專利名稱：艾葉提取物及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于天然植物提取及應用技術領域，具體涉及一種艾葉提取物及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。
背景技術：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBv)引起的一種世界性疾病。據統計，目前全世界大約有20億人感染過HBV，其中約有3. 5億人是HBV攜帶者， 我國約有I. 2億HBV攜帶者。乙型肝炎病毒是導致急性、慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病因，每年有30 50萬人死于HBV引起的肝硬化或肝癌。目前臨床上抗HBV藥物主要為干擾素和核苷類藥物。這兩類藥物雖然在HBV感染的治療上取得了比較好的療效，但是有報道稱干擾素適應癥范圍窄，不良反應多。核苷類藥物停藥后易復發，長期使用會產生耐藥性， 易出現腎毒性、骨髓抑制等不良反應，因此，尋找新型安全有效的抗乙肝病毒藥物是臨床急需解決的問題。中藥具有多成分、多靶點、多途徑發揮藥效等特點。傳統中藥在長期治療乙型肝炎過程中體現了它獨有的優勢，開發具有抗乙肝病毒作用的中藥和天然藥物是當前的研究熱點。艾葉(Folium Artemisiae Argyi)是一味使用歷史悠久的傳統中藥,在我國的很多地區均有分布。傳統藥學理論認為艾葉有理氣血、逐寒濕等功效。近代醫學研究證明艾葉還具有抗菌、平喘鎮咳祛痰、止血與抗凝血等作用。目前，尚未見到有關于艾葉提取物被用于抗乙肝病毒的相關報道。
發明內容
本發明目的在于提供一種艾葉提取物，以及該艾葉提取物在制備抗乙肝病毒藥物方面的應用。為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下
一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類、香豆素類、內酯類、酚類、有機酸類、甾體類(如β_谷留醇等)和三萜類化合物。黃酮類化合物如5，7-二輕基-6，3 ’，4 ’ -三甲氧基黃酮(eupatilin,異澤蘭黃素)、5，7，4 ’ -三輕基-6，3 ’ - 二甲氧基黃酮(jaceosidin,棕矢車菊素)、圣草酹 (eriodictyol, 5，7，3 '，4 '-四輕基黃燒酮)、鼠李素(rhamnetin, 3,5,3 ' , 4 '-四輕基-7-甲氧基黃酮)、芳:菜素(Apigenin 5，7，4，-三輕基黃酮)、山萘酹(kaempferol, 3，4, 5, 7-四輕基黃酮)、木犀草素(Iuteolin 3’，4’，5, 7-四輕黃酮)、槲皮素(quercetin, 3，3’，4’，5，7-五羥基黃酮)、金合歡素(5，7- 二羥基-4’ -甲氧基黃酮)等。香豆素類化合物如傘形花內酯(umbelIiferone, 7-輕基香豆素)、瑞香素(daphnetin, 7, 8- 二輕基香豆素) 等。酚類化合物如4-甲氧基-3-羥基苯酚、尿囊素(allantoin 5-尿基乙內酰胺)等。三萜類化合物如α -香樹脂醇、β -香樹脂醇、無羈萜、a -及β -香樹脂醇的乙酸酯、羽扇烯酮、粘霉烯酮、羊齒烯酮、24-亞甲基環木菠蘿烷酮、西米杜鵑醇等。所述艾葉提取物的制備方法，其包括如下步驟將艾葉用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流結束后固液分離，所得液體濃縮后，經干燥即得。具體的，可取粉碎過的艾葉1kg，用4 IOL乙酸乙酯浸泡8h以上(用以使艾葉充分浸潤)，然后將艾葉及浸泡液回流I 6h。為了獲得較高的提取率，也可以按照下述步驟進行回流結束后固液分離，所得固體殘渣可以再次用乙酸乙酯回流，固液分離，合并兩次所得液體并濃縮成浸膏。固體殘渣可如此重復提取，共回流I 3次。所述艾葉提取物在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。艾葉提取物可制成多種劑型膠囊劑、片劑、顆粒劑、滴丸、緩釋制劑及納米制劑等劑型。