一種制備細胞外基質支架材料的脫細胞方法

一種制備細胞外基質支架材料的脫細胞方法
【專利摘要】本發明涉及組織工程材料領域。具體地說，本發明涉及一種制備細胞外基質支架材料的脫細胞方法，其中采用綠色表面活性劑吡喃葡萄糖苷進行脫細胞處理，不僅能完全去除細胞而且保持了ECM支架的超微結構和組成成分。
【專利說明】一種制備細胞外基質支架材料的脫細胞方法
【技術領域】[0001]本發明涉及組織工程材料領域。具體而言，本發明涉及一種制備細胞外基質支架材料的脫細胞方法。
【背景技術】
[0002]組織是由細胞和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)組成的,其中的細胞成分作為抗原被宿主識別后會引發炎癥或免疫排斥反應。而ECM是結構蛋白和功能蛋白的復合物，該組分在不同物種間通常是受保護的而且耐受性良好。由ECM組成的生物支架材料被廣泛應用在外科手術重建和組織與器官的再生醫學領域，如心臟瓣膜、血管、皮膚、神經、肌腱和小腸粘膜下層等。ECM是組織和器官中的細胞的分泌產物，與這些細胞之間有著動態的相互作用，能夠及時反映微環境的改變，同時在細胞遷移、分化和增殖方面有著重要的作用。其三維結構與體內細胞生長的天然環境接近，不僅可以起著支架材料的作用，而且包含的多種生長因子在組織修復和重建中有重要促進作用，即使經過脫細胞處理仍有活性，是細胞生長的理想環境。
[0003]利用已知的常規方法將異源或異種結締組織(例如心包膜、瓣膜、皮膚、血管和小腸粘膜下層)的細胞脫除，形成一種稱為脫細胞的細胞外基質，在脫細胞過程中，去除導致組織排斥的細胞，同時保留原始組織的復雜結構和關鍵生化組分。不同的脫細胞方法直接影響所得脫細胞基質的成分和超微結構，最終影響移植后宿主對脫細胞基質的反應。
[0004]目前脫細胞基質的制備方法有很多，主要包括物理法、化學法和生物處理法。物理法主要是通過物理的作用如凍融、液體高壓、超聲波和電擊等脫除細胞，它們的基本原理是破壞組織中細胞的細胞膜結構，細胞膜結構的變化導致細胞產生不良生物化學反應，持續的處理將使細胞死亡，隨后通過溶液的清洗、核酸及脂質的去除而脫去組織的細胞。化學法就是使用化學試劑破碎細胞達到去除細胞的目的。一些特定的化學試劑如酸、堿和去污劑等可以滲透組織的各層，溶解細胞膜的雙分子層磷脂甚至破壞細胞膜蛋白導致細胞死亡和破碎，之后通過振蕩清洗等步驟洗去細胞殘渣和抗原物質。生物處理法主要是用酶試劑來裂解細胞。例如脫細胞方法中通常會用到胰蛋白酶，它是一類絲氨酸蛋白酶，能選擇性地水解蛋白質中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈，胰蛋白酶的作用使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。
[0005]中國專利申請號N0.201110134511.9涉及一種同種脫細胞真皮基質制備方法，使用十二烷基硫酸鈉進行脫細胞處理，雖然用時短，但十二烷基硫酸鈉對基質結構有較大損傷，且十二烷基硫酸鈉有明顯的毒性，不利于體內植入。中國專利申請號N0.200510002464.7涉及異種心血管移植物的脫細胞方法，而中國專利申請號N0.200910076674.9涉及一種脫除血管組織內細胞的血管基質及其制備方法。這兩個專利申請都使用了胰蛋白酶，雖然處理時間和濃度各異，但胰蛋白酶必然會對支架不同程度的降解，破壞支架材料的結構和組成成分，且經胰蛋白酶處理后的組織會有大約30%的腫脹。
