一種抗菌肽hjh-3及其應用
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種抗菌肽HJH-3及其應用。 二、
【背景技術】：
[0002] 近年來，抗生素的濫用使藥物殘留和細菌耐藥性問題日漸突出，嚴重威脅著畜 牧業發展和人類健康，致使新型抗菌藥物的研發變得更為迫切。抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs)是生物機體在抵御病原微生物時產生的一類防御性小肽，是生物免疫防御 系統的重要組成部分。與傳統抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、熱穩定性好、水溶性好、抗 菌譜廣，不易誘發細菌產生耐藥性，不會產生藥物過敏反應等優點，是目前國際上公認的抗 生素最佳替代品。
[0003] 然而，天然抗菌肽也并非是完美的，大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高，且在發 揮抑菌效果的同時往往對正常的真核細胞也產生毒性，以及溶血作用，這都限制了抗菌肽 的發展應用。因此，目前對抗菌肽的研究重點在于，通過對人工設計的一系列不同抗菌肽類 似物的研究，探明其抑菌、細胞毒性、溶血活性的機制，從而為獲得抑菌活性高、對正常真核 細胞低毒甚至無毒性、無溶血性，高效、安全的抗菌肽奠定理論基礎。
[0004]目前為止，發現的抗菌肽已有2000多種。已測定了幾百種不同抗菌肽的氨基酸序 列，這些抗菌肽在長度、結構、序列上各有明顯的不同，抗菌肽大多由20~40個氨基酸殘基 組成，且其一級結構具有明顯的特征即：肽鏈中間富含Pro,C端富含Gly、Val和Ala等非 極性氨基酸，而N端多含Arg、LyS等極性的氨基酸。因此，他們都表現兩個共同的特征：陽 離子肽；活性結構為兩親性。目前對抗菌肽的作用機理還沒有統一的認識；但是，大多數的 理論都認為其作用機制與其陽離子性和疏水性有關。因此，為了獲得安全、高效的抗菌肽， 本發明主要根據氨基酸的離子性和疏水性，發明了一種抗菌肽HJH-3。 三、
【發明內容】
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[0005] 本發明要解決的技術問題是：提供一種抗菌肽HJH-3及其應用。本發明抗菌肽 HJH-3含有18個氨基酸殘基，不產生溶血性，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真 菌均具有高效的抗菌作用。所以，本發明產品抗菌肽HJH-3在制備抗感染革蘭氏陽性菌、革 蘭氏陰性菌或/和真菌疾病藥物中能夠得到較佳的應用。
[0006] 為了解決上述問題，本發明采取的技術方案為：
[0007] 本發明提供一種抗菌肽HJH-3,所述抗菌肽HJH-3的氨基酸序列為纈氨酸-天冬酰 胺-脯氨酸-賴氨酸-亮氨酸-亮氨酸-絲氨酸-組氨酸-絲氨酸-亮氨酸-亮氨酸-纈 氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-精氨酸-絲氨酸-組氨酸-亮氨酸（SEQIDNO:1)。
[0008] 根據上述的抗菌肽HJH-3,所述抗菌肽HJH-3為直鏈多肽，含有18個氨基酸殘基， 2077. 52Da，等電點為 11. 05。
[0009] 另外，提供一種上述的抗菌肽HJH-3在制備抗感染革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌 或/和真菌疾病藥物中的應用。
[0010] 本發明的積極有益效果：