可以以艾葉提取物為活性物質，與醫學上可接受的藥用輔料、賦形劑等混配、組合，制成上述各種劑型；還可以與其他抗乙肝病毒藥物共同作為活性物質，與醫學上可接受的藥用輔料、賦形劑等混配、組合，制成上述各種劑型。普通膠囊將艾葉提取物或與明膠等囊材制得微囊后與硬脂酸鎂等以1:3的比例混勻后，填入空膠囊中即得。規格0. 2g/粒(含量50mg/粒)。臨床擬用量200mg/日，2次/曰。軟膠囊將艾葉提取物與明膠、甘油、蒸餾水熔融制得的膠液用軋囊機壓制成囊， 即得。規格0. 2g/粒(含量50mg/粒)。臨床擬用量200mg/日，2次/日。片劑將艾葉提取物或微囊化后與微晶纖維素、乳糖、硬脂酸鎂等輔料混配，按公知的制片技術和裝備，經過標準的凹沖壓成片，制成片劑。規格0. 25g/片(含量50mg/片)。 臨床擬用量200mg/日，2次/日。顆粒劑將艾葉提取物或微囊化后與蔗糖、糊精、乳糖等輔料混配制粒，整粒，滅菌分裝即得。規格0. 3g/袋(含量IOOmg/袋)。臨床擬用量200mg/日，2次/日。滴丸將艾葉提取物與PEG 4000以1:3混合熔融，以固體分散技術，用滴丸機滴制成丸。規格20mg/粒(含量5mg/粒)。臨床擬用量200mg/日，2次/日。緩釋制劑將艾葉提取物或微囊化后與羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂等充分混勻、制粒，壓制成片，即得。規格0. 3g/片(含量lOOmg)。臨床擬用量400mg/2日。納米制劑將艾葉提取物與磷脂、助乳化劑和水以納米乳化法制成納米乳或亞微乳，再倒入冰水中冷卻即得到納米粒或亞微乳。規格50mg/10ml。臨床擬用量IOOmg/日。本發明艾葉提取物的提取方法簡單，所得艾葉提取物經體外細胞試驗證明具有較強的抗乙肝病毒活性(這可能是提取物中包含的有效成分如黃酮類、香豆素類、內酯類、 酚類、有機酸類、留體類和三萜類化合物等作用的結果)，可用于制備抗乙肝病毒藥物。
具體實施例方式以下通過優選實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的保護范圍并不局限于此。實施例I
一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類、香豆素類、內酯類、酚類、有機酸類、甾體類和三萜類等化合物。所述艾葉提取物經下述方法制得取Ikg粉碎過的艾葉置于燒瓶中，加入6000ml乙酸乙酯振搖混合后浸泡12h左右，然后將艾葉及浸泡液回流2h (燒瓶中可放入數粒沸石)，回流結束后靜置15min左右，然后過濾。濾渣與4000ml乙酸乙酯混合后再次回流2h，過濾；合并兩次所得濾液，然后用旋轉蒸發儀濃縮，濃縮至少量時轉至蒸發皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h即得21. 5g墨綠色浸膏。實施例2
一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類、香豆素類、內酯類、酚類、有機酸類、甾體類和三萜類等化合物。所述艾葉提取物經下述方法制得取Ikg粉碎過的艾葉置于燒瓶中，加入9000ml乙酸乙酯振搖混合后浸泡24h左右，然后將艾葉及浸泡液回流4h，回流結束后靜置片刻，然后過濾。所得濾液用旋轉蒸發器儀濃縮，濃縮至少量時轉至蒸發皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h即得20. Og墨綠色浸膏。實施例3
一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類、香豆素類、內酯類、酚類、有機酸類、甾體類和三萜類等化合物。所述艾葉提取物經下述方法制得取Ikg粉碎過的艾葉置于燒瓶中，加入5000ml乙酸乙酯振搖混合后浸泡IOh左右，然后將艾葉及浸泡液回流3h，回流結束后靜置片刻，然后過濾。濾渣與5000ml乙酸乙酯混合后再次回流2h，過濾；合并兩次所得濾液，然后用旋轉蒸發儀濃縮，濃縮至少量時轉至蒸發皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h 即得22. 6g墨綠色浸膏。艾葉提取物所含有效成分的驗證試驗
