包含彈性蛋白樣多肽、致化學敏感劑和抗癌劑的脂質體及其用途的制作方法

專利名稱：包含彈性蛋白樣多肽、致化學敏感劑和抗癌劑的脂質體及其用途的制作方法
技術領域：
本公開內容涉及包括與含疏水性基團的基元(moieties)偶聯的彈性蛋白樣多肽、致化學敏感劑、和抗癌劑的脂質體，包括這些脂質體的藥物組合物，及使用這些脂質體將致化學敏感劑和抗癌劑遞送到受試者靶部位的方法。
背景技術：
脂質體具有至少一層封閉含水內部區室的脂質膜。脂質體可以根據膜的類型進行鑒別，也可以根據大小進行鑒別。小單層泡囊(small unilamellarvesicle, SUV)有單層膜，直徑通常在20_50nm范圍內。大單層泡囊(largeunilamellar vesicle, LUV)可具有至少50nm的直徑。寡層大泡囊(oligolamellarlarge vesicle)和多層泡囊具有多層、通常為同心的膜，并且可具有至少IOOnm的直徑。具有若干個非同心膜(即，較大泡囊內包含若干個較小泡囊)的脂質體稱作多泡泡囊。脂質體經過配制后能攜帶藥物或其它活性劑，所述藥物或其它活性劑可以包含在含水內部空間中(水溶性活性劑或脂溶性活性劑)或分配到脂質雙層中(脂溶性活性劑)。另外，疏水性材料諸如膽 固醇包含在微團(micelle)中，所述微團可以包含在脂質體內部空間中。在血流中具有短半衰期的活性劑特別適合于經由脂質體遞送。例如，已知許多抗腫瘤劑在血流中具有短的半衰期，并且因此，它們的胃腸外使用是不可行的。然而，脂質體將活性劑經血流遞送至特異性部位的用途因脂質體被網狀內皮系統(RES)的細胞從血液中快速清除而受到重大限制。脂質體在正常情況下是不滲漏的，除非脂質體膜中形成洞，除非膜降解或溶解，或者除非膜溫度升高至相變溫度。受試者中靶部位的溫度升高(過熱)可以將脂質體的溫度提高到相變溫度或更高，并因此可以釋放脂質體內容物。該方法可用于治療劑的選擇性遞送。然而，在脂質體的相變溫度顯著高于正常組織溫度的情況下，此技術是受限的。因此，設計能夠有效遞送活性劑的脂質體配制劑(formulation)是合乎需要的。

發明內容
本發明提供了脂質體，其包括與含疏水性基團的基元偶聯的彈性蛋白樣多肽、致化學敏感劑、和抗癌劑。本發明提供了藥物組合物，其包括脂質體。
本發明提供了用脂質體將致化學敏感劑和抗癌劑遞送到受試者靶部位的方法。


由以下對實施方案的描述，結合附圖，本發明的這些和/或其它方面將變得明晰和更容易理解，其中圖1的圖像顯示，依照一個實施方案，NCI/ADR-RES細胞在有多柔比星存在的條件下培養時的存活力；圖2的圖像顯示，依照一個實施方案，腫瘤細胞中耐藥基因的表達；圖3的圖像顯示，依照一個實施方案，多柔比星從含多柔比星的脂質體中的溫度依賴性釋放譜(profile)；圖4的圖像顯示，依照一個實施方案，在37°C的貯藏溫度時藥物的貯藏時間依賴性釋放； 圖5的圖像顯示，依照一個實施方案，在42°C的貯藏溫度時藥物的貯藏時間依賴性釋放；圖6的圖像顯示，依照一個實施方案，游離多柔比星、以及將多柔比星和維拉帕米一同加載的脂質體在37°C對NCI/ADR-RES細胞的細胞毒性；圖7A和7B的圖像顯示，依照多個實施方案，游離多柔比星(7A)、以及將多柔比星和維拉帕米一同加載的脂質體(7B)在45°C的細胞毒性；及圖8的圖像顯示，依照一個實施方案，藥物的類型對細胞存活力的影響。
具體實施例方式現在會詳細提到各實施方案，附圖中舉例說明了它們的實例，其中同樣的參考號指代全文上下的相同要素。在這點上，當前的實施方案可以具有不同的形式且不應解釋為限于本文中所列的描述。因而，下文僅僅為了解釋本說明書的各方面參照附圖來描述各實施方案。如本文中所使用的，術語“和/或”包括一個或多個所列項的任何和所有組合。根據本發明的一個實施方案,脂質體包括脂質雙層；與疏水性基元(hydrophobicmoiety)偶聯的彈性蛋白樣多肽(ELP);致化學敏感劑；和抗癌劑，其中與疏水性基元偶聯的ELP包裝在脂質雙層中。如本文中所使用的術語“脂質雙層”指由兩層脂質分子構成的膜。脂質層可以具有與天然存在的雙層例如細胞膜、核膜或病毒包膜相似的厚度。例如，脂質雙層的厚度可以是IOnm或更小，例如約Inm至約9nm、約2nm至約8nm、約2nm至約6nm、約2nm至約4nm、或約
