專利名稱：一組新的抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一組抗菌肽、其制備方法及在制備治療細菌、真菌、病毒感染的藥物中的應用。
背景技術：
抗菌肽是生物體經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60個氨基酸組成，分子量在2000-7000D左右。隨著醫學免疫學和分子生物學的迅速發展，抗菌肽的研究越來越成為生物技術與生物醫藥領域中的熱門課題。至今為止，在許多動物(尤其是昆蟲)、植物、微生物和人體上已發現了超過200多種抗菌肽，這類短肽不僅對細菌、真菌有廣譜的殺菌作用，而且對病毒、原蟲及癌細胞也有攻擊作用。臨床試驗也表明，在機體感染病菌或可能導致病菌感染的情況下，抗菌肽能快速殺滅已侵入的病菌，并且能阻止病菌的繼續侵染。隨著對抗菌肽一級結構和高級結構研究的不斷深入，已有許多研究者對這些抗菌肽的結構和功能進行研究，發現在模擬膜的疏水環境下，分子中的α “螺旋度與其殺菌活性密切相關。另外研究結果表明抗菌肽是通過破壞膜的完整性使得細菌細胞膜滲漏而殺死細菌(NakajimaY. etal.，J. Biol. Chem, 262 1665-1669 ；ZasloffM. Nature,2002,415 389-395)。因此有人試圖通過增加分子中α-螺旋結構或提高多肽中含正電荷氨基酸的比 歹舌個生白勺$月太(Broth W. B. etal. ,Antimicrobial Agents Chemotherapy, 2001,45 1894-1895 ；HongS. Y. etal.，P印tides，2001，22 :1669_1674)。美國專利6，316，594公開了天然抗菌肽parasinl，它是一種新的從鯰魚中分離出來的，是由鯰魚在表皮損傷時為防止微生物的入侵其上皮粘膜層產生出一種具有很強抗菌作用的多肽，屬于α “螺旋抗菌肽，分子量為2000. 4Da,由19個氨基酸殘基組成，序列為 Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser Ser0盡管專利文獻中的Parasin I對微生物表現出非常有效的廣譜抗菌活性，包括革蘭陽性和革蘭陰性細菌以及真菌，而且沒有任何溶血性。它合成的衍生物也具有有效的活性。但是在我們實驗中卻發現其殺菌活性較低，天然序列很難應用于臨床，但是Parasin I基本沒有溶血性，它的一些相關的序列改造和功能應用方面的開發還進行的較少。所以本發明想通過對Parasin I序列的改造，得到殺菌活性更強的有藥用開發價值的抗菌肽，即可以形成新的專利技術。
發明內容
本發明需要解決的技術問題之一是提供一組抗菌肽。本發明需要解決的技術問題之二是提供一組抗菌肽的制備方法。
本發明需要解決的技術問題之三是公開所述抗菌肽的應用。本發明的發明構思是這樣的我們在經過多次試驗后發現在Parasin I序列中間隔插入疏水性氨基酸和帶正電荷的氨基酸后，形成兩個疏水氨基酸和兩個正電荷氨基酸交替排布的序列，這樣的結構減低毒性并提高殺菌活性。經過改造后篩選到以下12條序列， 抑殺菌試驗證明其殺菌活性有較大的提高。而溶血毒性基本沒有變化，非常有希望用于治療細菌感染的新藥的開發。本發明提供的抗菌肽是在對天然抗菌肽的序列、結構分析的基礎上設計合成的， 它們的這一系列序列被命名為GKV，序列如下
碼基因克隆到載體上，然后在宿主細胞中表達后獲得。其中表達載體可以是質粒或病毒中的一種，宿主細胞可以是原核細胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，宿主細胞也可以是真核細胞、包括酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。制備的抗菌肽可通過質譜鑒定。為了深入研究本發明這類生物學活性抗菌肽的結構與功能關系，利用美國應用系統生物公司生產的Pioneer多肽合成儀制備本發明公開的一組抗菌肽和作為對照的抗菌肽，以進行研究。利用96孔板法檢測多肽的殺菌活性(In Yup Park etc ；FEBS Letters ； 437(1998)258-262)以預先合成的天然抗菌肽 GramicidinS，parasinl, magaininll 為對照，進行殺菌活性檢測。結果表明本發明抗菌肽的殺菌活性強于所述三種天然抗菌肽的殺菌活性。抗菌肽在高效殺菌的同時也有可能作用于高等有機體包括人體細胞，因為抗菌肽的作用方式都是在細胞膜上穿孔使得細胞發生滲漏死亡。所以把抗菌肽能否使紅細胞發生滲漏作為其是否有毒性的一個標準，如果抗菌肽能使紅細胞中的血紅蛋白發生滲漏，就可以通過檢測OD49tl值確定毒性的大小。因此本發明還檢測了抗菌肽對人體紅細胞的溶血活性，實驗表明，抗菌肽溶血率值很低，證實本發明抗菌肽的溶血毒性極小。此外，又對本發明抗菌肽進行動物體內急性毒性試驗，證明抗菌肽無毒性作用。又進行抗菌肽對小白鼠急性感染金黃色葡萄球菌的抑制作用的試驗，表明抗菌肽對金黃色葡萄球菌感染有顯著的抑制作用。本發明提供一組新的人工設計合成的抗菌肽。可方便地采用固相化學法制備或將編碼抗菌肽的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后獲得。該抗菌肽對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、病毒具有廣譜殺傷活性，并較天然抗菌肽有更強的殺菌活性，但對動、植物細胞無任何毒害作用。并通過抗菌肽對金黃色葡萄球菌急性感染殺菌活性的小鼠試驗顯示抗菌肽給予0. 25mg/kg劑量，就能達到100%殺菌抑制率，而作為殺滅金黃色葡萄球菌特效藥的萬古霉素要給予4. Omg/kg劑量才能達到100%的殺菌抑制率，表明本發明抗菌肽對金黃色葡萄球菌急性感染有很顯著的殺菌效果，因此本發明抗菌肽可應用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物。