1、制備樣品溶液 1.1樣品水溶液
稱取O. 2g實施例I所得艾葉提取物，置具塞錐形瓶中，加水15ml，超聲振蕩15分鐘使溶解,過濾,收集濾液,得樣品水溶液。I. 2樣品乙醇溶液
稱取O. 2g實施例I所得艾葉提取物，置具塞錐形瓶中，加乙醇20ml，超聲振蕩15分鐘， 活性碳脫色兩次(每次O. 5g)，過濾，收集濾液，得樣品乙醇溶液。I. 3樣品氯仿溶液
稱取O. 2g實施例I所得艾葉提取物，置具塞錐形瓶中，加氯仿15ml，超聲振蕩15分鐘,活性碳脫色三次(每次O. 5g)，過濾，收集濾液，得樣品氯仿溶液。2、驗證試驗
2.I黃酮類化合物
2.I. I鹽酸-鎂粉試驗
取樣品乙醇溶液1ml，加少量鎂粉后，滴加濃鹽酸5-7滴，溶液顏色變紅。為正反應。2. I. 2鹽酸-鋅粉試驗
取樣品乙醇溶液1ml，加少量鋅粉后，滴加濃鹽酸5-7滴，放置后溶液顏色變紅。為正反應。2. 1.3三氯化鋁熒光試驗
取樣品乙醇溶液適量，點于濾紙片上，晾干后，噴以I %三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈下觀察，樣品斑點呈現黃色熒光。為正反應。I %三氯化鋁乙醇溶液的配制取O. Ig三氯化鋁，加乙醇使溶解成10ml，即得。2. I. 4濃氨水熒光試驗取樣品乙醇溶液適量，點于濾紙片上，晾干后，置氨蒸氣中熏幾分鐘，置紫外光燈下觀察，樣品斑點呈現黃色熒光。為正反應。2. 2香豆素、內酯類化合物 2. 2. I開閉環反應
取樣品乙醇溶液1ml，加I %氫氧化鈉溶液2-3滴，溶液為澄清，再加2%鹽酸5_6滴，溶液變渾濁。為正反應。2. 2. 2異羥肟酸鐵反應
取樣品乙醇溶液1ml，加7%鹽酸羥胺乙醇溶液和10%氫氧化鈉溶液各5-6滴，置水浴上加熱幾分鐘后，加2%鹽酸溶液4-5滴,再加1%三氯化鐵溶液4-5滴,溶液呈現紅色。為正反應。2. 2. 3重氮鹽試劑反應
取樣品乙醇溶液Iml,加I %氫氧化鈉溶液數滴,置水浴加熱,后放至室溫,加新配置的重氮對硝基苯胺試液數滴，溶液呈紅色。為正反應。重氮對硝基苯胺試液的配制取對硝基苯胺O. 4 g，加稀鹽酸20ml與水40ml，使溶解，冷卻至15°C，緩緩加入10%亞硝酸鈉溶液，至取溶液I滴能使碘化鉀淀粉試紙變為藍色， 即得。2. 3酚類化合物
2.3. I FeCl3試劑反應
取樣品水溶液1ml，加l%FeCl3溶液5_6滴，放置后發現有暗綠色沉淀。為正反應。2. 3. 2三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑反應
取樣品水溶液適量，點于濾紙片上，晾干后，噴以1%三氯化鐵一 1%鐵氰化鉀(1:1)溶液，顯藍色斑點。為正反應。2. 4有機酸化合物
2.4. I pH試紙檢查
取水溶液用pH試紙檢查,與標準色版比較為4. 6。為正反應。2. 4. 2溴酚藍試液反應
取樣品水溶液適量，點于濾紙片上，晾干后，噴以O. 1%溴酚藍乙醇溶液，呈藍色背景黃色斑點。為正反應。O. 1%溴酚藍乙醇溶液配制稱取O. 005g溴酚藍，加乙醇使溶解成5ml，即得。2. 5甾體、三萜化合物
2.5. I氯仿-濃硫酸反應
取樣品氯仿溶液1ml，加濃硫酸1ml，使其分層，氯仿層顯紅色，濃硫酸層有黃綠色熒光。為正反應。2. 5. 2三氯醋酸反應
取樣品乙醇溶液適量，點于濾紙片上，晾干后，滴25%三氯醋酸乙醇溶液，于干燥箱內 100°C烘烤,呈紅棕色。為正反應。25%三氯醋酸乙醇溶液的配制取三氯醋酸25g，加乙醇使溶解成100ml，即得。由上述驗證試驗結果可知，本發明所述艾葉提取物中含有黃酮類、香豆素類、內酯類、酚類、有機酸類、留體類和三萜類化合物。
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艾葉提取物的體外試驗 I. I主要試驗材料