2.5nm至約3. 5nm。脂質雙層是將此類分子保持在需要它們的地方并且防止它們擴散到它們不應出現的區域中的屏障。天然脂質雙層通常主要由磷脂構成。磷脂具有親水性頭部和兩個疏水性尾部。當磷脂暴露于水時，它們自我排列成兩層的片層(雙層)，其中它們所有的尾部指向片層中央。此雙層的中央幾乎不含水，而且還排除象糖或鹽這樣的溶于水但不溶于油的分子。具有某些頭部基團的磷脂可以改變所述雙層的表面化學性質。此外，脂質尾部可以影響膜性質，例如通過決定所述雙層的相來影響。所述雙層可以在較低溫度時采取固體凝膠相態，但是在較高溫度時經歷向流體態的相變。在所述雙層內包裝脂質也影響其機械性質，包括其對伸展和彎曲的阻力。生物膜通常包括除磷脂以外的數種脂質。動物細胞中特別重要的例子是膽固醇，其幫助加強所述雙層并降低其通透性(permeability)。用于構建脂質雙層的“脂質分子”可以是具有親水性頭部和疏水性尾部的分子。例如，脂質分子可以具有14至50個碳原子。脂質分子可以是磷脂。磷脂可以具有16至24個碳原子。例如，合適的磷脂可以是磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、及其組合。在一些實施方案中，至少一種磷脂可具有兩個酰基基團。此外，磷脂可以具有約IO0C至約70 V，例如約20 V至約70 V、約30 V至約70 V、約40 V至約70 V、約50°C至約70°C、約 60°C至約 70°C、約 10°C至約 60°C、約 10°C至約 50°C、約 10°C至約 40°C、約 10°C至約39 V、約30 V至約60 V、約30 V至約50 V、約30 V至約40 V、約30 V至約42 V、約30 V至約40 V、約30 °C至約39 V、約35°C至約60 V、約35 °C至約55 V、約35 °C至約50 V、約35°C至約 45°C、約 35°C至約 42°C、約 35°C至約 40°C、約 35°C至約 39°C、約 38°C至約 50°C、約38°C至約45°C、約38°C至約42°C、約38°C至約40°C、或約39°C至約45°C的相變溫度。磷脂的酰基基團可以是飽和的或不飽和的。磷脂可以是兩種或更多種不同磷脂分子的混合物。具有不同相變溫度的脂質雙層可以因兩種或更多種不同磷脂分子的混合而生成。磷脂分子可以具有兩個酰基基團，例如選自如下的酰基基團C12飽和鏈磷脂(Tc=IO0C )、C14飽和鏈磷脂(Tc=24°C )、C16飽和鏈磷脂(Tc=41°C )、C18飽和鏈磷脂(Tc=55°C )、C20飽和鏈磷脂(Tc=65°C )、C22飽和鏈磷脂(Tc=70°C )、及其組合。類似地，可以使用的其它常見的磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂和神經節苷脂，它們象磷脂酰膽堿那樣，具有依賴于酰基鏈長而不同的相變溫度。Tc指相變溫度。C16飽和鏈磷脂可以是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)。DPPC是具有約41. 5°C的雙層轉變溫度的飽和鏈(C16)磷脂。C18飽和鏈磷脂的例子可以是1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)。DSPC是具有約55. 10°C的雙層轉變溫度的飽和鏈(C18)磷脂。可以使用不是磷脂的其它成膜的脂質材料。可以形成固相膜的示例性材料包括勃拉脂質(bola lipid)或細菌脂質。另外，可以采用包括水溶性聚合物(例如，聚乙二醇)和水不溶性聚合物(例如 ，聚環氧丙燒和聚乙基乙烯(polyethylethylene))的嵌段共聚物。如本文中所使用的，脂質體雙層中的“主要脂質(primary lipid) ”是脂質體雙層材料的主要脂質組分。因此，例如，在由70摩爾％磷脂和30摩爾％膽固醇構成的脂質體雙層中，磷脂是主要脂質。脂質雙層可以具有隨溫度而變化的不同相行為。在給定的溫度，脂質雙層可以呈液相或凝膠(固)相。脂質分子都具有從凝膠相轉變到液相的特征性溫度。在這兩種相中，脂質分子被阻止而不能使雙層翻轉(flip-flop)，但是在液相雙層中，給定的脂質將與其相鄰物交換位置。此隨機移步交換(walk exchange)允許脂質擴散，并因此移行跨過膜表面。與液相雙層不同，在凝膠相雙層中脂質的位置是鎖定的。脂質雙層的相行為可以很大程度上由相鄰的脂質分子之間的范德華相互作用的引力的強度決定。有較長尾部的脂質分子具有更多的相互作用面積，提高該相互作用的強度且因此降低脂質分子移動性。