專利名稱：醫用對比劑及含有熒光金納米團簇的微胞的制造方法
技術領域：
本發明是有關于一種診斷藥劑，且特別是有關于一種應用于生醫影像檢查的對比劑或醫用對比劑。
背景技術：
醫用對比劑為在影像檢查時，用來增強身體內流體結構對比的一種物質。微胞對比劑(microbubbles contrast agents)是用來協助超音波顯影。微胞是由一層蛋白質、月旨肪或聚合物包圍少量的空氣、氮氣或全氟碳化物(perfluorocarbon)而組成。在微胞內的氣體與周遭流體界面的密度差異，會強烈地散射及反射超音波，而讓探針接收到強烈的訊號，形成最后的超音波影像。目前美國食品藥物檢查局(Food and Drug Administration ；FDA)通過兩種微胞對比劑。一種為白蛋白的殼層圍繞八氟丙燒(octafIuoropropane)的核心,另一種為脂肪/半乳糖的殼層圍繞空氣的核心。
發明內容
因此，本發明的目的在于嘗試修飾上述現有技術的微胞，合成出多功能對比劑，以提供多種生醫影像檢查之用。根據上述，本發明的一個方面是在于提供一種醫用對比劑，其是由多個含有熒光金納米團簇的微胞所構成，每個微胞具有殼層與核心。每個微胞的殼層包含多個熒光金納米團簇-白蛋白復合物，每個復合物的結構為一層第一白蛋白圍繞熒光金納米團簇。每個微胞的核心填充有空氣或碳氟化物。上述的熒光金納米團簇-白蛋白復合物的結構包含一層第一白蛋白圍繞熒光金納米團簇。此外，上述的熒光金納米團簇-白蛋白復合物的結構還可包含一層保護配位體，位于上述的第一白蛋白層與熒光金納米團簇之間。依據一實施例，上述的微胞的殼層還可以包含一種第二白蛋白，以稀釋上述的熒光金納米團簇-白蛋白復合物的濃度。依據一實施例，上述的第一白蛋白及第二白蛋白可分別為血清白蛋白、卵白蛋白或儲存白蛋白。依據一實施例，上述保護配位體為一非白蛋白分子，例如可為二氫硫辛酸、谷胱甘肽、硫普羅寧、間-2，3- 二巰基丁二酸、苯基乙基硫醇鹽、十二烷硫醇、或巰基i^一烷醇。本發明的另一方面是在于提供一種含有熒光金納米團簇的微胞的制備方法。
依據一實施例，先混合Au3+溶液與第一白蛋白溶液以形成一混合溶液，再加入堿至混合溶液中，以還原Au3+而形成熒光金納米團簇-白蛋白復合物。上述的熒光金納米團簇是被上述第一白蛋白層所保護。接著，分散熒光金納米團簇-白蛋白復合物于水或磷酸鹽緩沖溶液中，以形成分散溶液。然后，超音波震蕩上述的分散溶液，以形成微胞。超音波震蕩的功率為11-24瓦，震蕩時間為1-3分鐘。
依據另一實施例，先合成熒光金納米團簇-配位體復合物，其結構為上述的熒光金納米團簇由上述配位體層所保護。再混合上述熒光金納米團簇-配位體復合物的溶液與第一白蛋白的溶液以形成熒光金納米團簇-白蛋白復合物，其結構為該第一白蛋白環繞上述熒光金納米團簇-配位體復合物。然后，分散熒光金納米團簇-白蛋白復合物于水或磷酸鹽緩沖溶液中，以形成一分散溶液。接著，超音波震蕩上述的分散溶液，以形成微胞。超音波震蕩的功率為11-24瓦，震蕩時間為1-3分鐘。本發明的優點在于本發明將可以放射熒光的熒光金納米團簇整合在微胞的結構中，使含有熒光金納米團簇的微胞可被直接用來做為超音波顯影的對比劑以及血管造影(angiography)的突光劑(fluorescein)。上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容并非本揭示內容的完整概述，且其用意并非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的范圍。在參閱下文實施方式后，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易了解本發明的基本精神及其它發明目的，以及本發明所采用的技術手段與實施態樣。
