli誘導后超聲和離心后上清；5.攜帶PQE-30/FIM3的E.coli誘導后超聲和離心后沉淀；6.純化后重組蛋白。
圖6是本發明FIM2-FIM3的SDS-PAGE凝膠掃描分析圖；其中，圖中1.低分子量蛋白Marker；2.攜帶pET-30a空載體的E.coli溶解產物；3.未誘導的攜帶pET-30a(+)/FIM2-FIM3的E.coli溶解產物；4.攜帶pET-30a(+)/FIM2-FIM3的E.coli誘導后溶解產物；5.攜帶pET-30a(+)/FIM2-FIM3的E.coli誘導后超聲和離心后上清；6.攜帶pET-30a(+)/FIM2-FIM3的E.coli誘導后超聲和離心后沉淀；7.純化后重組蛋白。
圖7是本發明重組蛋白的Western Blot(免疫印跡法)鑒定結果；其中，1，3，5，7預染蛋白Marker；2重組蛋白FIM2與抗FIM2單抗特異結合；4重組融合蛋白FIM2-FIM3與抗FIM2單抗特異結合；5重組融合蛋白FIM2-FIM3與抗FIM3單抗特異結合7重組蛋白PRN與抗PRN單抗特異結合。
圖8是FIM2、FIM3、PRN的ELISA鑒定結果。
圖9是FIM2-FIM3的ELISA鑒定結果。
圖10是小鼠鼻腔攻擊保護力試驗(*P＜0.05)。
圖11是小鼠細胞因子的測定(*P＜0.05)。
具體實施例方式
下面將通過實施例對本發明作進一步的描述，這些描述并不是要對本發明內容作進一步的限定。本領域的技術人員應理解，對本發明內容的技術特征所做的等同替換，或相應的改進，仍屬于本發明的保護范圍之內。
實施例1.、PRN、FIM2和FIM3基因的克隆1.1PRN、FIM2和FIM3基因的擴增用全基因組DNA提取試劑盒(Promega公司)從百日咳桿菌CS菌株(中國藥品生物制品檢定所血清室保存)提取百日咳基因組DNA。采用PrimerPremier 5.0軟件設計引物，根據GeneBank報道的百日咳PRN、FIM2和FIM3基因序列(GenBank登錄號分別為J04560、Y00527、X51543)分別設計3對引物如表1表1

由北京賽百盛生物公司合成引物。
進行PCR擴增反應，PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得特異的4條片段。切取含有目的片段的凝膠塊，并用DNA膠回收試劑盒(OMEGA公司)回收。擴增產物的分子量大小與預期相近。PRN，2272bp；FIM2，701bp；FIM3，582bp。
1.2PCR產物的克隆將純化的PCR產物與pGEM-T Easy載體(Promega公司)連接。
pGEM-T Easy-目的基因重組克隆質粒構建示意圖見圖1。構建的重組質粒DNA轉化大腸桿菌DH5α(中國藥品生物制品檢定所血清室保存)，挑取陽性克隆，用質粒提取試劑盒(博大泰克公司)提取質粒，經酶切確定陽性克隆。
將克隆所得CS的PRN基因讀碼框架(2031bp)的序列分析結果顯示它與和GeneBank中相應18株百日咳桿菌基因序列strain Tohama、strainCZ、strain HAV、strain B391(PRN1)、strain B345(PRN2)、strain B343(PRN3)、strain B705(PRN4)、strain B935(PRN5)、strain 18323(PRN6)、strain B567(PRN7)、strain B1092(PRN8)、strain B1679(PRN9)、strainCN5476、strain 99K45、strain DCH132的同源性為99.6～99.9％。推導的氨基酸同源性為99.4～99.7％，與strain B391(PRN1)的核苷酸和氨基酸同源性分別為99.9％和99.7％。