因此，在給定的溫度下，短尾部脂質分子將比其它方面相同的(otherwise identical)長尾部脂質分子更具流動性。轉變溫度還可受到脂質分子尾部的不飽和程度的影響。不飽和的雙鍵可以在烷烴鏈中產生結，破壞脂質的包裝。這種破壞在雙層內產生額外的自由空間，其允許相鄰鏈有額外的柔性。大多數天然的膜是不同脂質分子的復雜混合物。如果這些組分中的一些在給定的溫度下是液體，而其它處于凝膠相，則兩個相可以在空間上分開的區域中共存，很像飄浮于海洋中的冰山。如本文中所使用的，術語“相變溫度”或“Tc”指材料從固相變成液相(也稱作熔解溫度)或從液相變成固相的溫度。所述材料包括脂質分子、不含與疏水性基元偶聯的ELP的脂質雙層或脂質體、或含有與疏水性基元偶聯的ELP的脂質雙層或脂質體。脂質膜的相變溫度可以通過差示掃描量熱術(DSC)、電子自旋共振(ESR)等等來測定。差示掃描量熱術可以用Hart Scientific的4207型熱流量熱儀來實施。樣品可以如下制備，掃描速率可以是10° /h。轉變焓可以使用與該儀器一起提供的峰積分軟件來估算。轉變熵可以由轉變焓來估算，依據表達式Λ Ht=Tt Δ St假設一級轉變，其中Λ Ht、Λ St、和Tt分別可以是轉變焓、熵、和轉變溫度。用于差示掃描量熱術的樣品可以通過在DSC樣品安瓿中稱取約3至約8mg所述脂質并添加O. 5ml IOmM HEPES緩沖液、ImM EDTA (pH 7. 4)、有或無IM NaCl來制備。然后可以用螺帽將安瓿密封并放置在量熱儀中。參照安瓿僅僅裝有等體積的緩沖液。可以如下實現液體的水合，在量熱儀中將樣品加熱到解鏈相變溫度以上(至95°C )，溫育20分鐘，然后冷卻至20°C或更低的溫度并再溫育20分鐘。在此水合過程后，可以對樣品進行兩次加熱和冷卻掃描。脂質體包括與疏水性基元偶聯的ELP，其中疏水性基元可包裝在脂質雙層中。疏水性基元通過被包裝在脂質雙層中可構成脂質雙層。疏水性基元可以是具有將與其偶聯的ELP固定于脂質雙層的性質，例如疏水性質的分子。疏水性基元可以與構成脂質雙層的脂質分子相同或不同。疏水性基元可以由僅含有疏 水區的分子提供，或由含有親水區和疏水區兩者的兩親性分子提供。在含有親水區和疏水區兩者的兩親性分子中，疏水區可以朝向脂質雙層內部排列，而親水區可以朝向脂質雙層外部排列并與ELP連接。在這里，“朝向脂質雙層外部”指遠離脂質雙層中心，也就是說，向脂質體內或向脂質體外的方向。疏水性基元可以是天然存在于生物膜中的脂質分子、或不天然存在于生物膜中且構成脂質雙層的脂質分子。天然存在于生物膜中的脂質分子可以選自磷脂或其衍生物、固醇或其衍生物、鞘脂或其衍生物、及它們的組合。磷脂或其衍生物可以選自磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、及其組合。固醇或其衍生物可以是膽固醇或其衍生物、或鯊烯(squalenes)或其衍生物。鞘脂可以是鞘磷脂或其衍生物、或神經節苷脂或其衍生物。磷月旨、固醇、或鞘脂包括在體內合成過程中生成的中間體或前體。例如，疏水性基元包括磷酸甘油酯、鞘氨醇、神經酰胺、或腦苷脂。疏水性基元可以是飽和或不飽和的烴、飽和或不飽和的酰基分子、或飽和或不飽和的燒氧基分子。疏水性基元和ELP的偶聯可以由在生理學和病理學條件下不可切割的連接來介導，或者通過可切割的連接來介導。可切割連接的例子可以是由pH可切割接頭(linker)、熱可切割接頭、輻射可切割接頭、或在水溶液中切割的接頭介導的連接。疏水性基元可以通過與ELP的N端氮原子或ELP的C端羰基(-C (O) _)基團結合而偶聯到ELP。或者，疏水性基元可以通過與選自如下的官能團的相互作用來偶聯到ELP:氨基基團、羰基基團、羥基基團、硫醇基團、或其組合。疏水性基元可以通過與ELP的氮原子形成胺鍵或酰胺鍵、或通過與ELP的C端羰基基團形成酰胺或酯鍵而與ELP偶聯。疏水性基元可以具有4至30個碳原子，例如，14至24個碳原子或16至24個碳原子。例如，疏水性基元可以是肉豆蘧酰基(C14)、棕櫚酰基(C16)、硬脂酰基(C 18)、花生四烯酰基(arachidonyl) (C20)、山箭酰基(behenonyl) (C22)或木臘酰基(Iignoceroyl)(C24)。疏水性基兀可以通過疏水效應而包裝在脂質雙層中，并且因此，與疏水性基兀偶聯的ELP可以固定于脂質體上。