圖1是抗菌肽GKV-4的質譜圖。
具體實施例方式實施例1抗菌肽的固相化學合成制備及分離純化按上述序列制備GKV-I到GKV-12,同時制備Gramicidins, parasinl和 magaininll作為對照。GramicidinS 的序列Val Orn Leu Phe Pro Val Orn Leu Phe ProParasinl 的序列Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser Sermagaininll 的序列Gly lie Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glulie Met Ash Ser本實施例采用固相化學法合成，所用儀器為美國應用生物系統公司生產的 Pioneer多肽合成儀。合成的多肽經過高濃度的TFA剪切后，用反向柱純化，純化后的多肽通過質譜鑒定。具體試驗步驟如下1、抗菌肽的制備(以制備0. Immol量的GKV-I為例)以下所有制備抗菌肽的試劑均購于美國應用生物系統公司。
制備的GKV-I多肽序列為N-Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys-C制備從C端到N端逐個進行，由合成儀自動控制。首先稱量0. Immol的結合了第一個氨基酸即Arg的樹脂(購于美國應用生物系統公司)，裝柱，再用20%哌啶二甲基甲酰胺溶液脫保護，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保護的游離氨基酸溶解于碳二亞胺(DCC)，羥基苯并三唑(HOBt)/二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循環偶合反應30分鐘，二甲基甲酰胺清洗重復以上脫保護到偶合反應步驟直到制備結束(具體操作步驟見pioneer多肽合成儀操作指南)。制備后的多肽經如下步驟剪切取下反應后的樹脂，加入B型剪切液(88%三氟乙酸，5%苯酚，5%水，2%三異丙基硅烷)，室溫反應2小時，過濾，濾出液中加入10倍體積的預冷無水乙醚，4000轉/分鐘離心10分鐘，收集沉淀并室溫干燥。2、抗菌肽純化稱量一定量干燥后的多肽，溶于0. 三氟乙酸，樣品處理后經反向柱分離(洗脫液為含80%乙氰的0. 1 %三氟乙酸)，收集洗脫峰。實施例2抗菌肽GKV-4基因在大腸桿菌中的表達首先設計合成編碼抗菌肽的GKV-4基因，將其克隆到PGEX-4T1載體上(購自 Amersham Pharmcia Biotech公司)，然后轉化大腸桿菌JM109，經IPTG誘導表達GST-GKV-4 融合蛋白，再經凝血酶切割后，得抗菌肽GKV-4。實施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶，Klenow酶、限制性內切酶除特別指明外均為BIOLAB公司產品，割膠回收試劑盒為上海生工公司產品，寡聚核苷酸為上海生工生物工程技術服務有限公司合成。凝血酶剪切試劑盒購于SIGMA公司。有關DNA的分離、純化、PCR擴增、酶解、質粒轉化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J.沙姆布魯克等編著的《分子克隆實驗指南》進行。大腸桿菌JM109培養在液體或固體的LB培養基中。采用大腸桿菌偏愛的密碼子設計編碼優選抗菌肽GKV-4基因的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GKV-4基因的5’端引入酶切位點BamHI (GGATCC)，在3’端加上終止密碼子 (TAG)，所得構建基因的長度為72bp。通過DNA合成儀直接合成該核苷酸片斷。首先用PCR方法對基因進行擴增。設計一對引物5，-CCTAGGTTTCCACA-3，和 5，-GATGAAGTTTCG-3，。PCR 反應條件如下94°C，30 秒；45 °C，45秒；72 °C，30秒；反應30個循環。PCR反應后將該片斷經過Klenow酶補平后用 BamHI酶切，酶切片斷經過割膠回收后(割膠回收操作參照試劑盒操作說明)與pGEX_4Tl 載體的BamHI和SmaI的雙酶切片斷連接后轉化大腸桿菌JM109，轉化子通過SmaI酶切鑒定、篩選。轉化子經過IPTG誘導表達GST-GKV-4融合蛋白。融合蛋白用GST親合柱純化后經凝血酶切割后得到抗菌肽GKV-4，具體操作參照試劑盒操作說明。GKV-4蛋白序列Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys
6