[0011] 本發明產品抗菌肽HJH-3為直鏈多肽，含有18個氨基酸殘基，2077. 52Da，等電點 11. 05;并且本發明產品不產生溶血性，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌都 具有高效的抗菌作用。所以，本發明產品抗菌肽HJH-3在制備抗感染革蘭氏陽性菌、革蘭氏 陰性菌或/和真菌疾病藥物中能夠得到較佳的應用。
[0012] 本發明抗菌肽HJH-3采用自動多肽合成儀進行固相化學合成法合成，合成方向是 從C端到N端逐一進行，其制備的詳細步驟如下：
[0013]a、樹脂的溶漲：首先將Fmoc-Leu-Wangresin樹脂加入自動多肽合成儀反應器 內，并自動加入二甲基甲酰胺DMF進行溶漲，lgFmoc-Leu-Wangresin樹脂加入DMF的量 約為12mL(保證溶劑DMF能夠完全浸沒樹脂），溶漲時間為10~30min(溶漲可重復1~2 次）；
[0014]b、脫保護：樹脂溶漲后，按照設定將儲罐內的20%哌啶（20%哌啶的配制方法： 哌啶溶于二甲基甲酰胺DMF中配制而成的）自動加入到反應器內浸沒溶漲后的樹脂（lg Fmoc-Leu-Wangresin樹脂需要加入20%哌啶約為10mL)，使其溶漲后的樹脂進行脫保護 (脫保護的時間約為30min)，脫保護后自動加入二甲基甲酰胺進行洗滌；
[0015]c、接著按照抗菌肽HJH-3氨基酸序列的排序自動加入第二種氨基酸組氨酸 Fmoc-His，并自動加入縮合劑HCTU(6-氯苯并三氮唑-1，1，3,3-四甲基脲六氟磷酸酯）和 催化劑NMM或DIEA(NMM中文名稱為N-甲基嗎啡啉，DIEA中文名稱為N，N二異丙基乙胺） 進行縮合反應；反應結束后自動加入二甲基甲酰胺DMF進行反復洗滌，除去未反應的氨基 酸；
[0016] 所述組氨酸與Fmoc-Leu-Wangresin樹脂的摩爾比為5:1;所述縮合劑HCTU與組 氨酸Fmoc-His二者之間的摩爾比為1:1;所述催化劑NMM或DIEA與組氨酸二者之間的摩 爾比為4:1;
[0017] 洗滌后所得產物按照步驟b同樣方法進行脫保護、洗滌，依照步驟c上述同樣方 法依次自動加入氨基酸Fmoc-Ser、Fmoc-Arg、Fmoc-Leu、Fmoc-Thr、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、 Fmoc-Leu、Fmoc-Ser、Fmoc-His、Fmoc-Ser、Fmoc-Leu、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys、Fmoc-Pro、 Fmoc-Asn-和Fmoc-Val進行縮合反應、洗滌，最后一個氨基酸縮合反應、洗滌后，得到多肽 產物；每次縮合反應、洗滌后所得產物均按照步驟b同樣方法進行脫保護、洗滌，然后自動 加入下一個氨基酸進行縮合反應、洗滌（每次縮合反應中，所加入氨基酸與Fmoc-Leu-Wang resin樹脂的摩爾比均為5:1;所述縮合劑HCTU與每種所加氨基酸二者之間的摩爾比均為 1:1 ;所述催化劑NMM或DIEA與每種所加氨基酸二者之間的摩爾比均為4:1);
[0018]d、多肽產物的脫保護和裂解：在步驟c所得多肽產物中自動加入20%哌啶到反應 器內浸沒多肽產物（對lg樹脂進行脫保護使用20%哌啶的量約為10mL)，使其多肽產物進 行脫保護，脫保護后依次自動加入二甲基甲酰胺DMF、二氯甲烷DCM進行反復洗滌；
[0019] 洗滌后自動加入三氟乙酸TFA進行裂解（對lg樹脂進行裂解使用的裂解液TFA 的體積約為20mL)，通過裂解使得多肽從樹脂上裂解下來，裂解后進行過濾（使用砂心漏斗 進行過濾），得到濾液；
[0020] e、合成多肽的沉淀：