如本文中所使用的，術語“彈性蛋白樣多肽(ELP) ”指一類依賴于溫度而經歷構象變化的氨基酸聚合物。在一個實施方案中，ELP可以是呈現出反向相變行為的聚合物。反向相變行為表明，ELP在低于反向轉變溫度(Tt)的水溶液中是可溶的，但是當溫度高于Tt時不可溶。通過升高溫度，ELP從高度可溶的長鏈轉變成溶解度大大降低的緊密折疊的聚集體。這樣的反向相變可以隨溫度升高由具有更多轉角結構和扭曲的結構的ELP結構誘導。在一些情況中，ELP可以基于相變溫度來定義。例如，在一些情況中，相變可以在約10至約70°C的溫度發生。當ELP與脂質雙層的組分連接時，由于ELP隨溫度從低于ELP的Tt的溫度升高到更高的溫度而收縮和自我組裝(self-assembly)，反向相變行為可以破壞脂質雙層。破壞脂質雙層可以提高脂質雙層的通透性。因此，包括脂質雙層的脂質體中所包含的活性劑可以以較高的通透性從脂質體釋放。然而，本發明的一個或多個實施方案不限于任何特定的機制。因ELP反向相變行為所致的對脂質體中脂質雙層的破壞可以依該脂質雙層的脂質分子或該脂質雙層的相變溫度而不同。脂質雙層在相變溫度或之下呈凝膠相，而在相變溫度或之上呈液(晶)相。當脂質雙層呈凝膠相時，雖然ELP結構由于反向相變行為而改變為具有β_轉角結構，但是脂質雙層的破壞可以不發生或者可以是有限的。另一方面，當脂質雙層呈液相時，因為ELP結構由于反向相變行為而改變為具有β-轉角結構，所以可以誘導脂質雙層的破壞。換 言之，當脂質雙層呈液相而不是凝膠相時，反向相變更有效地誘導脂質雙層的破壞。因此，可以通過調節脂質體的脂質雙層的相變溫度或ELP的反向相變溫度來控制包含于脂質體中的活性劑的釋放溫度。例如，包括ELP的脂質雙層或脂質體的相變溫度可以是約10°C至約70°C，例如約39°C至約45°C。與疏水性基元偶聯的ELP可以與疏水性基元的末端而不是側鏈進行偶聯。而且，由于與疏水性基元偶聯的ELP與末端而非側鏈偶聯，因此ELP可以與具有一條鏈的疏水性基元偶聯。例如，疏水性基元可以通過與N端的氮原子或C端的羰基(-C(O)-)基團結合而與ELP偶聯。疏水性基元可以通過與ELP的氮原子形成胺鍵或酰胺鍵或者通過與ELP的C端羰基基團形成酰胺或酯鍵而與ELP偶聯。在這里，疏水性基元可以具有4至30個碳原子，例如，14至24個碳原子或16至24個碳原子。在與疏水性基元偶聯的ELP中，ELP可以與具有一條鏈的疏水性基元偶聯。根據一個或多個實施方案的包括ELP的脂質體可以用于比不包括ELP但僅是脂質雙層的脂質體更有效地釋放脂質體中包含的活性劑。當僅利用脂質雙層的脂質分子的相變時，通過脂質分子的分散來誘導脂質體中的活性劑的釋放。而當使用包括ELP的脂質體時，可以通過ELP的反向相變行為誘導活性劑的進一步釋放，換言之，可以通過因ELP收縮和組裝所致的受損脂質雙層來誘導活性劑的進一步釋放。在這里，活性劑可以包含在脂質體的內部空間中、脂質雙層的內部、或者二者中。在一個實施方案中，部分或整個ELP可以包括一或多個重復單元，該重復單元可以選自 VPGXG (SEQ NO:1) ,PGXGV (SEQ NO: 2) ,GXGVP (SEQN0:3) ,XGVPG (SEQ NO: 4) ,GVPGX (SEQNO: 5)、及其組合，其中V是纈氨酸，P是脯氨酸，G是甘氨酸，且X是除了脯氨酸外的任何天然的或非天然的氨基酸。在這里，各重復單元中的X可以是相同或不同的氨基酸。重復單元可以通過不消除所得ELP的相變性質的一或多個氨基酸而分隔，或者末端部分可以變為一個或多個氨基酸或其它接頭基元。重復單元相對于其它氨基酸或接頭基元的比率可以是，重復單元占重復單元與其它氨基酸之總和的約O.1至約99. 9%。選定的重復單元可以重復兩次或更多次，例如，2至200次。在一個實施方案中，ELP可以本身是嵌段(blocks)，其中一或多個VPGXG、PGXGV,GXGVP、XGVPG、GVPGX或其組合串聯重復，或者ELP可以包括嵌段，其中VPGXG、PGXGV、GXGVP、XGVPG, GVPGX或其組合串聯重復。ELP可包括具有下述式之一的重復單元[VPGXG]n，[PGXGV]n, [GXGVP]n, [XGVPG]n，[GVPGX]n，或兩種或更多種本文所述重復單元的任何組合。與疏水性基元偶聯的ELP可具有式C8-C24脂肪腺_[VPGXG]n，[PGXGV]n，[GXGVP]n，[XGVPG]n，[GVPGX]n，或兩種或更多種本文所述重復單元的任何組合。