為讓本發明的上述和其它目的、特征、優點與實施例能更明顯易懂，所附附圖的說明如下圖1A-1B為熒光金納米團簇-白蛋白復合物的剖面結構示意圖；圖1C-1D為依照本發明實施例的微胞的剖面結構示意圖；圖2為依照本發明一實施方式的一種微胞的制備流程圖；圖3A為兩層結構的AuNCOAb復合物的制備流程圖；圖3B為三層結構AuNC@Lg_Ab復合物的一制備流程圖；圖3C為三層結構AuNC@Lg_Ab復合物的另一制備流程圖；圖4為微胞的合成步驟流程圖。其中，主要元件符號說明IOOa :具有兩層結構的熒光金納米團簇_白蛋白復合物IOOb :具有三層結構的熒光金納米團簇-白蛋白復合物110:金納米團簇120 :配位體130:白蛋白140a、140b:微胞150 :核心210、220、230 :步驟310a、320a、330a :步驟310b,320b,330a,340b,350b :步驟310c、320c、330c、340c、350c、360c :步驟410,420,430 :步驟。
具體實施例方式依據上述，提供一種含有熒光金納米團簇的微胞及其制備方法。在下面的敘述中，將會介紹上述的含有熒光金納米團簇的微胞的例示結構與其例示的制造方法。為了容易了解所述實施例之故，下面將會提供不少技術細節。當然，并不是所有的實施例都需要這些技術細節。同時，一些廣為人知的結構或元件，僅會以示意的方式在圖式中繪出，以適當地簡化圖式內容。微胞的結構依據本發明一實施方式，微胞的殼層主要是由多個熒光金納米團簇-白蛋白復合物(fluorescent Au nanocluster-albumin complex)所組成，而且還可以再加入一些白蛋白至殼層中。微胞的核心可填充空氣或碳氟化物(fIuorocarbons),例如可為八氟丙燒(octafluoropropane)。微胞的直徑約為O. 5_20 μ m。若考慮適于用在人體醫藥用途的話，微胞的直徑較佳為O. 5-6 μ m。圖1A-1B為熒光金納米團簇-白蛋白復合物的剖面結構示意圖。熒光金納米團簇-白蛋白復合物可為如圖IA所示的兩層結構，或是如圖IB所示的三層結構。在圖IA中，具有兩層結構的突光金納米團簇-白蛋白復合物IOOa為金納米團簇(Au nanocluster ;縮寫為AuNC) 110被一層白蛋白(albumin ;縮寫為Ab) 130所圍繞，后面以「AuNCOAb」的代號記載之。在圖IB中，具有三層結構的熒光金納米團簇-白蛋白復合物IOOb的核心為金納米團簇110，中間層為具有至少一硫醇基的保護配位體(ligand ;縮寫為Lg) 120，以及最外層為白蛋白130，后面以「AuNC@Lg_Ab」的代號記載之。上述的金納米團簇110的直徑約為
I.9±0. 8nm,所以金納米團簇110可以放射波長約為640±90nm的突光。在圖IA中的白蛋白130以及圖IB的配位體120通常使用-SH官能基來包住金納米團簇。而在圖IB中的最外層的白蛋白130與中間層的配位體120之間則通常是靠靜電作用力(例如氫鍵或離子鍵)來互相結合。上述白蛋白一般可為任何水溶性蛋白質，例如可為血清白蛋白(serumalbumin)、蛋白中的卵白蛋白(serum albumin)、或在一些植物種子中的儲存白蛋白(storage albumins)。上述的血清白蛋白例如可為人類血清白蛋白(human serumalbumin ;HSA)、或牛血清白蛋白(bovine serum albumin ;BSA)。較佳為使用人類血清白蛋白，以免在人體中使用微胞時引發過敏反應。上述配位體為一非白蛋白分子，例如可為二氫硫辛酸(dihydrolipoic acid ;DHLA)、谷胱甘肽(glutathione)、硫普羅寧(tiopronin)、間-2，3-二疏基丁二酸(meso-2, 3-dimercaptosuccinic acid)、苯基
乙基硫醇鹽(phenylethylthiolate)、十二燒硫醇(dodecanethiol)、或巰基^--燒醇