[0021]裂解過程結束后，為從三氟乙酸（TFA)裂解后得到的濾液中得到合成的多肽產 物，采用冷乙醚對所得濾液進行洗滌離心沉淀的方法，其具體操作過程為：在步驟d得到的 濾液中加入3倍體積4°C保存的冷乙醚，密封后顛倒混勻，冰浴lOmin，在4000r/m下離心 lOmin，回收剩余沉淀，棄上清液體；重取4°C保存的冷乙醚重懸沉淀；上述步驟反復三次， 然后將所得沉淀干燥12~16h，得到合成肽粗品；
[0022] f、合成肽粗品的純化：采用半制備型高效液相色譜儀為P2000對合成肽粗品進 行過柱純化，收集純度多95%的餾分，即得到純化后的抗菌肽HJH-3,其產品純度抗菌肽 HJH-3的純度彡95% (詳見附圖1分析）。
[0023] 半制備型高效液相色譜儀為P2000是由北京沃華創新科技有限公司提供，其色 譜柱為C18反相柱（4. 6*250mm)，洗脫液（流動相）為A溶液0. 1 %的三氟乙酸乙腈溶液 (0.lmL的三氟乙酸定容到lOOmL乙腈溶液中）和B溶液0. 1%的三氟乙酸水溶液（0.lmL 的三氟乙酸定容到100mL去離子水中），使用上述處理柱，上樣后25min內A溶液的比例由 27%逐步調至52%，B溶液的比例由73%逐步調至48%，25.lmin時，A溶液的比例變為 100%，B溶液變為0%，以lmL/min的流速進行30min的分離，檢測波長為220nm，收集純度 彡95%的餾分（詳見附圖1所示）；
[0024] 本發明所得抗菌肽HJH-3產品的確認鑒定：
[0025] (1)采用分析型液相色譜質譜聯用儀（WatersmicromassZQ-2000)測定所得產品 抗菌肽HJH-3的分子量，經測定：其分子量為2077. 52Da，結果詳見附圖2。
[0026] 質譜測定條件：采用正離子化模式，其毛細管電壓為3. 00KV，毛細管出口電壓 50V，碎裂電壓為5V，干燥氣流量為1. 5L/min，干燥氣溫度為350°C，掃描范圍為400~ 1900m/z〇
[0027] (2)氨基酸序列結構測定：采用自動氨基酸測序儀測定本發明產品抗菌肽HJH-3 的氨基酸序列結構，經測定：HJH-3是直鏈多肽，含有18個氨基酸殘基；HJH-3的全序列為： 纈氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-賴氨酸-亮氨酸-亮氨酸-絲氨酸-組氨酸-絲氨酸-亮氨 酸-亮氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-精氨酸-絲氨酸-組氨酸-亮氨酸（即Val-Asn -Pr〇-Lys-Leu-Leu-Ser-His-Ser-Leu-Leu-Val-Thr-Leu-Arg-Ser-His-Leu)〇
[0028] (3)等電點分析：
[0029]打開DNAStar軟件中的EditSeq，打開file，點擊"new"中的"newprotein"，輸入 本發明產品HJH-3的氨基酸序列，即可以獲得等電點數據。經分析：HJH-3抗菌肽類似物的 等電點為11.05。 四、【附圖說明】：
[0030] 圖1本發明抗菌肽HJH-3產品的高效液相色譜圖；
[0031] 圖2本發明抗菌肽HJH-3產品的質譜圖；
[0032]圖3本發明抗菌肽HJH-3產品臨床分離耐藥菌株的抑菌活性測定圖；
[0033] 圖4本發明抗菌肽HJH-3產品的細菌形態結構影響分析圖。
[0034] 圖4中：a、b、c分別為對數生長期的正常培養大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念 珠菌的電鏡掃描圖；A、B、C分別為抗菌肽HJH-3作用后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色 念珠菌的電鏡掃描圖。 五、【具體實施方式】：
[0035] 以下結合實施例進一步闡述本發明，但并不限制本發明的內容。
[0036] 實施例1 :
[0037] 本發明抗菌肽HJH-3產品為SEQ I