在式中，η可以是至少I的整數，諸如 I 至 200、2 至 200、2 至 100、2 至 80、2 至 60、2 至 40、2 至 12、2 至 10、2 至 8、2 至 6、4至100、8至80、10至60、12至40、20至40、4至10、4至8、或4至6。例如，與疏水性基元偶聯的ELP可以是硬脂酰-VPGVGVPGVG VPGVG VPGVG VPGVG VPGVG-NH2(SEQ ID Ν0:6，以下稱作 “SA-V6-NH2”)。只要維持反向相變行為，ELP可以由VPGXG、PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX或其組合構成，并且可以在分子中包括另一部分，例如接頭和封閉基團(blocking group)。ELP的N端或C端可以與疏水性基元連接。此外，疏水性基元可以通過與ELP的氨基酸殘基側鏈中的反應性基團連接而與ELP偶聯。反應性基團可以是氨基基團、羥基基團、硫醇基團、或羧基基團。不與疏水性基元連接的另一末端可以是封閉的或未封閉的。例如，當疏水性基元和ELP經由ELP的N端連接時，ELP的C端的羧基基團可以是封閉的或未封閉的。封閉可以通過與材料連接或相互作用來實現，所述材料可以是生物相容的、非免疫原性的、有助于特異性遞送、或者逃避生物學降解系統的材料。例如，封閉可以通過酰胺鍵實現，所述酰胺鍵因結合氨基基團和ELP的C端羧基基團而形成。氨基基團可以是氨分子、伯胺、仲胺、或叔胺。伯、仲或叔胺可以各自具有I至10個碳原子，例如，I至6個碳原子。X可以是纈氨酸或丙氨酸。重復單元可以以一次或多次整數重復次數各自獨立地包括在ELP中。重復次數可以各自獨立地是2至200、2至100、2至80、2至60、2至40、2至10、2至12、2至8、2至6、4至100、8至80、10至60、12至40、20至40、4至10、4至8、或4至6的整數。在脂質體中，脂質雙層的主要脂質分子與疏水性基元偶聯的ELP的摩爾比可以根據所選擇的脂質雙層的性質和與疏水性基元偶聯的ELP的性質適當地選擇。例如，主要脂質分子與疏水性基元偶聯的E LP的摩爾比可以是約50至約99. 9:約O.1至約50。例如，主要脂質分子(DPPC或DPPC和DSPC的混合物)與疏水性基元(棕櫚酰(VPGXG) η或硬脂酰(VPGXG)η，其中η是2至12)偶聯的ELP的摩爾比可以是約50至約99. O:約O.1至約50。
如本文中所使用的，術語“致化學敏感劑”意圖包括使腫瘤細胞對化療的作用更加敏感的藥物。致化學敏感劑可以是賦予耐藥性的蛋白質抑制劑。致化學敏感劑可選自下組多藥耐性蛋白-1(MDRl)抑制劑，MDR-2抑制劑，多藥耐性相關蛋白-1(MRP-1)抑制劑，乳腺癌耐性蛋白(BCRP)抑制劑，及其組合。致化學敏感劑可選自下組環孢菌素(cyclosporin)A,維拉帕米(verapamil),比立考達(bricodar),美卡拉明(reversan),及其組合。致化學敏感劑可具有脂質雙層穩定劑的活性。例如，致化學敏感劑可以是苯乙胺或其衍生物。苯乙胺或其衍生物的例子包括維拉帕米(即(RS)-2-(3，4- 二甲氧基苯基)-5- {[2- (3，4- 二甲氧基苯基)乙基]-(甲基)氨基} -2-丙-2-基戊腈))及其衍生物。或者，脂質體可以包括致化學敏感劑但不包括脂質雙層穩定劑。例如，脂質體可以不包括類固醇或其衍生物(包括膽固醇)。抗癌劑可以是基于蒽環類藥的抗癌劑。基于蒽環類藥的抗癌劑可以是多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、戍柔比星(valrubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、或其組合。致化學敏感劑可以包含在脂質體的內部空間中、脂質雙層的內部空間中、或二者中。另外，致化學敏感劑和抗癌劑可以包含在脂質雙層中，而且它們自身具有穩定脂質雙層的活性且因此可以在有或無脂質雙層穩定劑時包含在其中。脂質體可以具有約39°C至約45°C的相變溫度。脂質體在室溫可以呈凝膠相。脂質體可以進一步包括脂質雙層穩定劑。脂質雙層穩定劑可以是具有比脂質雙層的相變溫度更高的相變溫度的脂質。脂質雙層穩定劑可以選自下組類固醇、鞘脂或其衍生物、及其組合。脂質雙層穩定劑可以是能插入脂質雙層的類固醇、其衍生物、或其組合。