編碼GKV-4的核苷酸序列AAAGGTGGTTCGTAAAGGCGCCAAACGCCAGGGTTGCAAGAAACTTGCCCGTAAGGCTTTGAAG實施例3抗菌肽GKV-4基因在酵母細胞中的表達本實施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶，Klenow酶、限制性內切酶除特別指明外均為BIOLAB公司產品，割膠回收試劑盒為上海生工公司產品，寡聚核苷酸為上海生工生物工程技術服務有限公司合成。凝血酶剪切試劑盒購于SIGMA公司。設計合成編碼抗菌肽的GKV-4基因，經過BamHI酶切與編碼GST的DNA序列連接，后將其連接到質粒pBluescriptSKII (購自美國Mratagene公司)中，轉化大腸桿菌DH5ci (購自武漢大學菌種保藏中心)，提取質粒經過測序證明序列正確后，質粒經過 EcoRI, XhoI酶切后連接到pPIC9載體(購自美國^witrogen公司)中，后轉化畢氏酵母菌株KM71 (購自美國hvitrogen公司)，甲醇誘導表達融合蛋白GST-GKV-4。有關DNA的分離、純化、PCR擴增、酶解、質粒轉化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J.沙姆布魯克等編著的《分子克隆實驗指南》進行。畢氏酵母菌株KM71培養在液體或固體的BMGY培養基中，甲醇誘導表達融合蛋白GST-GKV-4時酵母菌株培養在BMMY 培養基中，每隔M小時補加甲醇至終濃度為1%。采用酵母菌偏愛的密碼子設計編碼優選抗菌肽GKV-4及GST的DNA序列。在抗菌肽GKV-4基因的5’端引入酶切位點BamHI (GGATCC)，在3’端加上終止密碼子(TAG)及 EcoRI酶切位點(GAATCC)，所得構建基因的長度為78bp，同時在GKV-4基因前段接編碼GST 的DNA序列，同時在GST的DNA序列的5，端加了一個BioI酶切位點。GKV-4核苷酸片斷的制備通過DNA合成儀直接合成編碼GKV-4核苷酸片斷。然后用PCR方法對基因進行擴增。設計一對引物5 ’ -CCTAGGTTTCCACA-3 ’和 5，-CTTAAGGATGAAGTTTCG-3，。PCR 反應條件如下:94 V，30 秒；45°C，45 秒；72°C，30 秒；反應35個循環。編碼GST的DNA序列的的制備設計一對弓|物5’ -CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’5， -CAGTGCTACGCCGGCGAG-3，用以上引物擴增pGEX-4Tl載體。PCR反應條件如下94°C，30秒；45°C，45秒； 72°C，60秒；反應30個循環。擴增片段與質粒的連接將GKV-4的PCR擴增片斷經過Klenow酶補平后用BamHI 和EcoRI酶切，酶切片斷經過割膠回收后(割膠回收操作參照試劑盒操作說明)與編碼GST 的DNA擴增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段連接后與pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI 酶切回收片段連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5a，轉化子經過抗性、藍白斑、酶切鑒定后，進一步經過測序確定表達序列正確。提取質粒經》ιοΙ和EcoRI酶切回收小片段，與pPIC9的 XhoI和EcoRI酶切連接構建成表達質粒pPIC9-gst-GKV-4，轉化大腸桿菌DH5a后經氨芐青霉素抗性篩選轉化子。按文獻報道的方法(Clare JJ, etc.，Gene，1991，105 :205-212)制備畢氏酵母KM71的感受態細胞，并將Mel單酶切的線性化重組質粒pPIC9-gst-GKV-4經電轉化導入感受態細胞，電轉化的條件為1. 5KV，22. 5uF。將電轉化的酵母細胞涂板于YPD 平板，30°C培養兩天后，篩選表達融合蛋白的陽性克隆。轉化子經過甲醇誘導表達GST-GKV-4融合蛋白。融合蛋白用GST親合柱純化后經CN 102391364 A
說明書6/11頁
凝血酶切割后得到抗菌肽GKV-4，具體操作參照試劑盒操作說明, Thr Arg Lys Trp Val Lys Pro Lys lie Ala Met Phe Leu Tyr Cys Phe
Trp Pro
Arg Gly Ala Leu
GST--GKV--4融合蛋白序列LeuGluMetSerProlieLeuGlyTyrTrpLyslieLysGlyLeuValGlnLeuLeuLeuGluTyrLeuGluGluLysTyrGluGluHisLeuTyrGluArgAspGluGlyArgAsnLysLysPheGluLeuGlyLeuGluPheProAsnLeuProTyrTyrlieAspGlyLeuTheGlnSerMetAlalielieArgTyrlieAlaAspLysHisAsnMetLeuGlyGlyGluArgAlaGlulieSerMetLeuGluGlyAlaValLeuAsplieArgTyrGlyValSerTyrSerLysAspPheGluTheLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGluMetLeuGluAspArgLeuCysHisLysTheTyrLeuAsnGlyAspHisValTheHisProAspPheAspAlaLeuAspValValLeuTyrMetAspProMetCysLeuAspAlaPheProLysLeuLysLysArglieGluAlalieProGlnlieAspLysTyrLeuLysSerSerLysTyrlieLeuGlnGlyTrpGlnAlaThePheGlyGlyGlyAspHisProProLysSerAspLeuValSerLysGlyValArgLysGlyAlaLysArgGlnGlyCysLysLysLeuAlaArgLysGST--GK V-4 核苷·陵序列
CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGC
AACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGC
ATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTG
AATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTT
AAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACA
ACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTG
AAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAG
TAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAA
ATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGG
TGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTG
TTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGT
TTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATC
CAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT
GGTGGCGACCAT V CTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTAAAGGTGTTC
GTAAAGGCGCCAAACGCCAGGGTTGCAAGAAACTTGCCCGTAAGGCTTTGAAGTAGGAATTC實施例4抗菌肽的鑒定如圖1所示，制備的抗菌肽GKV-4經過質譜分析，GKV-4在質譜圖中顯示的分子量為23M.0。由多肽序列計算出的理論值為23 . 0。證明制備的多肽即為設計的GKV-4抗菌肽。鑒定合格的抗菌肽產物備用。抗菌肽GKV-1，GKV-2及本發明公開的其它抗菌肽，天然抗菌肽Gramicidins， parasinl和magaininll可以采用GKV-4抗菌肽的制備方法制備。實施例5抗菌肽的殺菌活性檢測以下實施例中所使用的各種菌株購于中國生物制品檢定所。采用96孔板法對抗菌肽的殺菌活性進行檢測，并用固相化學法合成的抗菌肽 Gramicidins (S)，parasinl (I)和magaininll (II)作為對照，并用固相化學合成法合成本發明中的12條抗菌肽GKV-I到GKV-12，檢測它們的殺菌活性。按以下步驟進行測定抗菌肽的殺菌活性菌種復蘇，接種斜面37°C培養過夜，挑菌于普通LB培養基中，37°C培養過夜，稀釋菌液使菌濃度為104-105CFU/ml，按每孔IOOul菌液接種于96孔板中，將多肽以一定比例稀釋后，每孔中加入10ul，將96孔板置于37°C培養過夜，酶標儀檢測OD620值(In Yup Park etc ；FEBS Letters ；437 (1998) 258-262)。檢測結果見表 1。含有抗菌肽的細菌的生長濃度(OD62tl)與不加抗菌肽的細菌的生長濃度的比值大于90%時的抗菌肽濃度即為最小抑菌濃度(最小抑菌濃度(MIC)定義為顯著抑制細菌生長的最低的濃度)。表1幾種抗菌肽對不同細菌的抗菌活性最小抑菌濃度(ug/ml)的比較
權利要求
1.一組抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列為序列表中所示的SEQ ID No.9-11。
2.權利要求1所述抗菌肽的在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染的藥物中應用。
全文摘要
本發明提供一組新的抗菌肽，這些抗菌肽具有比天然抗菌肽更強的殺菌活性，對各種致病菌的殺滅效果都很好。本發明還公開了該組抗菌肽的制備方法，可以用固相化學法合成，也可以通過基因工程表達獲得。本發明合成抗菌肽可以用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物。
文檔編號A61P31/10GK102391364SQ20111035971
公開日2012年3月28日 申請日期2004年11月16日 優先權日2004年11月16日
發明者李國棟, 黃青山 申請人:上海高科聯合生物技術研發有限公司