專利名稱：綠原酸的抗癌新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及綠原酸的新用途，屬于生物醫藥領域。
背景技術：
綠原酸廣泛存在于各種藥用植物如金銀花等中，目前對它的化學結構研究已經清楚，已有人對其進行藥用研究，報道了綠原酸可以應用于治療腫瘤等疾病。綠原酸(chlorogenic acid)是一種從雙子葉植物(如忍冬葉、咖啡豆、向日葵) 的葉和果實分離得到的酚類，也是許多中草藥(如杜仲、金銀花、茵陳等)及中藥復方制劑抗菌消炎、清熱解毒的主要活性成分，目前已成為中草藥制劑質量控制的主要指標之一。綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物。它是一種由咖啡酸(caffeic acid)與奎尼酸(雞納酸，quinic acid,即1_輕基六氫沒食子酸)縮合而成的縮酹酸，異名咖啡鞋酸，化學名3-0-咖啡酰奎尼酸(3-0-caffeoylquinic acid),分子式為C16H18O9，分子量345. 31，半水合物為針狀晶體，110°C時變為無水化合物，易溶于熱水、 乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常溫下呈淡黃色或類白色粉末。綠原酸的結構式如下植物中綠原酸的生物合成包括了一系列的酶促反應。在酶的催化下，葡萄糖轉化成莽草酸(shikimic acid)，后者再轉化成苯丙氨酸，最后經合成酶作用得綠原酸。綠原酸在植物中分布廣泛，從高等雙子葉植物到蕨類植物均有報道，但含量較高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬屬(Lonicera)、菊科蒿屬(Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金銀花、 向日葵、咖啡、可可樹。由于綠原酸是極性較強的有機酸，易溶于醇、熱水，難溶于氯仿、乙醚，因此綠原酸的提取方法較多，有醇(甲醇、乙醇)溶法、水提醇沉、醇提鉛沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱層析法等。現已經報道的綠原酸有多種藥理作用，其中，關于癌癥的治療用途僅限于宮頸癌、 肺癌和肝癌，未有用其治療膀胱癌的報道。
發明內容
本發明提供了綠原酸治療癌癥的新用途。首先，本發明提供了綠原酸在制備治療膀胱癌的藥物中的用途。本發明還提供了一種治療膀胱癌的藥物組合物，它是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的藥劑。其中，所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸I 3000mg。
HO COOH
其中，所述的藥劑是口服制劑或者注射劑。本發明綠原酸可抑制膀胱癌細胞的增殖，具有治療膀胱癌的作用，而且，本發明綠原酸是非細胞毒類藥物，具有非細胞毒類藥物的共同特點1.具有調節作用和細胞穩定作用(Cytostatic) ；2.臨床治療不一定需達到劑量性毒性(DLT)和最大耐受量(MTD) ；3.直接針對引起癌變分子機制，比傳統化療更有選擇性和療效；4.與常規治療(化療、放療)合用有更好的療效。本發明還提供了綠原酸與阿霉素類藥物在制備治療膀胱癌的聯合用藥物中的用途。所述的阿霉素類藥物是指阿霉素或者阿霉素衍生物。其中，所述綠原酸與阿霉素類藥物的重量配比為綠原酸10份，阿霉素類藥物I 份。其中，所述阿霉素類藥物為阿霉素。本發明最后提供了一種治療膀胱癌的聯合用藥物，它包含不同規格的單位制劑， 用于同時、分別或者依次給綠原酸與阿霉素類藥物，以及藥學上可接受的載體。所述綠原酸與阿霉素類藥物的重量配比為綠原酸10份，阿霉素類藥物I份。所述阿霉素類藥物為阿霉素。聯合用藥(drug combination)是指為了達到治療目的而采用的兩種或兩種以上藥物同時或先后應用。本發明綠原酸與阿霉素類藥物聯合用于治療膀胱癌的效應為相加 (+)，因綠原酸本身既具有抑制腫瘤的作用，同時又對機體無害，且可以提高機體免疫力、改善機體造血功能和肝腎功能，因此將綠原酸與阿霉素聯合使用時，既可以降低阿霉素的使用劑量，還可以進一步降低阿霉素對機體的毒副作用，具有良好的臨床應用前景。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
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具體實施例方式