如本文中所使用的，術語“類固醇”指一類有留烷核心或由其衍生的骨架的有機化合物，所述核心或骨架含有彼此連接且特定排列的4個環烷烴環，換言之，3個從左到右稱為環A、B和C的環己烷環和I個環 戊烷環(D環)。在這里，“由其衍生的骨架”包括插入留烷骨架中的不飽和鍵。類固醇依據附著至4環核心的官能團、以及這些環的氧化狀態而有不同。例如，類固醇可以在環上包括親水性官能團。例如，類固醇可以在環上具有羥基基團。類固醇可以是固醇。術語“固醇”是一類在C-3位有羥基且有從膽留烷衍生的骨架的類固醇。在這里，術語“衍生的骨架”包括插入膽留烷骨架中的不飽和鍵。類固醇包括植物、動物和真菌中找到的類固醇。例如，所有類固醇可以在細胞中生成，如在動物和真菌中自羊毛固醇生成，或如在植物中自環阿屯醇生成。類固醇包括膽固醇或其衍生物。在這里，“衍生物”意指維持一種需要引入脂質雙層中的性質的膽固醇衍生物。穩定劑可以選自下組膽固醇、谷固醇(sitosterols)、麥角固酉享(ergosterols)、豆固酉享(stigmasterols)、4，22-豆留二烯-3-酮、豆固醇乙酸酯、羊毛固醇、環阿屯醇、及其組合。脂質雙層穩定劑可以以有效量來包含，使得脂質體在37°C穩定維持但在某溫度或更高溫度(例如39°C或更高溫度)遭到破壞。例如，脂質雙層穩定劑可以以有效量來包含，使得脂質體在37°C穩定維持30分鐘或更久，但至少50%的脂質體在39°C或更高溫度時在30分鐘內遭到破壞。主要脂質分子穩定劑(例如膽固醇)的摩爾比可以是約50至約99. 9 :約0.1至約50。主要脂質分子穩定劑的比可以是約50至約99. 9 :約0.1至約50，例如約50至約99. 9 :約I至約50、約50至約99. 9 :約3至約50、約50至約99. 9 :約5至約50、約50至約99. 9 :約7至約50、約50至約99. 9 :約9至約50、約50至約99. 9 :約11至約50、約50至約99. 9 :約15至約50、約50至約99. 9 :約20至約50、約50至約99. 9 :約20至約35、約50至約99. 9 :約20至約30、約50至約99. 9 :約25至約30、約50至約99. 9 :約25至約50、約50至約99. 9 :約30至約50、約50至約99. 9 :約35至約50、約50至約99. 9 :約I至約35、約50至約99. 9 :約3至約30、約50至約99. 9 :約5至約25、約50至約99. 9 :約7至約20、或約50至約99. 9 :約9至約15。脂質體因被肝和脾(內皮系統或網狀內皮系統(RES)的器官)的巨噬細胞快速攝取而在血液循環中具有相對較短的半衰期，因此可能不能在滲漏的腫瘤組織中積累。可以設計脂質體制劑來避免快速的RES攝取，并且因此增加循環時間。術語“滲漏”或“滲漏特性”用在本文中是指，使材料相比于正常組織或細胞而增加通透性的特性。靶位點可以是腫瘤位點，在該位點，腫瘤中血管的材料通透性因腫瘤血管的滲漏而增加。脂質雙層可以含有，例如，用親水性聚合物衍生化(derivatize)的脂質衍生物，例如磷脂衍生物。親水性聚合物可以選自聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、寡糖、及其混合物。所述衍生物可以是與PEG偶聯的C4-C30，例如C16-C24的磷脂。所述衍生物可以是DPPC-PEG或DSPE-PEG。PEG可以具有約180至約50，OOODa的重量平均分子量。脂質體可以是單 層泡囊(SUV)或多泡泡囊。脂質體的直徑可以是約50nm至約500nm,例如約50nm至約400nm、約50nm至約300nm、約50nm至約200nm、約IOOnm至約500nm、約 IOOnm 至約 400nm、約 IOOnm 至約 300nm、或約 IOOnm 至約 200nm。在一個實施方案中，脂質體可以包括磷脂質雙層、與疏水性基元偶聯的ELP、致化學敏感劑、和抗癌劑，其中與疏水性基元偶聯的ELP包裝在磷脂質雙層中。磷脂質雙層包括磷脂作為主要脂質分子。磷脂可以是DPPC、1，2- 二硬脂酰-sn-甘油_3_磷酸膽堿(DSPC)、或其組合。磷脂質雙層可以包括用親水性聚合物衍生化的磷脂脂質衍生物，例如1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)和PEG的偶聯物。DSPE和PEG的偶聯物可以包括1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)。