將克隆所得CS的FIM2基因讀碼框架(543bp)的序列分析結果顯示它與和GeneBank中的百日咳桿菌gi33564552(Tohama I)和Y00527(FIM2-1)的核苷酸和氨基酸的同源性均為100％，與AJ420988(FIM2-2)的同源性分別為99.8％和99.5％。與支氣管敗血癥百日咳桿菌RB50(gi33577672)的同源性分別為72.9％和75％，與副百日咳桿菌12822(gi33574803)的同源性分別為72.6％和73.1％。
將克隆所得CS的FIM3基因(416bp)的序列分析結果顯示它與和GeneBank中相應5株百日咳桿菌基因序列X51543(FIM3A)、AY464179(FIM3A*)、AY464180(FIM3B)、AY464181(FIM3C)、gi33564552(TohamaI)、gi3171725(FIM3)同源性為99.5～100％，與6株支氣管敗血癥百日咳桿菌的同源性為95.7％～98.1％，與1株副百日咳桿菌同源性分別為97.6％。
推導的氨基酸同源性為CS與5株百日咳桿菌同源性為97.8～99.3％，與6株支氣管敗血癥百日咳桿菌的同源性分別為93.5％～95.7％。
實施例3.重組表達質粒的構建PCR擴增目的基因，根據GeneBank報道的百日咳PRN，FIM2和FIM3基因序列(GenBank登錄號分別為J04560、Y00527、X51543)，分別設計相應的引物。應用設計的引物分別擴增PRN，FIM2和FIM3基因，構建PRN，FIM2、FIM3和FIM2-FIM3融合基因相應的表達質粒。參見圖2-1、2-2、2-3、2-4，其中，構建原核表達質粒為PRN-PQE30、FIM3-PQE30、FIM2-PET30a和FIM2-FIM3-PET30a。
實施例4.重組蛋白在大腸桿菌中的表達分別將構建好的重組質粒導入大腸桿菌誘導表達，即將重組質粒PRN-PQE30、FIM3-PQE30轉入大腸桿菌M15中，FIM2-PET30a和FIM2-FIM3-PET30a轉入在大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達目的蛋白PRN、FIM2、FIM3和FIM2-FIM3融合蛋白，繼而純化目的蛋白；然后進行SDS-PAGE分析。
4.1重組蛋白FIM2、FIM2-FIM3、FIM3和PRN的表達水平對表達產物進行SDS-PAGE凝膠掃描分析，ImageMaster TotalLab軟件分析測定蛋白表達水平。目的蛋白PRN、FIM2和FIM2-FIM3的表達量占菌體總蛋白的40％以上，FIM3的表達量為25％。見圖3、4、5、6。
4.2表達產物在菌體內的存在形式將誘導表達后的菌體離心收集后，用裂解液洗滌3次后，懸浮，超聲破碎菌體，于4℃、12000rpm離心30min，分別將沉淀和上清進行SDS-PAGE電泳分析，以確定表達產物的存在形式。結果發現，四種重組蛋白大部分都存在于沉淀中，上清中幾乎沒有，說明四種重組蛋白都主要以包涵體的形式存在于菌體中。
實施例5.表達產物的純化5.1包涵體的初步提純和裂解經IPTG誘導4-6小時，4℃，8000rpm離心10min收集菌體。取5g菌體用PBS溶液洗滌3次，以20ml的PBS溶液重新懸浮，冰浴超聲破碎菌體，4℃，12000rpm，離心30min，棄上清，沉淀用TE+0.5％Triton X-100溶液洗滌3次，再用PBS溶液洗去Triton X-100，最后將沉淀溶解于20ml上樣緩沖液(pH7.4，8M尿素，20mM phosphate，0.5M NaCl，10mM imidazole)中，室溫放置2小時，4℃，12000rpm，離心30min，取上清用0.45um的濾膜過濾后進行后續純化。