(mercaptoundecanol)。舉例來說，圖1C-1D為依照本發明實施例的微胞的剖面結構示意圖。在圖IC中，微胞140a的殼層主要是由圖IA的兩層結構的熒光金納米團簇-白蛋白復合物IOOa所構成。在圖ID中，微胞140b的殼層主要是由圖IB的三層結構的熒光金納米團簇-白蛋白復合物IOOb所構成。在圖1C-1D中，核心150可填充空氣或碳氟化物。依據上述，熒光金納米團簇可以放射熒光并可被整合在微胞的結構中。因此，含有熒光金納米團簇的微胞可被直接用來做為超音波顯影的對比劑以及血管造影(angiography)的突光劑(fluorescein)。微胞的制備方法圖2為依照本發明一實施方式的一種微胞的制備流程圖。在圖2中，微胞可依照下述步驟來制備之。首先，合成熒光金納米團簇-白蛋白復合物(步驟210)。然后，合成微胞(步驟220)以及純化微胞(步驟230)。在步驟210中，熒光金納米團簇-白蛋白復合物可為AuNCOAb復合物或AuNC@Lg_Ab復合物。下面將詳述上述制備步驟的細節。在圖2的步驟210中，先合成熒光金納米團簇-白蛋白復合物。圖3A為兩層結構的AuNCOAb復合物的制備流程圖。在步驟3IOa中，等體積的Au3+溶液與白蛋白溶液混合在一起，并劇烈攪拌一段時間，以形成混合溶液。上述的Au3+溶液例如可為HAuCl4的水溶液。依照本發明一實施方式，Au3+的濃度可為O. Ι-lOmM。舉例來說，Au3+的濃度可為1-lOmM，或5_10mM。更具體而言，Au3+的濃度可為 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 IOmM0上述白蛋白已經定義如上，因此省略其細節描述。依照本發明一實施方式，白蛋白的濃度例如可為O. 0758-0. 7576mM。舉例來說，白蛋白的濃度可為O. 1263-0. 7576mM，或O. 4000-0. 7576mM0 更具體而言，白蛋白的濃度可為 O. 4,0. 5,0. 6,0. 65,0. 7 或 O. 75mM。在圖3A的步驟320a中，加入還原劑(例如堿)至上述混合溶液中，形成還原溶液，以獲得兩層結構的AuNCOAb復合物。為了減少pH值變動對混合溶液的沖擊，堿溶液的體積較佳為少于上述混合溶液總體積的5%。不然，就需要pH緩沖劑。接著，上述還原溶液經過劇烈攪拌一段時間(例如12小時)后，Au3+可被還原成熒光金納米團簇，而形成AuNCOAb復合物。上述的堿例如可為NaOH或Κ0Η。堿的濃度例如可為IN。當上述Au3+溶液與白蛋白溶液的體積皆為5mL時,加入的堿溶液體積例如可為O. 5mLo若希望能較易進行后續純化步驟以及減少對人體沖擊的話，NaOH將為較佳選擇。在圖3A的步驟330a中，純化兩層結構的AuNCOAb復合物。純化的方法例如可為使用具有IOOkDa孔洞的濾膜來進行過濾，或使用半透膜來進行透析(dialysis)，以移除未反應的Au3+。接著，使用冷凍干燥來獲得AuNCOAb復合物。圖3B為三層結構AuNC@Lg_Ab復合物的一制備流程圖。除了圖3A的白蛋白被配位體取代以及可以使用其它適用的還原劑(而不是堿)之外，圖3B中的步驟310b、320b、330b與圖3A中的步驟310a、320a、330a類似。因此，省略與步驟310b、320b、330b的相關細
節與考慮。接著，在圖3B的步驟340b中，在水或磷酸鹽緩沖液中混合步驟330b所得的AuNCOLg復合物與白蛋白，以形成三層結構的AuNC@Lg_Ab復合物。依照本發明一實施方式，在最終溶液中，AuNCiLg復合物的濃度可為1-22 μ M。舉例來說，AuNCOLg復合物的濃度可為6-22 μ Μ，或12-22 μ Μ。更具體而言，AuNCOLg復合物的濃度可為 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 μ Μ。依照本發明一實施方式，在最終溶液中，白蛋白的濃度可為O. 1516-0. 9090mM。舉例來說，白蛋白的濃度可為O. 3030-0. 9090mM，或O. 6060-0. 9090mM。更具體而言，白蛋白的濃度可為 O. 6060,0. 7578,0. 8333 或 O. 9090mM。