磷脂質雙層可以包括膽固醇。在一個具體實施方案中，脂質體可以包括DPPC、DSPC、或其組合的磷脂質雙層、硬脂酰-VPGVG VPGVG VPGVG-NH2、維拉帕米、和多柔比星，其中硬脂酰-VPGVG VPGVGVPGVG-NH2包裝在磷脂質雙層中。磷脂質雙層中DPPC與DSPC的摩爾比可以是約1:約O至約O. 5，例如約1:約O.1至約O. 5。磷脂質雙層可以包括用親水性聚合物衍生化的磷脂脂質衍生物，例如DSPE和PEG的偶聯物。DSPE和PEG的偶聯物可以包括1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)。磷脂質雙層可以包括膽固醇。脂質體可以具有約10°C至約70°C，例如約10°C至約60°C、約10°C至約55°C、約10°C至約 45°C、約 20°C至約 60°C、約 20°C至約 55°C、約 25°C至約 45°C、約 30°C至約 45°C、約35°C至約45°C、約39°C至約45°C的相變溫度。可以通過主要脂質分子的碳鏈長度、不飽和鍵的數目、多種脂質分子的混合、及它們的組合調節相變溫度。例如，當將具有比DPPC的相變溫度高的相變溫度的DSPC與具有較低相變溫度的DPPC混合時，由DPPC和DSPC混合物構成的脂質體可以具有比僅由DPPC構成的脂質體的相變溫度高的相變溫度。脂質體在室溫下可以處于凝膠相。根據本發明的另一個實施方案，用于將致化學敏感劑和抗癌劑遞送到受試者靶部位的藥物組合物包括脂質體和可藥用載體或稀釋劑，其中所述脂質體包括脂質雙層，與疏水性基元偶聯的ELP，致化學敏感劑，和抗癌劑，且與疏水性基元偶聯的ELP包裝在脂質雙層中。可藥用載體或稀釋劑可以是本領域中公知的。載體或稀釋劑可以選自水，例如鹽水或無菌水，林格氏(Ringer’s)溶液、緩沖鹽水、右旋糖溶液、麥芽右旋糖(maltodextose)溶液、甘油、乙醇、及其組合。已經記載了脂質體的詳細描述。脂質體可以分散于水性介質中。水性介質可以包括生理鹽水或PBS。根據本發明的另一個實施方案，將致化學敏感劑和抗癌劑遞送到受試者靶部位的方法包括對受試者施用脂質體，其中所述脂質體包括脂質雙層、與疏水性基元偶聯的ELP、致化學敏感劑、和抗癌劑，且與疏水性基元偶聯的ELP包裝在脂質雙層中；并加熱受試者的靶部位以從靶部位的脂質體中釋放致化學敏感劑和抗癌劑。所述方法包括對受試者施用脂質體，其中所述脂質體包括脂質雙層、與疏水性基元偶聯的ELP、致化學敏感劑、和抗癌劑，且與疏水性基元偶聯的ELP包裝在脂質雙層中。已經記載了脂質體的詳細描述。給藥可以是胃腸外給藥。例如，胃腸外給藥可以是靜脈內、皮內、肌肉內、(腹腔、關節或眼)腔內，或直接注射。直接注射可以涉及直接注射到患病部位諸如腫瘤部位中。可以靜脈內施用脂質體，并且由此通過血流帶到靶部位諸如腫瘤部位。靶部位可以具有滲漏性質。所述方法包括加熱受試者的靶部位以在靶部位從脂質體中釋放致化學敏感劑和抗癌劑。加熱可歸因于臨床上誘導體溫過高(hyperthermia)的方法,或者可以涉及軀體發炎部位比其它部位固有地更高的溫度。臨床上誘導體溫過高的方法可以通過直接傳熱，例如，盆中的熱液體介質，例如在`水中接觸身體，照射超聲，例如集中對靶部位進行高強度超聲，施加磁場例如放大的磁場，施加微波和/或射頻。靶部位可以是有病理癥狀的區域，例如，腫瘤部位(即，實體瘤)，或有炎癥的區域。加熱可以是加熱至約39°C至約45°C的溫度。根據一個實施方案，脂質體的通透性可以通過與疏水性基元偶聯的ELP依賴于溫度的收縮和自我組裝來調節。因此，可以使用脂質體作為媒介物將致化學敏感劑和抗癌劑有效地遞送到受試者IE部位。本發明還提供了包含致化學敏感劑和抗癌劑的脂質體的制備方法，所述方法包括，將一或多種能形成雙層的脂質、以及一或多種彈性蛋白樣多肽(ELP)組合以便提供脂質體，其中每一種所述ELP與疏水性基元偶聯；且，將致化學敏感劑和抗癌劑與所述脂質體組合以便提供含致化學敏感劑和抗癌劑的脂質體。所述方法中用到的脂質體可以包含脂質雙層，而且，與一或多種ELP偶聯的疏水性基元位于該雙層中。所述一或多種能形成雙層的脂質可包含磷脂。所述方法可包括，將提供在第一溶劑中的一或多種能形成雙層的脂質與第二溶劑中的、每一種都偶聯疏水性基元的、一或多種彈性蛋白樣多肽(ELP)組合；將組合的溶劑蒸發以便提供脂質雙層；用水性溶劑使該脂質雙層水合；將水合的脂質層過濾以便提供脂質體；且，在所述脂質體的內側和外側之間存在PH梯度或硫酸銨梯度的情況下，將致化學敏感劑和抗癌劑與所述脂質體組合。