5.2融合蛋白的分離純化取上清上樣至陰離子交換柱，重組蛋白吸附濃縮到陰離子凝膠柱，NaCl梯度洗脫，收集目的蛋白峰，SDS-PAGE檢測。向目的蛋白峰內加入硫酸銨到終濃度為lmol/L，上疏水凝膠柱純化，梯度降低硫酸銨濃度洗脫蛋白，收集目的蛋白峰，SDS-PAGE檢測。四種重組蛋白根據其理化性質不同，純化條件分別進行優化。
實施例6重組蛋白的抗原性檢測以純化好(90％以上)的重組蛋白進行活性分析。
6.1Western Blot檢測結果可見圖7，重組蛋白FIM2、FIM3和PRN與相應的單克隆抗體有特異性印跡反應，FIM2-FIM3與FIM2單克隆抗體和FIM3單克隆抗體都發生反應。分別在22KD，22.5KD，44.5KD和69KD處有顯色條帶，空載體對照無明顯顯色帶，說明表達的蛋白具有一定的抗原活性。
6.2重組蛋白的ELISA鑒定按常規間接ELISA方法分別將PRN、FIM2和FIM3三種重組蛋白抗原按一定梯度稀釋度包被，封閉后加入相應的抗體(抗PRN單抗、抗FIM2單抗或抗FIM3單抗)，洗滌后再加入酶標二抗，最后底物顯色檢測。結果表明(圖8和9)重組蛋白PRN、FIM2和FIM3與相應的單克隆抗體存在特異反應，融合蛋白FIM2-FIM3與FIM2 mAb和FIM3 mAb都存在特異的免疫反應，說明表達的蛋白具有一定的抗原活性。
實施例7.免疫保護性評價7.1腦腔攻擊試驗將實驗動物分為七組，每組分為三個稀釋度，每個稀釋度NIH小鼠20只，雌雄各半，腹腔注射0.5ml/只。
1)參考百日咳菌苗組2)無細胞百日咳疫苗原液組(陽性對照)3)PRN組 4)FIM2組 5)FIM3組 6)FIM2-FIM3組 7)Prn，Fim2和Fim3混合組8)無細胞百日咳疫苗原液組+PRN 9)無細胞百日咳疫苗原液組+Prn，Fim2和Fim3混合組同時設立毒力對照組(陰性對照)共50只小鼠，10只一小組，分別用攻擊菌80000、8000、800、80、8個攻擊。
實驗程序為1)稀釋A.參考苗(18IU/ml)用生理鹽水稀釋成1.0IU/ml、0.2IU/ml、0.04IU/ml。
B.純化重組蛋白釋成400μg/ml。
C.無細胞百日咳原液(陽性對照疫苗，北京生物制品研究所)，稀釋成濃度為6.12μg/ml。
D.攻擊菌用蛋白胨水稀釋成每0.03ml含菌80000，做為實驗組的攻擊菌液。然后再連續稀釋，使每0.03ml含菌8000、800、80和8個菌，用上面5個稀釋度菌液作為對照組的攻擊菌液，用于測定攻擊菌液的LD50。
2)吸附將400μg/ml的重組蛋白與3.06μg/ml無細胞百日咳原液分別與2mg/ml的Al(OH)3等體積混合，4℃磁力攪拌過夜。然后分別進行連續5倍稀釋。使重組蛋白成為200μg/ml、40μg/ml和8μg/ml，無細胞百日咳原液成為蛋白氮為3.06μg/ml、0.612μg/ml、0.1204μg/ml。三種重組蛋白按濃度比例配比，即PRN∶FIM2∶FIM3＝(2～10)∶(1～5)∶(1～5)總濃度為200μg/ml的重組蛋白與2mg/ml的Al(OH)3等體積混合，也連續5倍稀釋，應用上述已稀釋的無細胞百日咳原液與200μg/ml PRN混合后再與與Al(OH)3混合乳化后，也連續5倍稀釋成為三個濃度的稀釋度。同樣，應用上述已稀釋的無細胞百日咳原液與PRN∶FIM2∶FIM3三種重組蛋白混合后再與Al(OH)3混合乳化后，也連續5倍稀釋成為三個濃度的稀釋度。
3)免疫。用不同稀釋度的重組蛋白樣品、參考苗和陽性對照疫苗腹腔免疫小鼠，每稀釋度20只(雌雄各半)每只腹腔注射0.5ml。同時飼養100只健康小鼠作為對照組。