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以下通過具體的藥效實驗證明本發明的有益效果。試驗例I綠原酸抑制膀胱癌的作用一、體外實驗I、試驗材料I. I受試藥物綠原酸白色粉末，由四川九章生物化工科技發展有限公司提供，批號為101204， 綠原酸含量為99. 68% ；陽性對照藥阿霉素注射液(ADM)，購買于浙江海正藥業有限公司，批號為 091001，規格 IOmg/支。I. 2主要試劑培養基及試劑培養基RPML1640 (Gibco公司)，小牛血清(蘭州民海)，青霉素(華北制藥股份有限公司)、硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司)，WST_1 (美國Roche公司)。I. 3主要儀器二氧化碳細胞培養箱(日本SANYO)，1X70倒置相差熒光顯微鏡(日本Olympus)， 生物安全柜(美國NUAIRE)，μ -Quant微孔板測定儀(BioTek公司)，培養器皿96孔培養板，培養瓶(BD公司)。I. 4細胞株細胞株共4株，見表I。表I綠原酸抗腫瘤作用體外實驗研究用細胞株
株名__名稱
BIU-875637 Τ-24
Τ739_2.試驗方法2. I藥物及試劑配制2. I. I綠原酸的配制取綠原酸適量,用生理鹽水溶解配成6. 4mg/ml的儲存溶液,經O. 22 μ mMillipore 無菌過濾器無菌過濾除菌。2. I. 2阿霉素注射液的配制取阿霉素I支，用滅菌生理鹽水稀釋成I. 28mg/ml的儲存溶液。2. I. 3培養液配制RPML1640細胞培養基溶解于超純水(IOOOml)中，攪拌溶解，加2. 2gNaHC03和 IOmlHEPES攪拌溶解，再加青霉素適量(終濃度為100U/ml)和鏈霉素適量(終濃度為 100 μ g/ml)，充分混合后，用0. 22 μ m濾膜無菌過濾，分裝，于_20°C凍存，此為基礎培養基。 臨用前37°C水浴解凍，加10%的小牛血清，調整培養液pH為7. 2 7. 4，此為完全培養基。2. I. 4細胞增殖檢測試劑Cell Proliferation Reagent (WST-I) (Roche 11644807001)試劑按要求冷藏。
人膀胱癌細胞株人膀胱癌細胞株人移行細胞膀胱癌細胞株小鼠膀胱癌細胞株
2. 2細胞復蘇及接種2. 2. I細胞復蘇將凍存細胞株從_152°C超低溫冰柜中取出，40°C水浴解凍，離心并用基礎培養基洗滌后用完全培養基懸浮細胞，轉移到細胞培養瓶內，靜置于5% CO2細胞培養箱中37°C培養，每2 3天換液。細胞生長鋪滿細胞瓶后用O. 25%胰蛋白酶消化傳代培養至實驗所需細胞數量。2. 2. 2細胞接種取對數生長期細胞，O. 25%胰蛋白酶消化，用基礎培養基洗滌離心(IOOOrpm 5min 兩次)，用完全培養基懸浮細胞并調整細胞濃度為6 X IOVml，接種細胞于96孔板內，每孔 50 μ I (細胞數量6 X IO3/孔)，每個藥物濃度接種3個復孔，并設正常對照組(腫瘤細胞+ 完全培養基)和空白對照組(完全培養基)，每組3個復孔。2. 2. 3 加藥接種后次日細胞貼壁后按以下分組加藥。(I)綠原酸組用完全培養基將6. 4mg/ml綠原酸儲存溶液配制成256 μ g/ml的溶液，然后用完全培養基按對倍稀釋法逐步稀釋，得含綠原酸256、128、64、32、16、8、4和
2μ g/ml的完全培養基，備用；取5(^ I上述含不同濃度綠原酸的完全培養基到已接種細胞的96孔板中，使綠原酸終濃度分別為128、64、32、16、8、4、2和I μ g/ml，每個濃度3復孔。(2)阿霉素組用完全培養基將阿霉素I. 28mg/ml儲備液稀釋成25. 6 μ g/ml的溶液，然后用完全培養基按對倍稀釋法逐步稀釋得到含阿霉素25. 6、12. 8,6. 4,3. 2、I. 6,0. 8、 O. 4和O. 2 μ g/ml的完全培養基，備用；取50 μ I上述含不同濃度阿霉素的完全培養基到已接種細胞的96孔板中，使阿霉素終濃度分別為12. 8,6. 4,3. 2、I. 6,0. 8,0. 4、0. 2和O. I μ g/ ml，每個濃度3復孔。(3)綠原酸+阿霉素組測定綠原酸對阿霉素的增效作用，初步考察綠原酸對阿霉素6. 4 μ g/ml濃度組的增效情況作用。在已接種的96孔板中，分別加入25 μ I濃度為 25. 6 μ g/ml的阿霉素溶液,使阿霉素終濃度為6. 4 μ g/ml,再加入25 μ I不同濃度綠原酸培養基溶液，使綠原酸的終濃度分別為128、64、32、16、8、4、2和I μ g/ml，每個濃度3復孔。