所述水性溶劑可包括水或以水為溶劑的溶液，例如，生理鹽水，PBS, 300mM檸檬酸鹽溶液(pH 4. O)，以及250mM硫酸銨溶液。根據用于將致化學敏感劑和抗癌劑遞送到受試者靶部位的藥物組合物，可以將致化學敏感劑和抗癌劑有效地遞送到受試者靶部位。根據將致化學敏感劑和抗癌劑遞送到受試者靶部位的方法，可以將致化學敏感劑和抗癌劑有效地遞送到受試者靶部位。本發明的一個或多個實施方案現在將對下述實施例進行更充分的描述。然而，提供這些實施例僅僅是出于例示目的，并非意圖限制本發明的范圍。實施例1 :制備脂質體并向其中引入藥物使用下文表I中顯示的成分以及組成比率制備脂質體。〈表1>
權利要求
1.脂質體，其包括 脂質雙層； 與疏水性基元偶聯的彈性蛋白樣多肽(ELP)； 致化學敏感劑；和 抗癌劑， 其中所述疏水性基元包裝在所述脂質雙層中。
2.權利要求1的脂質體，其中所述致化學敏感劑選自下組多藥耐性蛋白-1(MDRl)抑制劑，MDR-2抑制劑，多藥耐性相關蛋白-1 (MRP-1)抑制劑，乳腺癌耐性蛋白(BCRP)抑制劑，及其組合。
3.權利要求1的脂質體，其中所述致化學敏感劑選自下組環孢菌素(cyclosporin)A,維拉帕米(verapamil),比立考達(bricodar),美卡拉明(reversan),及其組合。
4.權利要求1的脂質體，其中所述抗癌劑是基于蒽環類藥的抗癌劑。
5.權利要求1的脂質體，其進一步包括脂質雙層穩定劑。
6.權利要求5的脂質體，其中所述脂質雙層穩定劑包括類固醇或其衍生物。
7.權利要求1的脂質體，其中所述ELP包括一或多個重復單元,該重復單元為VPGXG、PGXGV、GXGVP、XGVPG、GVPGX、或其組合，其中V是纈氨酸，P是脯氨酸，G是甘氨酸，且X是除了脯氨酸外的任何氨基酸。
8.權利要求7的脂質體，其中所述重復單元重復2至200次。
9.用于將致化學敏感劑和抗癌劑遞送到受試者靶部位的藥物組合物，所述藥物組合物包括脂質體和可藥用載體或稀釋劑，其中所述脂質體包括脂質雙層、與疏水性基元偶聯的ELP、致化學敏感劑、和抗癌劑，而且與疏水性基元偶聯的ELP包裝在脂質雙層中。
10.權利要求9的藥物組合物，其中所述致化學敏感劑選自下組MDR1抑制劑，MDR-2抑制劑，MRP-1抑制劑，BCRP抑制劑，及其組合。
11.權利要求9的藥物組合物，其中所述致化學敏感劑選自下組環孢菌素A，維拉帕米，比立考達，美卡拉明，及其組合。
12.權利要求9的藥物組合物，其中所述抗癌劑是基于蒽環類藥的抗癌劑。
13.權利要求9的藥物組合物，進一步包括脂質雙層穩定劑。
14.權利要求13的藥物組合物，其中所述脂質雙層穩定劑包括類固醇或其衍生物。
15.權利要求9的藥物組合物,其中所述ELP包括一或多個重復單元,該重復單元為VPGXG、PGXGV、GXGVP、XGVPG、GVPGX、或其組合，其中V是纈氨酸，P是脯氨酸，G是甘氨酸，且X是除了脯氨酸外的任何氨基酸。
16.權利要求15的藥物組合物，其中所述重復單元重復2至200次。
17.制備包含致化學敏感劑和抗癌劑的脂質體的方法，其包括 將一或多種能形成雙層的脂質、以及一或多種彈性蛋白樣多肽(ELP)組合以便提供脂質體，其中每一種所述ELP與疏水性基元偶聯；且， 將致化學敏感劑和抗癌劑與所述脂質體組合以便提供含致化學敏感劑和抗癌劑的脂質體。
18.權利要求17所述的方法，其包括，將提供在第一溶劑中的一或多種能形成雙層的脂質與第二溶劑中的、每一種都偶聯疏水性基元的、一或多種彈性蛋白樣多肽(ELP)組合；將組合的溶劑蒸發以便提供脂質雙層； 用水性溶劑使該脂質雙層水合； 將水 合的脂質層過濾以便提供脂質體；且， 在所述脂質體的內側和外側之間存在PH梯度或硫酸銨梯度的情況下，將致化學敏感劑和抗癌劑與所述脂質體組合。
全文摘要
包括脂質雙層、與疏水性基元偶聯的彈性蛋白樣多肽(ELP)、致化學敏感劑、和抗癌劑的脂質體，包括該脂質體的藥物組合物，及使用該脂質體將致化學敏感劑和抗癌劑遞送到受試者靶部位的方法。
文檔編號A61P35/00GK103054803SQ20121040132
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者樸宣玟, 金泫伶, 金旻相, 樸在鉆, 蔡洙榮 申請人:三星電子株式會社