4)攻擊免疫21天后，每只小鼠腦腔攻擊80000個細菌/0.3ml菌液。同時進行小鼠毒力對照攻擊，每個稀釋度攻擊10只。
5)觀察于攻毒后第三天將動物挑成每組16只小鼠，每天觀察動物死亡情況并紀錄。
6)統計結果于攻毒后第14天統計動物死亡數據。凡有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯松毛的小鼠均按死亡計算。
7)效力計算使用計算機專用軟件，按平行線法計算重組蛋白的效價。
8)實驗成立條件A.標準和待檢樣品的ED50應在最大和最小之間。
B.待檢樣品和標準疫苗的劑量反應曲線在平行性及直線性上無明顯偏差。
C.按Reed-Muench法計算LD50，一個LD50的菌數應不高于800個菌，不低于80個菌。
D.攻擊毒力的范圍應在100-1000LD50之間。
毒菌攻擊14天后，小鼠存活數量統計如表2所示用攻擊菌80000個細菌/0.3ml的攻擊劑量攻擊的對照組小鼠均全部死亡，而PRN組、Prn，Fim3、Fim2和Fim3混合試驗組、無細胞百日咳疫苗原液組、無細胞百日咳疫苗原液組+PRN、無細胞百日咳疫苗原液組+Prn，Fim2和Fim3混合實驗組動物均有存活，說明重組抗原具有一定的保護性。其中無細胞百日咳疫苗原液組+PRN、無細胞百日咳疫苗原液組+Prn，Fim2和Fim3混合實驗組動物存活數較無細胞百日咳疫苗原液實驗組多，證明混合多種抗原的實驗組的免疫保護性效果好一些。
表2.試驗動物腦腔攻擊實驗結果

7.2鼻腔攻擊試驗將實驗動物分為5組，每組分為2個稀釋度(稀釋度2和3)，每個稀釋度NIH小鼠10只，雌雄各半，腹腔注射0.5ml/只。
1)PRN組；2)FIM2組；3)FIM3組；4)FIM2-FIM3組；5)Prn，Fim2和Fim3混合組；6)無細胞百日咳疫苗原液組；7)無細胞百日咳疫苗原液組+PRN；8)無細胞百日咳疫苗原液組+Prn，Fim2和Fim3混合組，同時設立陰性對照10只小鼠，雌雄各半。
實驗程序為1)稀釋A.按上述方法稀釋純化重組蛋白和無細胞百日咳疫苗原液。
B.吸附按上述方法將已稀釋重組蛋白或無細胞百日咳疫苗原液與2mg/ml的Al(OH)3等體積混合，4℃磁力攪拌過夜。然后分別進行連續5倍稀釋。但實驗組的稀釋度保持2和3兩個稀釋濃度。
2)免疫用不同稀釋度的重組蛋白樣品分別在第0天和第14天，腹腔免疫小鼠。
3)攻擊兩周后用濃度為2×107CFU/ml百日咳桿菌18323鼻腔攻擊小鼠。每只50μl。
4)攻擊一周后，在無菌條件下取每組5只小鼠肺，并進行研磨成懸液，應用有限稀釋法進行計算每只小鼠的肺部細菌克隆數，結果進行統計分析。
如圖10所示，結果顯示PRN組、Prn，Fim2和Fim3混合試驗組、無細胞百日咳疫苗原液組、無細胞百日咳疫苗原液組+PRN、無細胞百日咳疫苗原液組+Prn，Fim2和Fim3混合組與對照組之間有顯著性差異，說明重組抗原具有一定的保護性。其中無細胞百日咳疫苗原液組+PRN、無細胞百日咳疫苗原液組+Prn，Fim2和Fim3混合實驗組小鼠肺部的細菌克隆數較無細胞百日咳疫苗原液組少，證明混合多種抗原的實驗組較含有PT和FHA的無細胞百日咳疫苗原液實驗組的免疫保護性效果好一些。
實施例8.重組蛋白免疫原性評價血清抗體ELISA檢測方法的建立將重組蛋白以20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和2μg/ml的濃度包被酶標板，單克隆抗體稀釋為1∶100、1∶1000和1∶5000，做間接ELISA進行棋盤滴定。由P/N比值大于2.1的最高稀釋度確定合適的包被濃度。