在圖3B的步驟350b中，純化三層結構的AuNC@Lg_Ab復合物。純化的方法例如可為使用具有IOOkDa孔洞的濾膜來進行過濾，或使用半透膜來進行透析，以移除未反應的Au3+。接著，使用冷凍干燥來獲得AuNC@Lg_Ab復合物。 圖3C為三層結構AuNC@Lg_Ab復合物的另一制備流程圖。在步驟310c中，先加入還原劑還原溶液中的Au3+，而得到金納米微粒。依照本發明一實施方式，Au3+的濃度可為O. 25-25mM。舉例來說，Au3+的濃度可為O. 25_25mM，或20_25mM。更具體而言，Au3+的濃度可為 O. 25,0. 5,0. 75、1、5、10、15、20、21、22、23、24 或 25mM。
在步驟320c中，在溶液中再加入Au3+，蝕刻金納米微粒，以獲得金納米團簇。加入的Au3+溶液的Au3+濃度例如可為O. 25-25mM。舉例來說，上述Au3+的濃度可為O. 25_25mM，或 20-25mM。更具體而言，上述 Au3+ 的濃度可為 O. 25,0. 5,0. 75、1、5、10、15、20、21、22、23、24 或 25mM。在步驟330c中，在金納米團簇的溶液中加入配位體，以獲得AuNCOLg復合物。配位體已在上面定義之，因此不再重復記載之。接著，由于圖3C的步驟340c、350c、360c與圖3B的步驟330b、340b、350類似，因此不再贅述其相關細節。接著，在圖2的步驟220中，進行合成微胞的步驟。圖4為微胞的合成步驟流程圖。在圖4的步驟410中，將圖3A-3C所獲得的任一種熒光金納米團簇-白蛋白復合物分散在水中或磷酸鹽緩沖溶液中，形成分散溶液。依照本發明一實施方式，分散溶液中的熒光金納米團簇-白蛋白復合物的濃度例如可為40-60mg/mL。舉例來說，分散溶液中的熒光金納米團簇-白蛋白復合物的濃度例如可為50-60mg/mL,或55-60mg/mL。更具體而言,分散溶液中的熒光金納米團簇-白蛋白復合物的濃度例如可為40、42、44、46、48、50、51、52、53、57、55、56、57、58、59 或 60mg/mL在圖4的步驟420中，可在分散溶液中再選擇性地加入白蛋白，在此加入的白蛋白的種類可與前面的白蛋白為相同或不同種類。當熒光金納米團簇-白蛋白復合物為兩層的AuNCiAb復合物時，白蛋白/AuNCOAb復合物的最后摩爾比例如可為1_4、2_4、或3_4。當熒光金納米團簇-白蛋白復合物為三層的AuNC@Lg_Ab復合物時，白蛋白/AuNC@Lg_Ab復合物的最后摩爾比例如可為I、1/2或1/3。在圖4的步驟430中，以超音波震蕩所得的分散液，以形成微胞。接著，讓微胞分散液靜置1-3分鐘來穩定微胞分散液。靜置后的微胞分散液約略可分成三層。下層主要包含自由的熒光金納米團簇-白蛋白復合物，中間層主要包含微胞，上層主要包含較大的微胞。依照本發明一實施方式，上述的超音波震蕩所用的功率強度例如可為11-24瓦，所獲得的微胞直徑約為O. 5-20 μ m。舉例來說，超音波震蕩所用的功率強度例如可為21-24瓦。更具體而言，超音波震蕩所用的功率強度例如可為11、13、15、17、19、20、21、22、23或24瓦。超音波震蕩的時間只要1-3分鐘即已足夠。舉例來說，超音波震蕩的時間可為1、1. 5、2,2. 5或3分鐘。最后，在圖2的步驟230中，進行純化微胞的步驟。取出靜置后的微胞分散液的中層與下層，進行離心，離心時的相對離心力(relative centrifugal force ;RCF)約為350。離心后，微胞將位于上層分散液中，因此只要取出上層分散液即可得到微胞。實施例I :合成AuNCOBSA復合物與其微胞在此實施例中，AuNC@BSA復合物是以下述步驟合成的。在5mL的50mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液中加入5mL的IOmMHAuCl4溶液，在37°C下劇烈攪拌2分鐘。接著，在牛血清白蛋白及HAuCl4的混合溶液中，加入O. 5mL的INNaOH溶液，在37°C下再劇烈攪拌12小時，形成金納米團簇，以獲得AuNCOBSA復合物。AuNCiBSA復合物的光致放光性質的相關數據列在下面的表I中。從表I中可知，所有實驗例的激發與放光數據皆相同。因此，可以得知牛血清白蛋白及HAuCl4的相對量并不會影響AuNCOBSA復合物的光致放光性質。表I :AuNC@BSA復合物的光致放光性質