[0006]傳統去污劑在脫細胞處理過程中，雖能去除細胞，但其殘留會引起細胞毒性及潛在的免疫性[非專利文獻2和3]。避免這一毒性反應的發生必須去除去污劑或替換新型無毒的試劑，去除去污劑的方法很多且過程繁瑣、不徹底，因此需要尋找一種新型無毒可降解且能完全脫除組織器官的細胞的替代試劑。使用環保型生物降解完全無毒的去污劑在脫細胞基質的制備上有著重要的意義。
[0007]η-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(n-Octyl beta-D-Glucopyranoside,簡稱 0GP)是一種性能優良的新型綠色表面活性劑，兼具非離子與陰離子表面活性劑的特性。它不僅表面張力低、活性高、去污力強、泡沫豐富細膩而穩定，而且具有對皮膚無刺激、生物降解好、無毒、對環境無污染等優點。研究表明[非專利文獻I]，OGP表面活性高，能夠破壞細菌的細胞膜結構，具有廣譜抗菌性，如對革蘭氏陰、陽性菌等均有抗菌作用，且抗菌性強，是理想的溫和非離子表面活性劑 。

【發明內容】

[0008]本發明所解決的技術問題是提供一種制備細胞外基質支架材料的脫細胞方法。該方法可徹底脫除存在于組織表面和內部的細胞及細胞碎片，制備出具有較好的力學性能和生物學特性的細胞外基質材料，從而得到組織工程所用的支架材料。
[0009]本發明涉及一種制備細胞外基質支架材料的脫細胞方法，包括以下步驟:
[0010]a.對待用組織器官進行預處理；
[0011]b.將經過預處理的待用組織器官加入到含有吡喃葡萄糖苷的溶液中，通過低滲溶液振蕩處理，以破壞細胞膜結構和抽提細胞膜的脂質和膜蛋白；
[0012]c.將步驟b處理后的組織器官加入到含有核酸酶的溶液中，以降解細胞中各類DNA和/或RNA成分；以及
[0013]d.洗滌制備的細胞外基質支架材料。
[0014]根據本發明，所述的待用組織器官為異種或同種異體或自體組織器官，包括牛心包、豬心包、心臟瓣膜、皮膚、血管、小腸粘膜下層、神經等中任意一種。一般來說，含有較多膠原纖維或彈力纖維的組織器官適宜用此方法去除細胞成分。
[0015]根據本發明，所述的預處理是使用含有抗生素的生理鹽水，或pH值為6.8-8.6的磷酸鹽緩沖液，或pH值為6.8-8.6的D-Hanks溶液(Hanks溶液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一，也是組織培養基本用液。D-Hanks溶液則是無鈣鎂離子的Hanks液，GIBCO公司)，在0-37°C條件下對待用的組織器官進行常規清洗、消毒、分離。
[0016]根據本發明，所述的吡喃葡萄糖苷選自η-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OGP)、辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、壬基吡喃葡萄糖苷、癸基吡喃葡萄糖苷、十二烷基吡喃葡萄糖苷的任一種或其組合(該組合也可統稱為烷基葡萄糖苷)，優選0GP。
[0017]根據本發明，所述的吡喃葡萄糖苷的濃度小于70%(w/v)，即重量:體積為70克:100毫升，優選0.1-10% (w/v)，即重量:體積為0.1-10克:100毫升，更優選0.5-5% (w/V)。含有吡喃葡萄糖苷的溶液的溫度范圍為1°C _40°C，更優選3°C -8°C 0含有吡喃葡萄糖苷的溶液的PH值范圍為5-12，更優選6.8-8.6，處理時間為30分鐘-96小時，更優選6_48小時。
[0018]所述的低滲溶液振蕩處理是采用0.01M無菌的Tris-HCl緩沖液(pH6.8-8.6)，在rc -400C (更優選3°C -8°C )中振蕩處理30分鐘-96小時(更優選6_48小時)，振蕩速率為 50-360rpm,更優選 100_250rpm。