表3重組抗原包被濃度的確定

最終根據結果確定四種重組蛋白的最合適的包被濃度為2μg/ml。
8.1總IgG抗體的測定將小鼠分為4組，每組30只，四種抗原與佐劑吸附好后，PRN組、FIM2組、FIM3組、FIM2-FIM3組和Prn，Fim2和Fim3混合組，每只小鼠腹腔分別免疫100μg、20μg和4μg純化蛋白，每個稀釋度免疫十只小鼠，分別在0天和14天免疫兩次，同時設定陰性對照佐劑Al(OH)3組5只小鼠。第二次免疫小鼠一周后，內眥取血，用以上建立的ELISA檢測方法檢測血清總IgG抗體，四種重組都可刺激小鼠產生高滴度的抗體，其中PRN和FIM2產生的中和抗體滴度高于FIM3，FIM2-FIM3融合蛋白產生的抗FIM2中和抗體滴度高于產生的抗FIM3中和抗體，這可能與FIM2的抗原反應性高于FIM3有關。經加強免疫的小鼠抗體滴度高于免疫一次的小鼠，而且在一定范圍內，抗體滴度隨免疫劑量的增加而增加。
表4不同免疫劑量組小鼠血清抗體滴度

8.2小鼠外周血細胞因子的檢測將小鼠分為7組，每組5只，分別為與佐劑吸附后的PRN組、FIM2組、FIM3組、FIM2-FIM3組、Prn，Fim2和Fim3混合組和佐劑Al(OH)3組，其中PRN組、FIM2組、FIM3組、FIM2-FIM3組和Prn，Fim2和Fim3混合組中，每只小鼠腹腔免疫20μg純化蛋白，第21天(攻毒前)，取血并分離血清，用ELISA方法檢測細胞因子IFNγ、IL-2IL-4和TNF-α。
采用深圳晶美生物工程公司的小鼠細胞因子ELISA檢測試劑盒進行檢測。具體方法如下1)確定本次實驗檢測所需的已知包被抗體的酶標板孔數目，并增加一孔TMB空白顯色空。
2)將2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。直接加不同培養時間取出的脾細胞培養上清，100μl/孔。
3)酶標板加蓋，37℃反應120分鐘，反應后吸棄酶標板內的液體，不洗。
4)將準備好的生物素抗小鼠白介素2抗體工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白顯色孔除外)。37℃反應60分鐘。0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
5)將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白顯色孔除外)。37℃反應30分鐘。0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
6)按每孔90μl依次加入TMB顯色液，37℃避光反應25-30分鐘。按每孔100μl依次加入TMB終止液，此時藍色立轉黃色。
7)酶標儀在450nm測定OD值，根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。
如圖11的結果顯示，PRN、FIM2、FIM3、FIM2-FIM3、Prn，Fim2和Fim3混合組的重組蛋白都可誘導細胞免疫反應，刺激小鼠體內產生較高水平IL-2的和低水平的TNF-α。
8.3流式細胞儀檢測免疫小鼠后外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞表型取NIH雌性小鼠30只，隨機分為5組，6只/組。按分組情況分別腹腔注射吸附好佐劑的重組蛋白PRN(20μg)、FIM2(20μg)、FIM3(20μg)、FIM2+FIM3(20μg)，Prn、Fim2和Fim3混合組和Al(OH)3佐劑。在注射后的第7天取內眥靜脈血，檢測T淋巴細胞表型的變化。實驗步驟如下1)小鼠摘眼球采血，取2ml加入含有EDTA的抗凝管中，振蕩搖勻。