權利要求
1.一種醫用對比劑，其是由含有熒光金納米團簇的多個微胞所構成，每一所述微胞包含: 一殼層，其包含多個熒光金納米團簇-白蛋白復合物，每一所述復合物的結構為一層第一白蛋白圍繞熒光金納米團簇；以及 一核心,位于所述殼層中,所述核心填充有空氣或碳氟化物。
2.如權利要求I所述的醫用對比劑，其中所述殼層還包括一第二白蛋白。
3.如權利要求I或2所述的醫用對比劑，其中所述第一白蛋白及所述第二白蛋白分別為血清白蛋白、卵白蛋白或儲存白蛋白。
4.如權利要求或I或2所述的醫用對比劑，其中所述復合物還包括一層保護配位體，其是介于所述熒光金納米團簇及所述第一白蛋白之間。
5.如權利要求4所述的醫用對比劑，其中所述保護配位體為一非白蛋白分子，其是為二氫硫辛酸、谷胱甘肽、硫普羅寧、間-2，3- 二巰基丁二酸、苯基乙基硫醇鹽、十二烷硫醇、或疏基十一燒醇。
6.如權利要求I所述的醫用對比劑，其中所述微胞的直徑為O.5-6 μ m。
7.一種含有突光金納米團簇的微胞的制備方法，所述制備方法包含 混合一 Au3+溶液與一第一白蛋白溶液以形成一混合溶液； 加入一堿至所述混合溶液中，以還原Au3+而形成熒光金納米團簇-白蛋白復合物，其中所述熒光金納米團簇是被所述第一白蛋白層所保護，其中所述第一白蛋白為血清白蛋白、卵白蛋白或儲存白蛋白； 分散所述熒光金納米團簇-白蛋白復合物于水或磷酸鹽緩沖溶液中，以形成一分散溶液；以及 超音波震蕩所述分散溶液，以形成多個微胞，所述超音波震蕩的功率為11-24瓦，震蕩時間為1-3分鐘。
8.一種含有熒光金納米團簇的微胞的制備方法，所述制備方法包含 合成熒光金納米團簇-配位體復合物，其結構為所述熒光金納米團簇由配位體層所保護； 混合所述熒光金納米團簇-配位體復合物的溶液與一第一白蛋白的溶液以形成熒光金納米團簇-白蛋白復合物，其結構為所述第一白蛋白環繞所述熒光金納米團簇-配位體復合物，其中所述第一白蛋白為血清白蛋白、卵白蛋白或儲存白蛋白； 分散所述熒光金納米團簇-白蛋白復合物于水或磷酸鹽緩沖溶液中，以形成一分散溶液；以及 超音波震蕩所述分散溶液，以形成多個微胞，所述超音波震蕩的功率為11-24瓦，震蕩時間為1-3分鐘。
9.如權利要求8所述的制備方法，其中所述配位體為一非白蛋白分子，其為二氫硫辛酸、谷胱甘肽、硫普羅寧、間-2，3-二巰基丁二酸、苯基乙基硫醇鹽、十二烷硫醇、或巰基 燒醇。
10.如權利要求7-9中的任一項權利要求所述的制備方法，還包括加入一第二白蛋白于所述分散溶液中，其中所述第二白蛋白為血清白蛋白、卵白蛋白或儲存白蛋白。
11.如權利要求8所述的制備方法，其中所述合成熒光金納米團簇-配位體復合物的步驟包括加入還原劑以還原溶液中的Au3+，以得到金納米團簇分散于所述溶液中；加入Au3+至所述溶液中，以蝕刻所述金納米團簇而得到熒光金納米團簇 '及加入保護配位體至所述溶液中，以獲得熒光金納米團簇-配位體復合物。
12.如權利要求11所述的制備方法，其中所述還原劑為四丁基硼氫化銨。
全文摘要
本發明提供一種醫用對比劑，其是由多個含有熒光金納米團簇的微胞所構成，每個微胞具有殼層與核心。微胞的殼層含有熒光金納米團簇-白蛋白復合物，微胞的核心含有空氣或碳氟化物。本發明還提供一種含有熒光金納米團簇的微胞的制造方法。
文檔編號A61K49/22GK102614535SQ20111046124
公開日2012年8月1日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年2月1日
發明者莊文凱, 張恒雄, 李志賢, 林政鞍 申請人:中原大學