[0019]所述的核酸酶溶液的配制過程是在含有0.15M氯化鈉和l_5mM氯化鎂的無菌的 0.02-0.05M Tris-HCl 緩沖液(pH6.8-8.6)中加入 100-10000u/ml (優選 1000_8000u/ml)的脫氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase),在37°C環境中60_360rpm(優選100-250rpm)轉速下振蕩處理12-72小時。
[0020]所述的洗滌是使用含有抗生素的生理鹽水，或pH值為6.8-8.6的磷酸鹽緩沖液，或PH值為6.8-8.6的D-Hanks溶液，在1°C _25°C條件下對所得的脫細胞基質進行常規清洗，清洗時間為6-48小時。
[0021]本發明脫細胞基質的評價標準及其方法:
[0022]1.殘留細胞:脫細胞基質用10%中性福爾馬林固定,石臘包埋,切成0.4微米厚的薄片，經二甲苯脫蠟、系列酒精脫水，蘇木素一伊紅染色，觀察細胞殘留情況。
[0023]2.基質纖維結構:脫細胞基質用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切成0.4微米厚的薄片，經二甲苯脫臘、系列酒精脫水，Movat Pentachrome染色,觀察基質中膠原纖維、彈力纖維和糖蛋白的分布情況和結構變化情況。
[0024]3.脫細胞基質DNA含量的測定:將組織磨碎，裂解，將裂解后的樣品按PureLinkGenomic DNA Mini Kit 提純 DNA,用 PicoGreenOi) dsDNA Assay Kit 測定，在 545nm 波長處測吸光度，計算DNA含量。
[0025]4.脫細胞基質含水量的測定:將濕態樣品夾在兩層干濾紙中間，濾紙上壓一重50g的物體30s，測得樣品濕重；將樣品真空冷凍干燥24h測得干重。按含水量=(濕重-干重)/干重X 100%計算樣品的含水量。
[0026]5.基質表面細胞殘留:脫細胞基質用2.5%戊二醛溶液固定，乙醇逐級脫水，干燥，真空噴金，掃描電鏡組織表面細胞殘留和纖維排列情況。
[0027]6.膠原蛋白含量測定:脫細胞基質在6M HCl中106°C溶解24h。水解產物用氯胺T溶解20°C處理20min，之后加入含高氯的醛酸中，60°C水浴15min，550nm處測吸收值，測定羥脯氨酸含量，并按膠原蛋白中羥脯氨酸約占12.7%的比例，推算出膠原蛋白含量。
[0028]7.彈性蛋白含量測定:脫細胞基質以0-2mmol/L草酸100°C煮沸60分鐘，離心，取上清液，如此反復抽提3次，合并上清液，彈性蛋白含量(/干重組織)的測定用Fastin彈性蛋白試劑盒測定(Biocolor公司)。
[0029]8.脫細胞基質拉伸強度的測定:將脫細胞基質裁成板材狀，在萬能材料試驗機上將將其拉斷，所測的最大拉力除以試材的截面積，為基質材料的拉伸強度，表示基質的抗拉能力。
[0030]9.脫細胞基質斷裂伸長率的測定:將脫細胞基質裁成板材狀，在萬能材料試驗機上將其拉斷，記錄試樣從被拉斷的長度，除以試樣的長度所得的百分比，即為基質材料的斷裂伸長率，表示材料的變形能力。
[0031]10.脫細胞基質彈性模量的測定:將脫細胞基質裁成板材狀，在萬能材料試驗機上將將其拉斷，得出基質材料的拉伸應力和應變，作應力-應變曲線圖，線性擬合，計算直線的斜率，得出彈性模量，反映材料抵抗彈性變形能力。