2)熒光抗體標記取抗凝血25μl加入PE管中，樣品管中分別加入抗鼠CD4:FITC/CD3:RPE雙標記抗體和抗鼠CD8:FITC/CD3:RPE雙標記抗體各5μl，充分混勻，室溫避光孵育30分鐘。同時做未免疫的正常小鼠外周血的同型對照，以消除非特異反應。
3)各管中分別加入紅細胞裂解液1ml，室溫避光放置15分鐘，充分裂解紅細胞。1000rpm離心5min，盡棄上清。
4)加入2ml PBS洗液重懸細胞，1000轉/分，離心5分鐘，棄上清。同法再洗滌兩次。洗3次后，用0.5ml PBS重懸。
5)流式細胞儀測定10000個細胞。
表5免疫后小鼠外周血細胞CD4+和CD8+T細胞亞群測定

用流式細胞儀直接免疫熒光測定CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群，結果顯示，小鼠在免疫7天后，外周血中PRN組、FIM2組、FIM3組、FIM2-FIM3組和混合實驗組小鼠的CD4+及CD8+T細胞亞群和佐劑對照組相比都有增高，均能增強小鼠的免疫反應。
據Storsaeter等報導，疫苗的保護效果也與血清中PRN、FIM2和FIM3的IgG抗體顯著相關。在我們的研究中，四種重組蛋白都可刺激小鼠產生高滴度的中和抗體，其中PRN和FIM2產生的中和抗體滴度高于FIM3，FIM2-FIM3融合蛋白產生的抗FIM2中和抗體滴度高于產生的抗FIM3中和抗體，這可能與FIM2的抗原反應性高于FIM3有關。Prn，Fim2和Fim3重組抗原混合實驗組的結果顯示刺激小鼠的產生抗體水平也較高。百日咳的免疫不僅僅是體液免疫，細胞免疫也起著舉足輕重的作用。PRN、FIM2、FIM3、FIM2-FIM3、Prn，Fim2和Fim3混合實驗組的結果顯示均可誘導一定的細胞免疫反應，刺激小鼠體內產生較高水平IL-2的(P＞0.05)和低水平的TNF-α。實驗動物CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群的測定結果顯示，外周血中PRN組、FIM2組、FIM3組、FIM2-FIM3組和混合實驗組小鼠的CD4+及CD8+T細胞亞群較佐劑對照組相比均有增高，增強了小鼠T細胞的免疫反應能力。
腦腔攻擊免疫保護性實驗結果顯示應用重組抗原免疫的小鼠在使用致死量的百日咳攻擊菌攻擊后僅有小鼠存活，而對照組小鼠卻全部死亡。說明重組抗原具有一定的免疫保護性。在無細胞百日咳疫苗原液+重組PRN實驗組小鼠的存活率(62.5％)和無細胞百日咳疫苗原液+重組PRN，Fim2和Fim3混合組的存活率(64.5％)均高于無細胞百日咳疫苗原液組(52.08％)。
綜合以上試驗結果說明，所得重組PRN、FIM2、FIM3和FIM2-FIM3都具有良好的免疫原性，重組PRN免疫保護性良好，重組FIM2、FIM3和FIM2-FIM3具有一定的免疫保護性。
由于國產無細胞百日咳疫苗原液內主要成分為PT和FHA，可能僅含有極微量的PRN，因此在疫苗中增加重組PRN和/或Fim2和Fim3，可以提高無細胞疫苗的保護效力，且保護效力不會被無細胞疫苗原液中的PT和FHA所覆蓋。在百日咳疫苗中增加重組蛋白PRN和/或FIM2、FIM3、FIM2-FIM3作為抗原成份，其生產工藝為現有技術，在此不做具體描述。
權利要求