I.I. I HepG2. 2. 15細胞株由廣州暨南大學生物醫藥研究開發基地贈予，本研究室自行傳代培養供實驗使用。I. 1.2主要試劑拉米夫定(3TC，賀普丁片)購自葛蘭素-史克制藥(蘇州)有限公司產品；1640培養基購自北京索萊寶生物醫藥科技有限公司；胰蛋白酶購自美國Amersco 公司；MTT購自美國Sigma公司；G418,購自美國invitrogen公司；HBV核酸擴增突光定量檢測試劑盒，深圳匹基生物工程股份有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ELISA診斷試劑盒(酶聯免疫法)，上海科華生物技術有限公司；乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg) ELISA診斷試劑盒(酶聯免疫法)，上海科華生物技術有限公司；DNA提取試劑盒，美國Omega公司。1.1.3主要儀器生物安全柜Hfsafe-1200TE Class II Type B2，香港力康發展有限公司；水套式二氧化碳培養箱HF160W，香港力康發展有限公司；酶標儀168-1000XC， 美國BIO RAD ;熒光PCR檢測儀，美國Roche LightCyclerl. 5 ;全自動滅菌器HVE-50，日本HIRAYAMA ；96孔培養板，24孔培養板，50ml細胞培養瓶，美國corning公司；超純水儀為 Millipore公司產品。實施例I所得艾葉提取物對細胞的毒性試驗
依據Mosmann建立的MTT比色法檢測實施例I所得艾葉提取物對H印G 2. 2. 15細胞的毒性。具體為細胞長滿培養瓶后，加入O. 25%胰蛋白酶，消化后加入培養液吹打成單細胞,加入細胞計數板計數，濃度為2 X IO4個/mL后接種于96孔細胞培養板(每孔ΙΟΟμΙ),每個濃度設四個孔，置CO2培養箱(37°C，5. 0%C02)中培養24h。細胞長成單層后加入含有不同濃度艾葉提取物的1640培養基，并設不含艾葉提取物的正常細胞為空白對照組。連續培養72h，每孔加入20μ1含結晶紫的MTT，于CO2培養箱(37°C，5. 0% CO2)中繼續培養。4h后， 棄去上清液,每孔加入200μ1 DMS0，用微量振蕩器充分震蕩，使結晶紫充分溶解。用酶標儀 (檢測波長490nm，參考波長630nm)讀取各孔OD值，記錄結果。計算不同濃度艾葉提取物對 HepG 2. 2. 15細胞的抑制百分率，結果見表I。
Γ I方八f 空白對給藥孔OD埴ιηηο/
_9]抑制百分率=^空白對照toffl^Xi00%
表I、不同濃度艾葉提取物對HepG2.2.15細胞的毒性作用
權利要求
1.一種艾葉提取物，其特征在于，該提取物的有效成分包括黃酮類、香豆素類、內酯類、 酚類、有機酸類、留體類和三萜類化合物。
2.權利要求I所述艾葉提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟將艾葉用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流結束后固液分離，所得液體濃縮后，經干燥即得。
3.如權利要求2所述艾葉提取物的制備方法，其特征在于，取粉碎過的艾葉1kg，用 4 IOL乙酸乙酯浸泡8h以上，然后將艾葉及浸泡液回流I 6h。
4.權利要求I所述的艾葉提取物在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類、香豆素類、內酯類、酚類、有機酸類、甾體類和三萜類化合物。所述艾葉提取物經如下步驟制得將艾葉用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流結束后固液分離，所得液體濃縮后，經干燥即得。本發明所述艾葉提取物的提取方法簡單，所得艾葉提取物經體外細胞試驗證明具有較強的抗乙肝病毒活性，可用于制備抗乙肝病毒藥物。
文檔編號A61K127/00GK102600225SQ20121011761
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月20日 優先權日2012年4月20日
發明者侯迎迎, 張壯麗, 張小俊, 張艷, 張長征, 王寧, 王慶端, 王桂芳, 趙志鴻, 鄒敏, 鄭立運, 陳慧平, 馬方, 黃勇勇 申請人:河南省醫藥科學研究院