[0032]11.脫細胞基質體外細胞毒性實驗:根據GB16886.5-2003和GB/T14233.2_2005_8的方法，采用浸提液和MTT的方法，對材料的細胞毒性進行測試。[0033]本發明采用的吡喃葡萄糖苷由可再生資源天然脂肪醇(脂肪醇為具有8至22個碳原子鏈的脂肪醇，可分為天然脂肪醇和合成脂肪醇。天然脂肪醇以天然的動植物油脂為原料，如來源比較豐富的椰子油、棕櫚油和牛油，水解所得脂肪酸再還原為醇，統稱為天然脂肪醇)和葡萄糖合成，是一種性能較全面的新型非離子表面活性劑，兼具普通非離子和陰離子表面活性劑的特性，具有高表面活性、良好的生態安全性和相溶性，是國際公認的首選“綠色”功能性表面活性劑。具有良好的溶解性、溫和性和脫脂能力，對皮膚刺激小，無毒、而且易漂洗。此外，還具有殺菌消毒、降低刺激等特點。吡喃葡萄糖苷在強堿、強酸和高濃度電解質中性能穩定，腐蝕性小，且易于生物降解不會造成對環境的污染。性能溫和，對細胞外基質的超微結構和功能蛋白幾乎沒有損傷。具有無毒易降解的特點，對人體無害。為進一步增強吡喃葡萄糖苷脫細胞效果，可以聯合物理方法共同處理待用的組織器官。本發明中主要采用物理法中的低滲溶液浸泡，振蕩和調節溫度的方式，增加吡喃葡萄糖苷的脫細胞效果。 [0034]本發明中的吡喃葡萄糖苷、低滲溶液及核酸酶的聯合應用可以高效地去除組織器官中的細胞成分，克服了傳統表面活性劑有毒性、去細胞不充分或損傷細胞外基質成分等缺點，制備的脫細胞基質的免疫原性大幅降低且細胞毒性低，生物相容性好，是一種較好的組織工程支架材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]為了更清楚地描述本發明的技術方案，下面將結合附圖作簡要介紹。顯而易見，這些附圖僅是本申請記載的一些【具體實施方式】。本發明的技術方案包括但不限于這些附圖。
[0036]圖1為含有細胞的新鮮豬心包組織的顯微鏡照片(HEx200)。
[0037]圖2為經脫細胞處理后的豬心包組織的顯微鏡照片(HEx200)。從圖片可以看出，經本發明的脫細胞方法處理后，豬心包組織中的細胞結構消失，能完全去除細胞。
[0038]圖3為新鮮豬心包組織的顯微鏡照片(Mavot pentachrome x400)。
[0039]圖4為經脫細胞處理后的豬心包組織的顯微鏡照片(Mavot pentachrome x400)。從圖片可以看出，經本發明的脫細胞方法處理后，豬心包組織中的膠原纖維排列整齊，無明顯斷裂，仍呈波浪狀平行排列，結構緊湊，彈性纖維結構清晰，組織無明顯水腫。
[0040]圖5為新鮮豬心包組織的電子顯微鏡照片(SOOx)。
[0041]圖6為經脫細胞處理后的豬心包組織的顯微鏡照片(SOOx)。從圖片可以看出，經本發明的脫細胞方法處理后，豬心包組織中的膠原纖維排列整齊，無明顯斷裂，仍呈波浪狀平行排列，結構緊湊連續。
【具體實施方式】
[0042]為了進一步理解本發明，下面將結合實施例對本發明的優選方案進行描述。這些描述只是舉例說明本發明方法的特征和優點，而非限制本發明的保護范圍。
[0043]實施例1
[0044]I)材料制取:豬心包取自當地屠宰廠，健康成年豬宰殺后取出心臟，割取心包膜，熱缺血時間小于2小時。磷酸緩沖液(PBS)反復沖洗去除血凝塊后置于保存液中，帶回實驗室，無菌條件下剔除外周脂肪，取無損傷、厚度均勻的前壁部分修剪為3cmX4cm的小片，PBS溶液充分漂洗，4°C保存含抗生素的無菌的PBS溶液中。