1.一種重組蛋白，其編碼的基因是從百日咳桿菌CS菌株中分離的PRN，其基因序列是1 GACTGGAACA ACCAGTCCAT CGTCAAGACC GGTGAGCGCC AGCATGGCAT CCATATCCAG61 GGCTCCGACC CGGGCGGCGT ACGGACCGCC AGCGGAACCA CCATCAAGGT AAGCGGCCGT121 CAGGCCCAGG GCATCCTGCT AGAAAATCCC GCGGCCGAGC TGCAGTTCCG GAACGGCAGT181 GTCACGTCGT CGGGACAGTT GTCCGACGAT GGCATCCGGC GCTTTCTGGG CACCGTCACC241 GTCAAGGCCG GCAAGCTGGT CGCCGATCAC GCCACGCTGG CCAACGTTGG CGACACCTGG301 GACGACGACG GCATCGCGCT CTATGTGGCC GGCGAACAGG CCCAGGCCAG CATCGCCGAC361 AGCACCCTGC AGGGCGCTGG CGGCGTGCAG ATCGAGCGCG GCGCCAATGT CACGGTCCAA421 CGCAGCGCCA TCGTCGACGG GGGCTTGCAT ATCGGCGCCC TGCAGTCATT GCAGCCGGAA481 GACCTTCCGC CCAGCCGGGT GGTGCTGCGC GACACCAACG TGACCGCCGT GCCCGCCAGC541 GGCGCGCCCG CGGCGGTGTC TGTGTTGGGG GCCAGTGAGC TTACGCTCGA CGGCGGGCAC601 ATCACCGGCG GGCGGGCAGC GGGGGTGGCG GCCATGCAAG GGGCGGTCGT GCATCTGCAG661 CGCGCGACGA TACGGCGCGG GGACGCGCCT GCCGGCGGTG CGGTTCCCGG CGGTGCGGTT721 CCCGGTGGTG CGGTTCCCGG CGGCTTCGGT CCCGGCGGCT TCGGTCCCGT CCTCGACGGC781 TGGTATGGCG TGGACGTATC GGGCTCCAGC GTGGAGCTCG CCCAGTCGAT CGTCGAGGCG841 CCGGAGCTGG GCGCCGCAAT CCGGGTGGGC CGCGGCGCCA GGGTGACGGT GTCGGGCGGC901 AGCTTGTCCG CACCGCACGG CAATGTCATC GAGACCGGCG GCGCGCGTCG CTTTGCGCCT961 CAAGCCGCGC CCCTGTCGAT CACCTTGCAG GCCGGCGCGC ATGCCCAGGG GAAAGCGCTG1021 CTGTACCGGG TCCTGCCGGA GCCCGTGAAG CTGACGCTGA CCGGGGGCGC CGATGCGCAG1081 GGCGACATCG TCGCGACGGA GCTGCCCTCC ATTCCCGGCA CGTCGATCGG GCCGCTCGAC1141 GTGGCGCTGG CCAGCCAGGC CCGATGGACG GGCGCTACCC GCGCGGTCGA CTCGCTGTCC1201 ATCGACAACG CCACCTGGGT CATGACGGAC AACTCGAACG TCGGTGCGCT ACGGCTGGCC1261 AGCGACGGCA GCGTCGATTT CCAGCAGCCG GCCGAAGCTG GGCGGTTCAA GGTCCTGACG1321 GTCAATACGC TGGCGGGTTC GGGGCTGTTC CGCATGAATG TCTTCGCGGA CCTGGGGCTG1381 AGCGACAAGC TGGTCGTCAT GCAGGACGCC AGCGGCCAGC ACAGGCTGTG GGTCCGCAAC1441 AGCGGCAGCG AGCCGGCCAG