(4)正常對照組設腫瘤細胞正常對照組孔，不加藥物處理，只加等量(100 μ I)完全培養基，與上述3個組別同步實驗。(5)空白對照組每孔不接種細胞，只加等量(100 μ I)完全培養基，設3個復孔作為空白對照。2. 2. 4 測定加藥后細胞培養48小時，在上述3個實驗組、正常對照組和空白對照組孔內加入 10 μ IffST-I溶液，置37°C細胞培養箱繼續孵育4小時后，在μ -Quant微孔板測定儀上測定不同藥物組、正常對照組和空白對照組440nm波長處的吸收值。2. 2. 5數據處理(I)計算GI (生長抑制率)=(I-OD藥物組/OD對照組)X 100%。(2)以同一藥物不同濃度對腫瘤細胞抑制率作圖，可得到劑量效應曲線。(3)根據藥物濃度及對應的腫瘤細胞抑制率，采用Logit法IC5tl計算軟件計算半數抑制濃度(IC5tl值)。
(4)聯合用藥以公式Q = E (a+b) / (Ea+Eb-Ea X Eb)計算有無協同作用。其中 E(a+b)為兩藥合用的抑制率，即實驗合并效應，Ea和Eb為兩藥單用時的抑制率，分母 (Ea+Eb-EaXEb)為期望合并效應，Q為兩者比值。Q值在O. 85 I. 15時，兩藥合并效應為相加(+)，Q值在I. 15 20時為協同(++)，0值> 20為明顯協同(+++)，Q值在O. 05 O. 85時為拮抗，Q值< O. 05為明顯拮抗。3.試驗結果3. I綠原酸對人膀胱癌細胞(BIU-87)的體外抑瘤作用3. I. I細胞形態觀察結果各組加藥處理48小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，與正常對照組比較，綠原酸(I 128 μ g/ml)對細胞生長有一定的影響，部分細胞變圓、脫落、懸浮；而阿霉素處理過的細胞，低濃度時即有大量細胞死亡，有大量細胞碎片；聯合用藥各組細胞死亡亦明顯， 大量細胞變圓、脫落、懸浮。3. I. 2綠原酸對人膀胱癌細胞(BIU-87)的抑制率、半數抑制濃度(IC5tl)和劑量效應曲線綠原酸及阿霉素對人膀胱癌細胞(BIU-87)的抑制率和半數抑制濃度(IC5tl)分別見表2和表3，劑量效應曲線見圖I。表2綠原酸對人膀胱癌細胞(BIU-87)的抑制率和半數抑制濃度(IC5tl)0084] 表3阿霉素對人膀胱癌細胞(BIU-87)的抑制率和半數抑制濃度(IC5tl)
權利要求
1.綠原酸在制備治療膀胱癌的藥物中的用途。
2.一種治療膀胱癌的藥物組合物，其特征在于它是以有效量的綠原酸為活性成分， 加上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的藥劑。
3.根據權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸I 3000mg。
4.根據權利要求2或3所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是口服制劑或者注射劑。
5.綠原酸與阿霉素類藥物在制備治療膀胱癌的聯合用藥物中的用途。
6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于所述綠原酸與阿霉素類藥物的重量配比為綠原酸10份，阿霉素類藥物I份。
7.根據權利要求5所述的用途，其特征在于所述阿霉素類藥物為阿霉素。
8.一種治療膀胱癌的聯合用藥物，其特征在于它包含不同規格的單位制劑，用于同時、分別或者依次給綠原酸與阿霉素類藥物，以及藥學上可接受的載體。
9.根據權利要求8所述的聯合用藥物，其特征在于所述綠原酸與阿霉素類藥物的重量配比為綠原酸10份，阿霉素類藥物I份。
10.根據權利要求8或9所述的聯合用藥物，其特征在于所述阿霉素類藥物為阿霉素。
全文摘要
本發明公開了綠原酸在制備治療膀胱癌的藥物中的用途，公開了一種治療膀胱癌的藥物組合物，它是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的藥劑，公開了綠原酸與阿霉素類藥物在制備治療膀胱癌的聯合用藥物中的用途和一種治療膀胱癌的聯合用藥物。本發明提供的綠原酸具有抑制膀胱癌細胞的作用，對正常細胞無細胞毒性，有良好的藥用價值。
文檔編號A61K31/216GK102579419SQ20121008631
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者嚴永江, 張欣, 張潔, 楊華蓉, 梁貴倫, 田晨煦, 黃望, 黃英 申請人:四川九章生物化工科技發展有限公司