[0045]2)豬心包的去細胞處理:將6片3cmX 4cm的心包分別放入6瓶1% OGP (阿拉丁試劑(上海)有限公司)的IOmM Tris-HCl緩沖溶液中進行振蕩消化24h，4°C，150rpm/min，每瓶溶液含有1%硫酸鏈霉素(阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號:C1208010)和青霉素鈉(阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號:16458)的雙抗溶液。之后在無菌的PBS(pH7.30)進行清洗，15min/次，清洗5次；清洗完后依次將心包放在核酸酶溶液中37°C振蕩消化24h。核酸酶溶液為:2.5KU/ml DNase I (Sigma 公司)、7.5KU/ml RNase (Sigma 公司)、0.15MNaCl、2mM MgCl2(H2O)6 和 1% 雙抗的無菌的 50mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7.60)。
[0046]3)洗滌:在無菌的含雙抗的PBS緩沖液(ρΗ7.30)進行振蕩清洗24h，轉速為150rpm，清洗完后依次將心包在4°C保存含雙抗的無菌的PBS溶液中。 [0047]結果評價:
[0048]1.殘留細胞:脫細胞豬心包經常規蘇木素一伊紅染色，證實無細胞結構存在(參見圖2)。
[0049]2.基質纖維結構:脫細胞豬心包經Movat Pentachrome染色,可觀察到經本發明的脫細胞方法處理后，豬心包組織中的膠原纖維排列整齊，無明顯斷裂，仍呈波浪狀平行排列，結構緊湊，彈性纖維結構清晰(參見圖4和6)。
[0050]3.脫細胞基質DNA含量的測定:經DNA檢測試劑盒測得未脫細胞的豬心包DNA含量是522.063±46.44ng/mg干重組織，經過本發明的脫細胞處理后的DNA含量為
5.642 ± 1.75ng/mg干重組織,統計學分析有顯著差異。
[0051]4.脫細胞基質含水量的測定:新鮮豬心包組織的含水量是79.427 ±0.29%，經脫細胞處理后的豬心包組織的含水量是81.432±0.74%，統計學處理無顯著差異。
[0052]5.基質表面細胞殘留:掃描電鏡觀察未脫細胞的豬心包組織表面有大量的細胞存在，經脫細胞處理后的豬心包組織可看到排列有序的纖維，且無纖維斷裂。
[0053]6.膠原蛋白含量測定:由測得羥脯氨酸換算得未脫細胞的豬心包組織的膠原蛋白含量是46.218±1.27%，經脫細胞處理的豬心包組織的膠原蛋白含量是46.785±0.42%，統計學處理無顯著差異。
[0054]7.彈性蛋白含量測定:由Fastin彈性蛋白試劑盒測定的未脫細胞的豬心包組織的彈性蛋白含量是5.185±0.005 μ g/mg干重組織，經脫細胞處理的豬心包組織的彈性蛋白含量是4.316 ± 0.001 μ g/mg干重組織，統計學處理無顯著差異。
[0055]8.脫細胞基質拉伸強度的測定:在萬能材料試驗機上測得基質材料的拉伸強度，新鮮豬心包的最大拉伸強度為14.362±0.82MPa，經脫細胞處理的豬心包的最大拉伸強度為13.461 ±0.55MPa，統計學處理無顯著差異。
[0056]9.脫細胞基質斷裂伸長率的測定:在萬能材料試驗機上測得基質材料的斷裂伸長率，新鮮豬心包的斷裂伸長率為70.621 ±5.09%，經脫細胞處理的豬心包的斷裂伸長率為79.235 ±2.81%，統計學處理有顯著差異。
[0057]10.脫細胞基質彈性模量的測定:在萬能材料試驗機上測得基質材料的彈性模量，新鮮豬心包的彈性模量為81.335±4.23MPa，經脫細胞處理的豬心包的彈性模量為66.302±6.13MPa，統計學處理無顯著差異，組織經過處理后略微變得柔軟。
[0058]11.脫細胞基質體外細胞毒性實驗:根據浸提液和MTT的方法測得未脫細胞的豬心包組織的相對增值率是102.325±1.77%，細胞毒性級別為O級；經脫細胞處理的豬心包組織的相對增值率是92.167±1.35%，細胞毒性級別為I級，統計學處理無顯著差異。
[0059]實施例2