CGCCAACACC CTGCTGCTGG TGCAGACGCC ACTAGGCAGC1501 GCGGCGACCT TTACCCTTGC CAACAAGGAC GGCAAGGTCG ATATCGGTAC CTATCGCTAT1561 CGATTGGCCG CCAACGGCAA TGGGCAGTGG AGCCTGGTGG GCGCGAAGGC GCCGCCGGCG1621 CCCAAGCCCG CGCCGCAGCC GGGTCCCCAG CCGCCGCAGC CGCCGCAGCC GCAGCCGGAA1681 GCGCCGGCGC CGCAACCGCC GGCGGGCAGG GAGTTGTCCG CCGCCGCCAA CGCGGCGGTC1741 AACACGGGTG GGGTGGGCCT GGCCAGCACG CTCTGGTACG CCGAAAGCAA TGCGTTGTCC1801 AAGCGCCTGG GCGAGTTGCG CCTGAATCCG GACGCCGGCG GCGCCTGGGG CCGCGGCTTC1861 GCGCAACGCC AGCAGCTGGA CAACCGCGCC GGGCGGCGCT TCGACCAGAA GGTGGCCGGC1921 TTCGAGCTGG GCGCCGACCA CGCGGTGGCG GTGGCCGGCG GACGCTGGCA CCTGGGCGGG1981 CTGGCCGGCT ATACGCGCGG CGACCGCGGC TTCACCGGCG ACGGCGGCGG C
2.一種百日咳疫苗，其特征在于其中的抗原成分含有權利要求1所述的具有免疫活性的重組蛋白PRN和/或FIM2、FIM3。
3.如權利要求2所述的百日咳疫苗，其特征在于，還含有具有免疫活性的融合蛋白FIM3-FIM3。
4.如權利要求2所述的百日咳疫苗，其特征在于，所述的三種抗原組分的濃度比是PRN∶FIM2∶FIM3＝(2～10)∶(1～5)∶(1～5)。
5.如權利要求2所述的百日咳疫苗，其特征在于，所述的PRN蛋白和FIM3蛋白的PRN、FIM3基因從百日咳桿菌CS菌株中分離，連接入表達載體PQE30，將重組質粒轉入大腸桿菌M15中；然后用IPTG誘導表達后，經親和層析純化得到所需的高純度目的蛋白。
6.如權利要求2所述的百日咳疫苗，其特征在于所述的FIM2蛋白的基因從百日咳桿菌CS菌株中分離，以PET-30a(+)為表達載體，將重組質粒轉入BL21(DE3)中；然后用IPTG誘導表達后，經親和層析純化得到所需的高純度目的蛋白。
7.如權利要求3所述的百日咳疫苗，其特征在于所述的FIM2-FIM3融合蛋白的基因從百日咳桿菌CS菌株中分離，以PET-30a(+)為表達載體，將重組質粒轉入BL21(DE3)中；然后用IPTG誘導表達后，經親和層析純化得到所需的高純度目的蛋白。
全文摘要
本發明涉及通過基因工程方法從百日咳桿菌CS菌株克隆PRN、FIM2和FIM3基因，并利用表達載體獲得的原核表達重組蛋白。將從百日咳桿菌CS菌株克隆得到的PRN、FIM2、FIM3基因分別亞克隆入表達載體中，并構建FIM2－FIM3融合基因表達質粒，分別在大腸桿菌中進行誘導表達。結果顯示，四種重組蛋白均具有良好的免疫保護性和免疫原性，顯示重組PRN和/或FIM2、FIM3可作為百日咳疫苗抗原的活性成分。
文檔編號C07K14/195GK101074442SQ200710098928
公開日2007年11月21日 申請日期2007年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者王雅英, 侯啟明, 徐穎華, 譚亞軍 申請人:中國藥品生物制品檢定所, 張庶民, 雷殿良