[0060]按實施例1方法制取豬心包組織后，將6片3cmX 4cm的心包分別放入6瓶2% OGP的IOmM Tris-HCl緩沖溶液中進行振蕩消化16h，4°C，150rpm/min，每瓶溶液含有1%硫酸鏈霉素和青霉素鈉的雙抗溶液。之后在無菌的PBS(pH7.30)進行清洗，15min/次，清洗5次；清洗完后依次將心包放在核酸酶溶液中37°C振蕩消化24h。核酸酶溶液為:2.5KU/mlDNase 1、7.5KU/ml RNase、0.15M NaCl、2mMMgCl2 (H2O)6 和 1%雙抗的無菌的 50mM Tris-HCl緩沖液(PH7.60)。在無菌的含雙抗的PBS緩沖液(pH7.30)進行振蕩清洗24h，轉速為150rpm，清洗完后依次將心包在4°C保存含雙抗的無菌的PBS溶液中。
[0061]實施例3
[0062]按實施例1方法制取豬心包組織后，將6片3cmX 4cm的心包分別放入6瓶1%十二烷基吡喃葡萄糖苷(阿拉丁試劑(上海)有限公司)的IOmM Tris-HCl緩沖溶液中進行振蕩消化24h，4°C，150rpm/min,每瓶溶液含有1%硫酸鏈霉素和青霉素鈉的雙抗溶液。之后在無菌的PBS (pH7.30)進行清洗，15min/次，清洗5次；清洗完后依次將心包放在核酸酶溶液中 37°C振蕩消化 24h。核酸酶溶液為:2.5KU/ml DNase 1、7.5KU/ml RNase、0.15M NaCl,2mM MgCl2 (H2O) 6和1%雙抗的無菌的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.60)。在無菌的含雙抗的PBS緩沖液(ρΗ7.30)進行振蕩清洗24h，轉速為150rpm，清洗完后依次將心包在4°C保存含雙抗的無菌的PBS溶液中。
[0063]實施例4
[0064]按實施例1方法制取豬心包組織后，將6片3cmX 4cm的心包分別放入6瓶1%烷基葡萄糖苷(河北石家莊金莫爾化學品有限公司)的IOmM Tris-HCl緩沖溶液中進行振蕩消化24h，4°C，150rpm/min，每瓶溶液含有1%硫酸鏈霉素和青霉素鈉的雙抗溶液。之后在無菌的PBS (pH7.30)進行清洗，15min/次，清洗5次；清洗完后依次將心包放在核酸酶溶液中 37°C振蕩消化 24h。核酸酶溶液為:2.0KU/ml DNase 1、8.0KU/mlRNase、0.15M NaCl、5mM MgCl2(H2O)6和1%雙抗的無菌的50mMTris_HCl緩沖液(pH7.60)。在無菌的含雙抗的PBS緩沖液(ρΗ7.30)進行振蕩清洗24h，轉速為150rpm，清洗完后依次將心包在4°C保存含雙抗的無菌的PBS溶液中。
[0065]使用可生物降解、無毒無刺激、對環境無污染的辛基-D-吡喃葡萄糖苷進行脫細胞處理，不僅能完全去除細胞而且保持了支架的超微結構和組成成分。
[0066]以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員而言，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明方法進行若干改進和修飾，但這些改進和修飾也落入本發明權利要求請求保護的范圍內。
[0067] 參考文獻
[0068]非專利文獻1.Ecological properties of alkyl glucosides, Chemosphere, 1997，35(3):545-556.[0069]非專利文獻 2.Detergent deceIlularization of heart valves for tissueengineering:toxicological effects of residual detergents on human endothelialcells.Artif Organs, 2010, 34(3):206-210.[0070]非專利文獻 3.Does Sodium Dodecyl Sulfate Wash Out of Detergent-TreatedBovine Pericardium at Cytotoxic Concentrations ? The Journal of Heart ValveDisease, 2009，18:101- 。
【權利要求】
1.一種制備細胞外基質支架材料的脫細胞方法，包括以下步驟: a.對待用組織器官進行預處理； b.將經過預處理的待用組織器官加入到含有吡喃葡萄糖苷的溶液中，通過低滲溶液振蕩處理； c.將步驟b處理后的組織器官加入到含有核酸酶的溶液中；以及 d.洗滌制備的細胞外基質支架材料。
2.權利要求1的方法，其中所述的待用組織器官為異種或同種異體或自體組織器官，選自牛心包、豬心包、心臟瓣膜、皮膚、血管、小腸粘膜下層、神經中的任意一種。
3.權利要求1或2的方法，其中所述的預處理是使用含有抗生素的生理鹽水，或pH值為6.8-8.6的磷酸鹽緩沖液，或pH值為6.8-8.6的D-Hanks溶液，在0_37°C條件下對待用的組織器官進行常規清洗、消毒、分離。
4.前述權利要求任一項的方法，其中所述的批喃葡萄糖苷選自η-辛基-β-D-批喃葡萄糖苷(OGP)、辛基-β -D-硫代吡喃葡萄糖苷、壬基吡喃葡萄糖苷、癸基吡喃葡萄糖苷、十二烷基吡喃葡萄糖苷的任一種或其組合，優選0GP。
5.前述權利要求任一項的方法，其中所述的批喃葡萄糖苷濃度小于70%(w/v),優選0.1-10%(w/v)，更優選0.5 -5%(w/v)，含有吡喃葡萄糖苷的溶液的溫度范圍為1°C _40°C，優選3°C _8°C，含有吡喃葡萄糖苷的溶液的pH值范圍為5-12，優選6.8-8.6，處理時間為30分鐘-96小時，優選6-48小時。
6.前述權利要求任一項的方法，其中所述的低滲溶液振蕩處理是采用無菌的0.01MTris-HCl緩沖液(ρΗ6.8-8.6)，在1°C -40°C (優選3°C -8°C )中振蕩處理30分鐘-96小時，優選6-48小時，振蕩速率為50-360rpm，優選為100_250rpm。
7.前述權利要求任一項的方法，其中所述的核酸酶溶液的配制是在含有0.15M氯化鈉和 l_5mM 氯化鎂的無菌的 0.02-0.05M Tris-HCl 緩沖液(pH6.8-8.6)中加入 100-10000u/ml (優選1000-8000u/ml)的脫氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)，在37°C環境中60-360rpm(優選100_250rpm)轉速下振蕩處理12-72小時。
8.前述權利要求任一項的方法，其中所述的洗滌是使用含有抗生素的生理鹽水，或pH值為6.8-8.6的磷酸鹽緩沖液，或pH值為6.8-8.6的D-Hanks溶液，在1°C _25°C條件下對所得的脫細胞基質進行常規清洗，清洗時間為6-48小時。
【文檔編號】A61L27/36GK103536967SQ201210237911
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月10日 優先權日:2012年7月10日
【發明者】董教明, 李 雨, 陳大凱, 陳葉萌, 王靜, 穆元姍, 房圓, 陳國明, 張曉怡, 樂承筠, 羅七一 申請人:上海微創醫療器械（集團）有限公司